本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。
背景技术：
颌骨或骨干发育不良(gnathodiaphysiadysplasia，gdd)是一种罕见的常染色体显性遗传病，病变主要累及口腔和长骨。临床表现为颌面部畸形、下颌骨牙骨质/骨发育不良和颌骨骨髓炎等；管状骨侧弯、骨皮质增厚和骨脆性增加等。患者在青少年时期可多次发生无诱因骨折，血中碱性磷酸酶水平增高，牙龈溢脓和拔牙后不易愈合。该病给患者及其家人造成极大的精神痛苦和沉重的经济负担，目前针对gdd仅限于手术和姑息治疗，无特异性的药物干预措施。因此探究gdd发生的分子机制，对于指导其临床治疗具有重要的意义。
ano5(anoctamin5/tmem16e)是gdd的致病基因，其编码蛋白是ano家族成员之一。ano5蛋白具有8个跨膜结构域，以同源二聚体的形式构成通道，可能发挥钙离子激活的cl-通道(calcium-activatedchloridechannels,caccs)或磷脂爬行酶(phospholipidscramblase，plscr)的功能。ano5在成年小鼠的颅盖骨、股骨和下颌骨中高度表达，其杂合突变与gdd的发生密切相关。迄今为止，报道显示至少有10个ano5基因突变可导致gdd。体外研究发现，cys356arg和cys356gly突变可以导致ano5蛋白不稳定，更易于被蛋白酶体降解；thr513ile突变可使细胞发生磷酯酰丝氨酸外翻，从而导致骨骼发生病理性矿化。
利用动物模型对gdd的发病机制进行研究也逐渐被重视。几个针对ano5的不同外显子区域的基因敲除小鼠或者兔子动物模型，主要表现为：①骨骼肌病变表型，如成肌细胞膜融合和修复障碍；②精子活动度减低；③部分gdd骨病变特征。rolvien等首次利用crispr/cas9方法建立ano5基因t491f突变(人类p.ser500phe)小鼠模型，对12和24周龄小鼠进行了影像学和组织学表型鉴定，仅有纯合突变小鼠表现轻微肌肉质量增加的改变，却未表现任何骨骼相关的病理特征。
到目前为止，多数关于ano5基因突变的研究，均只限于体外实验，无法在动物体内模拟发病现场，不能真实再现疾病发生的分子事件。建立动物模型是研究ano5基因突变导致gdd的更佳途径。只有一篇文献报道ano5基因t491f突变小鼠模型，该突变相当于人类p.ser500phe突变，首次是由德国学者rolvien团队报道，患者是一位中国裔13岁男孩，其临床表现为股骨骨折频发，牙齿萌出障碍，颌骨恶性肿瘤样改变。但是该突变模型并未重复出gdd患者相关的骨骼病理性改变。
技术实现要素：
为了解决现有技术的问题，本发明提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法。本发明通过突变小鼠基因组中特定位点，得到一种ano5基因突变小鼠，其呈现与患者临床表现相似的骨骼病变特征，适用于颌骨或骨干发育不良疾病的分子机制的研究。
第一方面，本发明提供一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型构建方法，包括：
将小鼠基因组中ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。
进一步地，基于crispr/cas9方法，通过打靶载体将小鼠基因组中ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。
进一步地，所述打靶载体包括如seqidno:1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述构建方法包括：
构建打靶载体，并转染es细胞；
将sgrna和cas9核酸酶的mrna经体外转录后，和打靶载体阳性的es细胞一起置于小鼠囊胚中。
进一步地，所述sgrna包括如seqidno:1或seqidno:2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述小鼠为野生型小鼠。
第二方面，本发明提供一种打靶载体，所述打靶载体包括如seqidno:1所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供包括所述打靶载体的试剂盒。
本发明进一步提供所述打靶载体或所述试剂盒在构建颌骨或骨干发育不良小鼠模型中的应用。
第三方面，本发明提供一种sgrna，所述sgrna包括如seqidno:2和seqidno:3所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供包含所述sgrna的生物材料。
本发明进一步提供所述sgrna或所述生物材料在构建颌骨或骨干发育不良小鼠模型中的应用。
本发明进一步提供一种用于鉴定上述构建方法构建得到的颌骨或骨干发育不良小鼠模型的引物对，所述引物对包括：
ano5-f1：5’-gcttaggtcttctacatcgggctct-3’(seqidno:4)
ano5-r1：5’-atccccatgaagagcgcaaagaaca-3’(seqidno:5)。
本发明具备如下有益效果：
本发明利用cas9/sgrna和携带有c360y突变位点的打靶载体，将野生型小鼠基因组中ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸，由此制备出与gdd相关的突变小鼠模型。此模型经过测序证实已经携带中国gdd患者的基因突变位点c360y，并且通过影像学、血清学和组织学等方面检测呈现与患者临床表现相似的骨骼病变特征。这表明了，利用此模式动物可以为揭示gdd疾病的分子机制提供有效安全的实验工具。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的构建示意图；其中a为sgrna设计示意图；b为打靶载体示意图；c为突变位点的测序结果。
图2为本发明实施例2提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的表型检测结果。
图3为本发明实施例2提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的血清学检测结果。
图4为本发明实施例2提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的骨组织形态学检测结果。
图5为本发明实施例2提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的胫骨力学性能检测结果。
图6为本发明实施例2提供的ano5基因c360y突变小鼠模型的破骨细胞分化和功能检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1ano5基因c360y突变小鼠模型的构建
设计并筛查cas9/sgrna。根据小鼠ano5基因(genbank：nc_000073.6)第11和12外显子序列，基于crispr-cas9系统在突变位点的两侧内含子上设计sgrna(图1中的a)。所述ano5的sgrna序列如下：
第11外显子上的识别位点：5′-cctgggatgttatctggcttgc-3′
第12外显子上的识别位点：5′-ccagggatgtgtgcacactaggc-3′
构建打靶载体ege-lsq-001。打靶载体示意图如图1中的b所示，其中用于重组突变目标位点(ano5基因第360位)的序列为seqidno:1所示的核苷酸序列。经过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
将打靶载体电转至es细胞，通过正负筛选获得阳性es克隆，并采用pcr和southernblot验证es克隆的正确性。pmsg处理c57/bl6雌性小鼠(3周龄，平均体重15g)，46小时后注射hcg，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射。将上述sgrna(100ng/ml)与cas9核酸酶(50ng/ml)的mrna经体外转录后，和打靶载体阳性的es细胞进行显微注射到80个囊胚中，然后将显微注射后的囊胚回送到4-6只代孕鼠输卵管或子宫中，产出小鼠即为f0代小鼠。
提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体。待f0代雄性founder小鼠7周龄，雌性小鼠4周龄，分别与野生型异性小鼠交配获得杂合子小鼠f1代，小鼠出生后20天进行pcr鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。
测序鉴定f1代小鼠基因型。针对突变位点设计引物序列为：
ano5-f1：5’-gcttaggtcttctacatcgggctct-3’
ano5-r1：5’-atccccatgaagagcgcaaagaaca-3’
测序结果如图1中的c所示。与genebank和ensembl数据库中的序列进行对比，核实突变位点的准确性。
将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子突变小鼠ano5ki/ki，即获得稳定遗传性状的缺陷小鼠模型。
实施例2ano5基因c360y突变小鼠模型的表型
1、小鼠microct检测。
取16周龄的小鼠下颌骨、胫骨和股骨组织，microct分辨率参数为14μm，可见ano5基因c360y突变小鼠下颌骨稍显肥大，股骨和胫骨的骨小梁数目减少，骨皮质骨增厚，胫骨弯曲(图2)。相关的microct参数指标见(表1)。突变小鼠和野生型小鼠相比骨组织骨矿物质含量和骨矿物质密度均增高(表2)。
表1ano5 / 和ano5ki/ki雄性小鼠的μct分析
数据来源于16周龄雄性小鼠的μct检测，以均数±标准差的方式表示*p<0.05,**p<0.01.
表2ano5 / 和ano5ki/ki雄性小鼠的骨矿质量(bmc)和骨矿密度(bmd)分析
数据来源于16周龄雄性小鼠的μct检测，以均数±标准差的方式表示*p<0.05,**p<0.01.
2、小鼠血清学检测。
利用眼球取血的方法采16周龄的小鼠全血，4℃静置1h后3000rpm离心5分钟提取血清。根据试剂盒说明书进行elisa检测，可见ano5基因c360y突变小鼠碱性磷酸酶水平较对照组明显升高，而tracp5b并没有发生改变(图3)。
3、小鼠骨组织形态学检测。
取16周龄的小鼠下颌骨、胫骨及股骨，固定48h后脱钙，脱水，包埋，制备5μm的石蜡切片行he染色和免疫组化实验，长骨的骨皮质增厚和骨小梁减少等特征都与影像学相一致(图4中的a)。另外，在高倍显微镜下观察，ano5基因c360y突变小鼠牙周膜可见血管数目增加，cd31表达明显增多。免疫组化结果显示炎症相关因子il-1和inf-α表达明显增高(图4中的b)。由此可以解释gdd患者口腔相关症状。
4、小鼠胫骨力学性能检测。
取8周龄的小鼠胫骨，利用三点弯曲应力实验，检测其对力的承受能力。发现ano5基因c360y突变小鼠的骨组织弹性模量较野生小鼠减低，说明突变导致骨组织在相同应力作用下更容易发生损伤断裂(图5)。此特点与gdd患者长骨容易骨折特征相符。
5、小鼠破骨细胞分化和功能检测。
取8周龄的小鼠骨髓来源巨噬细胞(bmms)，检测其在破骨细胞分化过程中改变。发现ano5基因c360y突变小鼠成熟破骨细胞形成数目较野生小鼠明显减少(图6中的a)，并且破骨细胞对骨吸收的能力明显减弱(图6中的b)。此特点可以间接解释gdd患者骨硬度增加的表型。
由上述检测结果可以看出，本发明提供的ano5基因c360y突变小鼠模型和gdd患者的骨骼病理性改变相似，适用于gdd疾病机制的研究。
相较于直接敲除ano5基因的小鼠而言，本发明提供的ano5基因c360y突变小鼠模型1)下颌骨表型为下颌骨角增大明显，这与携带突变的中国gdd患者临床表型非常相似。而基因敲除小鼠下颌骨的病变并不突出。2)力学实验结果更容易发生骨折(gdd患者主要表现就是频发无诱因骨折)。而基因敲除小鼠则无此方面的改变。3)破骨细胞实验显示骨吸收功能降低，骨改建过程中成骨和破骨功能的平衡是关键，这个表型有力解释gdd患者骨硬度增加的表型。而基因敲除小鼠无此方面的表现。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>首都医科大学附属北京口腔医院
<120>一种颌骨或骨干发育不良小鼠模型的构建方法
<130>khp211113383.3
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>93
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ctttgcgatgaagtgtgtgattactggagactgaacaccacgtatttgcattcaaaggta60
agtgtgcaatgtgggagggatgaagaccgaaac93
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cctgggatgttatctggcttgc22
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ccagggatgtgtgcacactaggc23
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gcttaggtcttctacatcgggctct25
<210>5
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
atccccatgaagagcgcaaagaaca25
