一种快速提取高质量DNA的试剂及方法与流程

一种快速提取高质量dna的试剂及方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种快速提取高质量dna的试剂及方法。


背景技术：

2.红曲霉(monascus spp.)，其是广泛应用于东南亚地区的一种传统的食用和药用微生物。由于红曲霉能分泌产生天然色素、莫那可林类(monaeolins)物质、氨基丁酸(gaba)等多种有益的次级代谢产物，被广泛用于食品着色剂、食品发酵剂和保健食品的生产。尤其是近年来天然色素能够代替肉制品工业及腐乳生产中的发色剂，安全性高，由此带来的巨大应用前景，引起科学家们的广泛关注。但是在红曲霉的发酵过程中，一种真菌毒素
‑
桔霉素常常伴随产生，这成为红曲霉产品在食品及其他行业广泛应用的瓶颈之一。迄今为止，有关红曲霉次级代谢途径的分子生物学信息少之甚少，因此通过红曲霉的全基因组测序工程全面了解和研究红曲霉的次级代谢途径及其调控机制是非常必要的。
3.但是由于红曲霉发酵产生色素及其他次级代谢产物，这严重的阻碍了人们从其菌丝体中提取出高浓度、高纯度的基因组dna用于全基因组测序。目前已有许多公开发表的适用于真菌基因组dna的提取方法及专业提取试剂盒，但是利用这些方法提取得到的dna无论从浓度还是纯度方面都无法满足第二代dna测序平台的要求，而且这些传统的提取方法，繁琐复杂、成本较高、提取时间长，因此迫切要求发展简便、快速、高效的基因组dna提取技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种快速提取高质量dna的试剂及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过提取试剂及其步骤的优化，可以从富含色素及多糖的真菌中快速提取高质量基因组dna，该方法在相对较短的时间提取出高浓度、高纯度的基因组dna，技术简便，高效经济。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明一种快速提取高质量dna的试剂，包括：
7.1)提取缓冲液，其包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mm、ph8.0 tris
‑
hcl，20mm、ph8.0乙二胺四乙酸，1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇；
8.2)终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a；
9.3)抽提剂，包括酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述混合液中酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1。
10.本发明还提供一种快速提取高质量dna的方法，包括利用所述的试剂提取真菌中dna的步骤。
11.优选的是，具体包括以下步骤：
12.步骤1：收集真菌菌丝体，并进行预处理后，在液氮环境中研磨成粉末；
13.步骤2：将粉末加入预热的提取缓冲液中，混合均匀，再于65℃水浴保温20
‑
30min，期间每隔5
‑
10min颠倒混匀一次；所述提取缓冲液包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mm、
ph8.0 tris
‑
hcl，20mm、ph8.0乙二胺四乙酸，1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇；
14.步骤3：步骤2反应液冷却至室温后，加入等体积抽提剂进行抽提，混合均匀，之后再离心，弃沉淀取上清液；所述抽提剂为酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合液；
15.步骤4：向步骤3所得上清液中加入终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a，高温消化以去除rna；
16.步骤5：冷却至室温后，向步骤4反应液中加入等体积的所述抽提剂，重新抽提、离心，弃沉淀取上清液；
17.步骤6：向步骤5所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，混合均匀再离心，弃沉淀取上清；
18.步骤7：向步骤6所得上清液中加入预冷的异丙醇，混合均匀，
‑
20℃条件下放置20
‑
30min，沉淀dna；再离心，弃上清液取沉淀；
19.步骤8：用75％乙醇洗涤步骤7所述沉淀2
‑
3次，37℃条件下,干燥20
‑
30min后，加无菌水溶解沉淀，
‑
20℃保存。
20.优选的是，步骤2中所述粉末和提取缓冲液的质量体积比1
‑
3:10。
21.优选的是，步骤3、步骤5、步骤6
‑
7中所述离心条件均为：10000
‑
15000r/min离心10
‑
15min。
22.优选的是，步骤4中所述rna酶消化条件为：65℃水浴30min。
23.优选的是，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿:异戊醇体积比为24:1。
24.优选的是，步骤7中所述预冷的异丙醇加入体积为上清液中的2/3体积。
25.本发明公开了以下技术效果：
26.(1)本发明提供的dna提取方法效率较高，基因组dna的产量高达173.8
±
1.85ng/μl，片段完整，几乎无降解，并且纯度较好，od
260
/od
280
值为1.92
±
0.07，表明无杂蛋白及rna污染，质量高于专业提取试剂盒，完全能够满足全基因组测序等一系列精密的分子生物学实验；
27.(2)本发明提供的dna提取方法，相比市售专业提取试剂盒，成本较低，并且实验过程中的所需试剂均为常规试剂，不需要低温离心等实验条件，一般实验室条件均可满足；
28.(3)本发明还具备操作简便快速，仅需三个小时即可完成全部实验的优势。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为不同方法提取红曲霉基因组dna的电泳效果；其中，1.实施例1的dna提取方法；2.改进氯化苄法；3.蜗牛酶法；4.sds法；5.试剂盒法；m.λdna/hindiii ecori分子量标准。
具体实施方式
31.现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明
的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
32.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
33.将红曲霉按接菌量10％接入麦芽汁培养基(麦芽汁20g/l，蛋白胨1g/l，葡萄糖20g/l)，30℃、170r/min暗培养6d。至发酵终点时将发酵液5000r/min离心10min后除去上清液，菌丝体用灭菌的双蒸水洗涤2遍。
34.将褐腐菌按接菌量8％接入yga培养基中，30℃、180r/min暗培养5d。至发酵终点时将发酵液5000r/min离心10min后除去上清液，菌丝体用灭菌的双蒸水洗涤2遍。
35.实施例1一种从紫色红曲霉中快速提取高质量dna的方法
36.(1)收集紫色红曲霉(福建省南平森发天然色素有限公司惠赠)的菌丝体，用三层纱布过滤培养基并用去离子水冲洗菌丝体，以除去残余的培养基；
37.(2)在研钵中加入液氮，称取(1)中的湿菌丝体3g迅速加入研钵并研磨成粉末状后，把粉末转入预热的含10mlctab提取缓冲液(含有2％ctab(溴化十六烷基三甲基铵)、100mm tris
‑
hcl[ph8.0]、20mm edta(乙二胺四乙酸)[ph8.0]、1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇)的50ml离心管中，使之充分混合均匀，于65℃水浴中保温30min，期间每隔10min将反应液颠倒混匀一次；
[0038]
(3)冷却至室温后，加入等体积(10ml)的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)进行抽提，缓慢颠倒混匀20次；
[0039]
(4)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0040]
(5)向回收的上清液中加入终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a(rnase a)，65℃水浴中保温30min，用于去除rna；
[0041]
(6)冷却至室温后，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)进行抽提，缓慢颠倒混匀20次；
[0042]
(7)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0043]
(8)向回收的上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒混匀20次；
[0044]
(9)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0045]
(10)向回收的上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，
‑
20℃条件下放置20min以沉淀dna；
[0046]
(11)10000r/min条件下室温离心10min后弃上清；
[0047]
(12)用75％乙醇洗涤沉淀2次；
[0048]
(13)37℃条件下热风干燥20min后，加150μl的无菌水溶解沉淀。
‑
20℃保存备用。
[0049]
实施例2一种从褐腐菌中快速提取高质量dna的方法
[0050]
(1)收集褐腐菌(购自宁波明舟生物科技有限公司)的菌丝体，用三层纱布过滤培养基并用去离子水冲洗菌丝体，以除去残余的培养基；
[0051]
(2)在研钵中加入液氮，称取(1)中的湿菌丝体1g迅速加入研钵并研磨成粉末状
后，把粉末转入预热的含10mlctab提取缓冲液(含有2％ctab(溴化十六烷基三甲基铵)、100mm tris
‑
hcl[ph8.0]、20mm edta(乙二胺四乙酸)[ph8.0]、1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇)的50ml离心管中，使之充分混合均匀，于65℃水浴中保温30min，期间每隔10min将反应液颠倒混匀一次；
[0052]
(3)冷却至室温后，加入等体积(10ml)的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)进行抽提，缓慢颠倒混匀20次；
[0053]
(4)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0054]
(5)向回收的上清液中加入终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a(rnase a)，65℃水浴中保温30min，用于去除rna；
[0055]
(6)冷却至室温后，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)进行抽提，缓慢颠倒混匀20次；
[0056]
(7)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0057]
(8)向回收的上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒混匀20次；
[0058]
(9)充分混匀后在10000r/min条件下室温离心10min，将上清转入另一个干净的离心管中；
[0059]
(10)向回收的上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，
‑
20℃条件下放置20min以沉淀dna；
[0060]
(11)10000r/min条件下室温离心10min后弃上清；
[0061]
(12)用75％乙醇洗涤沉淀2次；
[0062]
(13)37℃条件下热风干燥20min后，加150μl的无菌水溶解沉淀。
‑
20℃保存备用。
[0063]
发明人还通过现有技术中其他的常规dna提取方法，与本发明改进的ctab方法进行了对比，具体操作如下。
[0064]
(1)改进氯化苄法：在研钵中加入液氮，将菌丝体3g迅速研磨成粉末状后，加入10ml提取缓冲液(100mm tris
‑
hcl[ph8.0]，125mm edta[ph8.0])，静置2min后加入2ml 10％的sds和6ml氯化苄。涡旋振动后于50℃水浴保温60min，期间每隔10min颠倒混匀1次。冷却至室温后加入6ml 3m naac，冰浴15min。然后10℃下6000r/min离心15min，将上清液转入另一个新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)。然后加入50ul rnase a(10mg/ml)，37℃孵育60min后加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢颠倒混匀20次，10℃下10000r/min离心15min，将上清转入另一个新的50ml离心管中，重复以上抽提步骤两次。在回收的上清液中加入等体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，沉淀dna，然后用75％乙醇洗涤2次，37℃干燥20min后，将沉淀物溶于150μl灭菌水中，
‑
20℃保存备用。
[0065]
(2)蜗牛酶法：在研钵中加入液氮，将菌丝体3g用10ml裂解液(20mg/ml蜗牛酶，0.1m磷酸缓冲液[ph 7.4]，0.25m mgc12)重悬，45℃水浴保温2h。加入10ml提取液(2％triton x
‑
100，1％sds，0.1m nacl，10mm tris
‑
hcl[ph8.0]，1mm edta)后放入
‑
20℃冰箱中10min，再取出放置室温10min，如此反复3次。然后加入15ml 5m kac[ph 8.9]，10000g离心5min，将上清转入新的离心管中，在回收的上清液中加入预冷的乙醇，
‑
20℃放置30min沉淀
dna，然后加100μl灭菌水溶解，保存。纯化dna时加入50ul rnase a(10mg/ml)，37℃孵育30min后加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢颠倒混匀20次，10℃下12000r/min离心5min，将上清转入另一个新的离心管中，重复以上抽提步骤两次。加入99.8％乙醇和ph5.2乙酸钠(3m)后14000g离心20min沉淀dna。然后用70％乙醇洗涤2次，50℃干燥20min后，将沉淀物溶于150μl灭菌水中，
‑
20℃保存备用。
[0066]
(3)sds法：将1g冻干的菌丝体迅速研磨成粉末状后加入15ml提取液(10mm nacl，20mm tris
‑
hcl[ph8.0]，1mm edta，终浓度为1％(v/w)的sds)，50℃水浴保温15min。然后加入等体积tris酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)进行抽提，涡旋振动于65℃水浴保温30min，期间不时混匀，冷却至室温后30s，4000r/min，10℃离心20min，将上清液转入另一个新的50ml离心管中。加入50ul rnase a(10mg/ml)，37℃孵育60min后加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，冰浴5
‑
10min后加入ph 5.2乙酸钠(终浓度为0.3m)和预冷的乙醇以沉淀dna。然后10000r/min，室温离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，50℃干燥后，将沉淀物溶于100μl灭菌水中，
‑
20℃保存备用。
[0067]
(4)试剂盒法：按照所购试剂盒说明书进行提取。取3g冻干菌丝体，加入液氮迅速研磨成粉末状后加入14ml缓冲液fg1，于65℃水浴保温30min，期间不时混匀。冷却至室温后加入2.8ml缓冲液fg2，涡旋振动并冰浴10min。然后10000g，室温离心10min，将上清转入另一个新的离心管中，加入0.7倍的异丙醇以沉淀dna。加入6ml灭菌水(含50μl rnase a)后充分混匀；加入6ml无水乙醇后接着加入3ml缓冲液fg3。然后将混合液转移至dna结合管中，用10ml hb溶液、10ml dna洗脱液及10ml dna洗脱液依次洗脱dna结合管，4000g室温离心20min，干燥后加入150μl灭菌水洗脱，得到dna样品。
[0068]
上述(1)
‑
(4)提取dna的常规方法中，所用样品分别选择和实施例1和实施例2同样的菌丝体，分别做对照试验。
[0069]
实施例3
[0070]
对上述实施例1
‑
2以及常规方法(1)
‑
(4)所提取的dna用1％琼脂糖凝胶上电泳。利用angilent 2100核酸定量分析仪分析不同方法所提红曲霉基因组dna浓度及纯度，其浓度用a
260
值表示，纯度用od
260
/od
280
表示，od
260
/od
280
<1.7，表明样品中蛋白质含量过多；od
260
/od
280
>2.0，表明rna含量过多；od
260
/od
280
在1.8
‑
1.9之间时表示纯度好。
[0071]
以红曲霉菌丝体为样品时，结果如图1所示，除蜗牛酶法外，其余4种方法所提红曲霉基因组dna分子大小基本一致。图1中的第1、2泳道条带较亮；第4、5泳道条带较暗。说明蜗牛酶法不适用于红曲霉基因组dna的提取，改进ctab法和改进氯化苄法明显好于sds法和试剂盒法。但是第2泳道拖尾现象明显，相比之下，改进ctab法所提取的红曲霉基因组dna(第1泳道)的量和完整性最好。
[0072]
如表1所示，不同方法提取红曲霉菌丝体中dna，其最终dna浓度、dna纯度以及提取时长均存在差别。其中，本申请提供的改进ctab法提取的dna浓度可达173.8
±
1.85，纯度可达1.92
±
0.07，并且仅用3h就可以完成提取dna的工作，大大提高提取效率。
[0073]
表1
[0074][0075][0076]
以褐腐菌菌丝体为样品时，得到和以红曲霉菌丝体为样品时相同的结果，本发明提供的改进ctab法自褐腐菌菌丝体中所提取的红曲霉基因组dna的量和完整性最好。
[0077]
如表2所示，不同方法提取褐腐菌菌丝体中dna，其dna浓度、dna纯度以及提取时长均存在差别。其中，本申请提供的改进ctab法提取的dna浓度可达170.1
±
1.80，纯度可达1.91
±
0.03，并且仅用3h就可以完成提取dna的工作，大大提高提取效率。
[0078]
表2
[0079][0080]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种快速提取高质量dna的试剂，其特征在于，包括：1)提取缓冲液，其包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mm、ph8.0 tris
‑
hcl，20mm、ph8.0乙二胺四乙酸，1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇；2)终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a；3)抽提剂，包括酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述混合液中酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1。2.一种快速提取高质量dna的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的试剂提取真菌中dna的步骤。3.如权利要求2所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：收集真菌菌丝体，并进行预处理后，在液氮环境中研磨成粉末；步骤2：将粉末加入预热的提取缓冲液中，混合均匀，再于65℃水浴保温20
‑
30min，期间每隔5
‑
10min颠倒混匀一次；所述提取缓冲液包括：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mm、ph8.0 tris
‑
hcl，20mm、ph8.0乙二胺四乙酸，1.4m nacl和2％β
‑
巯基乙醇；步骤3：步骤2反应液冷却至室温后，将等体积抽提剂进行抽提，混合均匀，之后再离心，弃沉淀取上清液；所述抽提剂为酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合液；步骤4：向步骤3所得上清液中加入终浓度为3.5mg/ml的rna水解酶a，高温消化以去除rna；步骤5：冷却至室温后，向步骤4反应液中加入等体积的所述抽提剂，重新抽提、离心，弃沉淀取上清液；步骤6：向步骤5所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，混合均匀再离心，弃沉淀取上清；步骤7：向步骤6所得上清液中加入预冷的异丙醇，混合均匀，
‑
20℃条件下放置20
‑
30min，沉淀dna；再离心，弃上清液取沉淀；步骤8：用75％乙醇洗涤步骤7所述沉淀2
‑
3次，37℃条件下,干燥20
‑
30min后，加无菌水溶解沉淀，
‑
20℃保存。4.如权利要求3所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，步骤2中所述粉末和提取缓冲液的质量体积比1
‑
3:10。5.如权利要求3所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，步骤3、步骤5、步骤6
‑
7中所述离心条件均为：10000
‑
15000r/min离心10
‑
15min。6.如权利要求3所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，步骤4中所述rna酶消化条件为：65℃水浴30min。7.如权利要求3所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿:异戊醇体积比为24:1。8.如权利要求3所述的快速提取高质量dna的方法，其特征在于，步骤7中所述预冷的异丙醇加入体积为上清液中的2/3体积。
技术总结
本发明公开了一种快速提取高质量DNA的试剂及方法，所述试剂包括：1)提取缓冲液：2％溴化十六烷基三甲基铵，100mM、pH8.0Tris


技术研发人员：杨悦 李大鹏
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2021.03.26
技术公布日：2021/6/29