一种仿生纤维环支架及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种仿生纤维环支架及其制备方法。


背景技术：

2.椎间盘退变是困扰大多数中老年人甚至年轻人的疾病，这种症状常常引起腰背部的疼痛，严重影响正常生活。椎间盘位于人脊柱的两节椎体之间，主要由中央髓核、纤维环和上下软骨终板组成。当纤维环破损时，内部髓核流出压迫神经引起疼痛，椎间盘高度坍塌引起进一步组织退变。因此，椎间盘退变疾病治疗的关键在于纤维环的修复。从结构上看，纤维环为多层(n＝15～25)同心环结构，各层内胶原纤维沿着圆周方向以约30度的角度整齐排列，且相邻片层的纤维排列方向相反交替。从力学性能上看，单片层内纤维在取向排列的基础上呈现一个卷曲的形态，在高机械模量基础上能吸收更多应变，从而对机械载荷进行更好的缓冲；另外同心环片层从内(靠近髓核)到外(远离髓核)具有一种力学性能梯度，外部纤维环比内部纤维环强度更高。
3.目前，对于椎间盘退变的治疗从保守治疗到手术治疗均仅能缓解病患疼痛，无法从根本上恢复椎间盘的生物力学功能，甚至有可能引起进一步的组织退变。近年来，随着医学的发展，组织工程有望成为椎间盘修复的有利手段。椎间盘的生物力学功能与其结构息息相关，纤维环的结构精细，是组织工程上支架构建的重点。
4.现有公开的研究报道中，用于构建组织工程纤维环支架的材料主要包括天然生物材料(如胶原蛋白、丝素蛋白)和高分子合成材料(如聚乳酸、聚己内酯)，这些材料的制备方法包括冷冻干燥技术、3d打印技术或者静电纺丝技术等。例如，yang等研究课题组将pla电纺短纤维冷冻干燥后交联得到一种三维多孔结构的支架，该支架具有高孔隙率的特点；costa等课题组研究人员利用3d打印技术将丝素蛋白/弹性蛋白复合沉积为纤维环的形状，得到孔状纤维环支架。然而类似这样的整体人工椎间盘无法再现纤维环精密的分级结构，某种程度上缺乏各向异性的机械性能。
5.静电纺丝技术是一种简单易行的制备微纳米纤维的技术，可将上述材料制备成匹配天然胶原纤维尺寸的纤维。目前已有很多学者选择该技术进行仿生支架制备。如yang等课题组研究人员将pcl/plga及胶原的混合材料电纺为纤维膜，且由于纤维膜的易加工性，通过层层卷绕的方式模拟了纤维环的复合结构。同时，利用电纺纤维膜层层卷绕的方式使得细胞可以种植在层间，从而解决细胞生长的问题。
6.然而，尽管已有很多利用静电纺丝技术制备人工纤维环的相关报道，这些支架产品仍然没有很好的模拟天然纤维环的结构和性能，主要方面在于：(1)即使取向电纺纤维拥有高模量，但其仍为直纤维形态，无法提供优越的韧性；(2)纤维环支架没有力学的梯度变化，未能模拟天然纤维环从较软髓核到较硬外围纤维环的力学性能过渡。


技术实现要素：

7.基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种仿生纤维环支架的制备
方法。该方法以静电纺丝法及后续诱导获得具有弯曲取向的纳米纤维膜前驱体，其最终制备的仿生纤维环可有效模拟体内纤维环的多级结构及机械梯度性能。
8.为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
9.一种仿生纤维环支架的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将可降解高分子基材通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；
11.(2)将静电纺丝膜固定并浸入有机溶液中，在20～60℃下诱导0.1～24h后，取出并进行冷冻和干燥处理，得到弯曲取向的静电纺丝纤维膜；
12.(3)将弯曲取向的静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
25～35度；
13.(4)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
25～35度。
14.本发明所述仿生纤维环支架的制备方法过程中，以静电纺丝法获得具备三维结构的微纳米纤维膜，随后通过特定参数的溶剂诱导即可使其纤维发生取向度良好的弯曲变形，最后将纤维膜按特定的裁切及卷绕方式，制备得到的仿生纤维环支架产品具备优异的多层交替结构及拉伸应变性能，并且模拟了人体纤维环的机械性能梯度，而层间涂覆的细胞外基质也为产品提高了良好的生物相容性；所述制备方法操作步骤简单，对设备要求较低，可实现工业化规模生产。
15.优选地，步骤(1)所述可降解高分子基材包括plla(左旋聚乳酸)、pcl(聚己内酯)、plcl(聚l
‑
丙交酯
‑
己内酯)或其衍生物中的至少一种。
16.所述高分子基材具有良好的生物降解性和生物相容性，材料无毒性，可很好地运用于组织工程中。
17.优选地，步骤(1)所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为2～3ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为12～18kv，对应接收器的负电压为0.5～1kv，针头与接收器的距离为8～10cm。
18.优选地，步骤(1)所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时的温度为20～25℃，相对湿度为60～70％，时间为1～2h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h以上。
19.所述条件下静电纺丝法制备的纤维尺寸均匀，呈微纳米结构，无粘连现象，得到的纤维膜厚度适中且具有优异的层次三维结构，有利于后续溶剂诱导出取向度良好的弯曲取向纤维膜。
20.优选地，步骤(2)所述有机溶液中的有机溶剂包括乙醇、dmf(n,n
‑
二甲基甲酰胺)、dcm(二氯甲烷)、tfea(2,2,2
‑
三氟乙醇)、hfip(六氟异丙醇)中的至少一种，所述有机溶剂在溶液中的体积浓度为10～100％。
21.所述浓度下的有机溶液可有效诱导静电纺丝纤维膜中的纤维发生统一的弯曲变形，同时避免各纤维发生团聚、缠绕及粘连。
22.优选地，步骤(2)所述诱导的温度为25～60℃，时间为20～120min；
23.更优选地，步骤(2)所述诱导的温度为40～60℃，时间为20～60min。
24.发明人经过多次实验发现，只有在优选条件下才能保障溶剂诱导后各静电纺丝良好统一的弯曲取向。若温度过低或诱导时间过短，纤维弯曲形变小且程度不一；但若温度过
高或诱导时间过长，又会导致纤维的形变过大，导致整体纤维膜变形量过大，不利于后续裁切及卷绕，甚至最终使制备产品的拉伸应变能力削弱。而在优选范围内，通过控制诱导时间和温度，能够实现不同力学性能的控制，实现力学性能梯度设计。
25.在上述溶剂诱导的优选条件下，可根据实际需要制备得到卷曲程度不同的天然弯曲取向的纤维膜，并用于制备对应实际需要的三维仿生支架。
26.优选地，步骤(3)所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度；步骤(4)所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
30度。
27.按照所述角度进行裁切及卷绕所制备的纤维环支架可有效从内层至外出模拟人体原生纤维环的机械性能梯度，使其更好地用于支撑人体受力严重的椎间盘。
28.本发明的另一目的还在于提供所述仿生纤维环支架的制备方法制备得到的仿生纤维环支架。
29.本发明所述仿生纤维环支架解决了现有报道中模拟纤维环无法提供良好拉伸应变性能及缺失天然纤维环机械力学梯度变化的缺陷，可良好地模拟天然纤维环的结构及性能特点，且该产品具有优异的生物降解性和相容性，应用于人体中无毒性或排斥反应。
30.本发明的有益效果在于，本发明提供了一种仿生纤维环支架的制备方法，该方法以静电纺丝法获得具备三维结构的微纳米纤维膜，随后通过特定参数的溶剂诱导即可使其纤维发生取向度良好的弯曲变形，最后将纤维膜按特定的裁切及卷绕方式，制备得到的仿生纤维环支架产品具备优异的多层交替结构及拉伸应变性能，并且模拟了人体纤维环的机械性能梯度，而层间涂覆的细胞外基质也为产品提高了良好的生物相容性；所述制备方法操作步骤简单，对设备要求较低，可实现工业化规模生产。本发明还提供所述仿生纤维环支架的制备方法制备得到的仿生纤维环支架。该产品解决了现有报道中模拟纤维环无法提供良好拉伸应变性能及缺失天然纤维环机械力学梯度变化的缺陷，可良好地模拟天然纤维环的结构及性能特点，且该产品具有优异的生物降解性和相容性。
附图说明
31.图1为本发明所述仿生纤维环支架的制备方法的流程示意图；
32.图2为本发明所述仿生纤维环支架的制备方法中使用固定模具的示意图；
33.图3为本发明所述仿生纤维环支架的制备方法中静电纺丝纤维膜溶剂诱导时固定过程的示意图；
34.图4为本发明所述仿生纤维环支架的扫描电镜(左)及放大(右)图；
35.图5为本发明具体实施例中实施例1所得弯曲取向的静电纺丝纤维膜及对比例1所得静电纺丝纤维膜的扫描电镜对比图(a)及纤维直径分布统计图(b)；
36.图6为本发明所述具体实施例中效果例2中不同溶剂诱导时间(a:对比例1无诱导样品，b：20min，c：60min，d：120min)所得静电纺丝纤维膜的扫描电镜对比图；
37.图7为本发明所述具体实施例中效果例2中不同溶剂诱导时间所得静电纺丝纤维膜的应力应变曲线(左)及拉伸应变趋势(右)图；
38.图8为本发明所述具体实施例中效果例2中不同溶剂诱导温度所得静电纺丝纤维膜的应力应变曲线(左)及拉伸应变趋势(右)图。
具体实施方式
39.为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施所设计的实验试剂及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂及仪器。
40.实施例1
41.本实施例仿生纤维环支架的制备方法，包括以下步骤，所述制备流程如图1所示：
42.(1)将0.8g plla溶于10ml三氟乙醇中制备8％聚合物纺丝前驱体溶液，通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为3ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为12kv，对应的圆盘接收器的负电压为
‑
1kv，所述圆盘接收器的转速为3000r/min，针头与接收器的距离为10cm；温度为25℃，相对湿度为65％，时间为1.5h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h；
43.(2)将静电纺丝膜裁切为1
×
5cm2的长条状，两端各0.5cm固定于夹具上(纤维膜实际诱导面积1
×
4cm2，初始长度l0＝4cm)，夹具固定于模具上，将纤维膜放松至两端长度为初始长度的一半，并浸入无水乙醇中，在25℃下诱导20min后，取出并置入冻干机中固定干燥，得到弯曲取向的静电纺丝纤维膜；所述模具及纤维膜固定示意图如图2和图3所示；
44.(3)将弯曲取向的静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度；
45.(4)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
30度。
46.将本实施例所得仿生纤维环支架置于扫描电镜下进行观察，所得结果如图4所示。从图中可清晰看出，产品中各层纤维膜卷绕情况良好，层间距离均一且层间细胞外基质涂覆情况良好。
47.实施例2
48.本实施例仿生纤维环支架的制备方法，包括以下步骤：
49.(1)将0.8g pcl溶于10ml三氟乙醇中制备8％聚合物纺丝前驱体溶液，通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为2ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为15kv，对应的圆盘接收器的负电压为
‑
1kv，所述圆盘接收器的转速为3000r/min，针头与接收器的距离为8cm；温度为20℃，相对湿度为60％，时间为1h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h；
50.(2)将静电纺丝膜裁切为1
×
5cm2的长条状，两端各0.5cm固定于夹具上(纤维膜实际诱导面积1
×
4cm2，初始长度l0＝4cm)，夹具固定于模具上，将纤维膜放松至两端长度为初始长度的一半，并浸入dmf中，在50℃下诱导30min后，取出并置入冻干机中固定干燥，得到弯曲取向的静电纺丝纤维膜；
51.(3)将弯曲取向的静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度；
52.(4)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞
外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
30度。
53.实施例3
54.本实施例仿生纤维环支架的制备方法，包括以下步骤：
55.(1)将0.8g plcl溶于10ml三氟乙醇中制备8％聚合物纺丝前驱体溶液，通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为2.5ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为18kv，对应的圆盘接收器的负电压为
‑
1kv，所述圆盘接收器的转速为3000r/min，针头与接收器的距离为9cm；温度为20℃，相对湿度为70％，时间为1h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h；
56.(2)将静电纺丝膜裁切为1
×
5cm2的长条状，两端各0.5cm固定于夹具上(纤维膜实际诱导面积1
×
4cm2，初始长度l0＝4cm)，夹具固定于模具上，将纤维膜放松至两端长度为初始长度的一半，并浸入dcm中，在30℃下诱导100min后，取出并置入冻干机中固定干燥，得到弯曲取向的静电纺丝纤维膜；
57.(3)将弯曲取向的静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度；
58.(4)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
30度。
59.实施例4
60.本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2)所述诱导的时间为60min。
61.实施例5
62.本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2)所述诱导的时间为120min。
63.实施例6
64.本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2)所述诱导时的温度为30℃。
65.实施例7
66.本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2)所述诱导时的温度为40℃。
67.实施例8
68.本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2)所述诱导时的温度为60℃。
69.对比例1
70.本对比例仿生纤维环支架的制备方法，包括以下步骤：
71.(1)将0.8g plla溶于10ml三氟乙醇中制备8％聚合物纺丝前驱体溶液，通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为3ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为12kv，对应的圆盘接收器的负电压为
‑
1kv，所述圆盘接收器的转速为3000r/min，针头与接收器的距离为10cm；温度为25℃，相对湿度为65％，时间为1.5h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h；
72.(2)将静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度；
73.(3)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取
向方向呈
±
30度。
74.效果例1
75.为验证溶剂诱导对静电纺丝纤维的弯曲形变影响，将实施例1所得弯曲取向的静电纺丝纤维膜和对比例1所得静电纺丝纤维膜置于扫描电镜下观察，并对纤维直径进行统计，所述结果如图5所示。
76.从图中可以清晰看出，经过有机溶剂诱导后的静电纺丝纤维发生了规律的弯曲形变，虽然一定程度上改变了纤维直径分布，但没有出现明显的尺寸不均或纤维粘连，说明所述条件下纤维弯曲诱导成功。
77.效果例2
78.为验证溶剂诱导时间对制备的仿生纤维环支架的形貌及拉伸应变性能的影响，对实施例1、实施例4、实施例5所得弯曲取向的静电纺丝纤维膜和对比例1所得静电纺丝纤维膜置于扫描电镜下观察，同时将各纤维膜制样为同尺寸小条通过动态热机械分析仪(dma)进行拉伸力学性能测试并绘制应力应变曲线及拉伸应变趋势图，所述结果如图6和图7所示，其中对比例1所述样品命名为control组。
79.从图6可以明显看出，各静电纺丝纤维均保持均匀分散，随着诱导时间变长，相比于对比例1未经过诱导的样品，各样品纤维的弯曲形变程度逐渐增大，但其弯曲取向也开始趋于不均；从图7可以显著看出，相比于对比例1样品，实施例1、4和5所得样品的弹性阶段显著延长，且达到15％压力后仍未出现明显的屈服现象，说明经过溶剂诱导后的纤维膜产品其韧性明显提高，且通过控制诱导时间，能够实现不同力学性能的控制，实现力学性能梯度设计。
80.效果例3
81.为验证溶剂诱导温度对制备的仿生纤维环支架的形貌及拉伸应变性能的影响，对实施例1、实施例6～8所得弯曲取向的静电纺丝纤维膜和对比例1所得静电纺丝纤维膜制样为同尺寸小条通过动态热机械分析仪(dma)进行拉伸力学性能测试并绘制应力应变曲线及拉伸应变趋势图，所述结果如图8所示，其中对比例1所述样品命名为control组。
82.从图8可以显著看出，相比于对比例1样品，实施例1、5～8所得样品的弹性阶段显著延长，且达到15％压力后仍未出现明显的屈服现象，说明经过溶剂诱导后的纤维膜产品其韧性明显提高，且通过控制诱导温度，能够实现不同力学性能的控制，实现力学性能梯度设计。
83.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将可降解高分子基材通过静电纺丝法制备静电纺丝膜；(2)将静电纺丝膜固定并浸入有机溶液中，在20～60℃下诱导0.1～24h后，取出并进行冷冻和干燥处理，得到弯曲取向的静电纺丝纤维膜；(3)将弯曲取向的静电纺丝纤维膜裁切为静电纺丝纤维条带，所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
25～35度；(4)将各静电纺丝纤维条带卷绕成复合层数的同心环状支架，并在层间涂覆细胞外基质，即得所述仿生纤维环支架；所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
25～35度。2.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述可降解高分子基材包括plla、pcl、plcl或其衍生物中的至少一种。3.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时注射泵的速度为2～3ml/h，使用纺丝针头为9g不锈钢针头，对针头施加的正电压为12～18kv，对应接收器的负电压为0.5～1kv，针头与接收器的距离为8～10cm。4.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述静电纺丝法制备静电纺丝膜时的温度为20～25℃，相对湿度为60～70％，时间为1～2h，静电纺丝膜制备完成后置于真空环境下干燥12h以上。5.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶液中的有机溶剂包括乙醇、dmf、dcm、tfea、hfip中的至少一种，所述有机溶剂在溶液中的体积浓度为10～100％。6.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导的温度为25～60℃，时间为20～120min。7.如权利要求6所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导的温度为40～60℃，时间为20～60min。8.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述裁切时条带长轴与纤维膜中的纤维取向呈
±
30度。9.如权利要求1所述的仿生纤维环支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述仿生纤维环支架中相邻层的静电纺丝纤维条带取向方向呈
±
30度。10.如权利要求1～9任一项所述仿生纤维环支架的制备方法制备得到的仿生纤维环支架。
技术总结
本发明公开了一种仿生纤维环支架及其制备方法，属于生物医用材料领域。本发明所述仿生纤维环支架的制备方法以静电纺丝法获得具备三维结构的微纳米纤维膜，随后通过特定参数的溶剂诱导即可使其纤维发生取向度良好的弯曲变形，最后将纤维膜按特定的裁切及卷绕方式，制备得到的仿生纤维环支架产品具备优异的多层交替结构及拉伸应变性能，并且模拟了人体纤维环的机械性能梯度，解决了现有模拟纤维环拉伸应变性能较差及缺失天然纤维环机械力学梯度变化的缺陷，而层间涂覆的细胞外基质也为产品提高了生物相容性；所述制备方法操作步骤简单，对设备要求较低，可实现工业化规模生产。本发明还公开了所述制备方法制备得到的仿生纤维环支架。纤维环支架。


技术研发人员：周晶 罗紫灵 全大萍 白莹 邓荣力 周梓婷 张田伟
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2021.03.03
技术公布日：2021/6/29