吸入用干燥药物组合物的制作方法

吸入用干燥药物组合物
1.本发明涉及包含抗原和两亲免疫刺激剂的吸入用干燥药物组合物，其中所述药物组合物通过喷雾干燥法制备；涉及通过喷雾干燥包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液而获得或能够获得的干燥药物组合物。本发明还涉及所述干燥药物组合物，其用于药物，特别是用于对象的疫苗接种；并且涉及与之相关的方法和试剂盒。
2.针对感染原的疫苗接种通常包括皮下注射或肌肉注射含有适当抗原的溶液剂或混悬剂。所述溶液剂/混悬剂在环境温度条件下(10℃至40℃，取决于季节和特定地理区域)的理化稳定性通常较差，因此疫苗产品需要在温度受控的条件下(所谓“冷链”)储存、运输和分配。这显著增加了疫苗成本，并极大地限制了疫苗在欠发达地区的可用性/适用性，在这些地区，由于缺乏其他/替代预防策略(例如早期细胞学诊断)，通常更需要接种疫苗。与这种成本增加和供应减少有关的另一个担忧是，疫苗在储存/运输过程中可能意外暴露在冷冻或超温条件下，这两种情况都可能严重影响疫苗效力。
3.而且，通过注射施用疫苗可能会很痛苦，患者接受起来通常会胆怯，并可能产生不良的心身效应(所谓“昏厥反应”)，并且必须由专业的医疗人员进行。后一点以及与某些种族/宗教团体有关的胆怯使不发达国家以及发达国家的大规模疫苗接种计划进一步复杂化并受到干扰。
4.作为替代方案，已经提出了通过使用雾化器来施用液体制剂，其中雾化器将液体转变成气雾剂(例如nardelli
‑
haefliger等人(2005),vaccine,23:3634
‑
3641)。这种施用方式特别适用于大剂量活性成分且相当稳定的药物成分的施用。尽管也可以将其用于稳定的粉末，使用前立即在半无菌条件下溶解，但基于气雾剂的施用仍存在多个缺点，极大地限制了其使用和适用性，即它耗费时间、需要电力来源并且雾化剂的很大一部分会散布到环境中。
5.作为另外的选择，提出了使用吸入用干燥制剂，并且已经成为例如在哮喘治疗中施用的标准方法。为了改善干粉制剂的盖仑特性，建议将脂类与例如抗生素或化疗药物结合使用(参见例如wo 2010/003465)。
6.尽管如此，本领域中仍需要提供改进的免疫手段和方法。特别地，仍需要提供至少部分地避免了如上所述的现有技术缺点的手段和方法。
7.具有独立权利要求特征的本发明的主题解决了这一问题。从属权利要求中列出了可以独立或以任意组合实现的优选实施方案。
8.因此，本发明涉及含有抗原和两亲免疫刺激剂的吸入用干燥药物组合物，其中所述药物组合物通过喷雾干燥法制备。
9.如下所述，术语“含有”、“包含”或“包括”均以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的整体中不存在其他特征的情况，也可以指其中具有一个或多于一个其他特征的情况。例如，表述“a含有b”、“a包含b”和“a包括b”都可以指a中没有除了b以外的其他要素的情况(即a唯一地且排他地由b组成)，也可以指实体a中除了b还存在一个或多于一个其他要素的情况，例如要素c，要素c和要素d，甚至其他要素。
10.此外，如下所述，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选特征一起使用，而不限制其他可能性。因此，这些术语所引入的特征是任选的特征，并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。技术人员将认识到，本发明可以通过使用替代特征来执行。类似地，通过“在一个实施方案中”或相似的表述引入的特征是任选特征，对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明的其他任选或非任选特征的组合没有任何限制。
11.在本发明中，如果没有另行说明，术语“标准条件”指iupac标准环境温度和压力(satp)条件，即优选地，温度是25℃且绝对压力是100kpa；并且优选地，标准条件包括ph值是7。此外，如果没有另行指出，术语“约”指在相关领域中具有公认的技术精度的指示值，优选地涉及指示值
±
20％，更优选地
±
10％，最优选地
±
5％。此外，术语“基本上”表示不存在对所指示的结果或用途有影响的偏差，即潜在偏差不会使所指示的结果偏差超过
±
20％，更优选地
±
10％，最优选地
±
5％。因此，“基本上由
……
组成”指包含指定的组分但不包括其他组分，除非是作为杂质存在的材料、由于用于提供组分的方法而存在的不可避免的材料以及为实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用“基本上由
……
组成”定义的组合物包含任何已知可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体以及诸如此类。基本上由一组组分组成的组合物将优选地包含少于5重量％、更优选地少于3重量％、甚至更优选地少于1重量％、最优选地少于0.1重量％的非特定组分。在核酸序列的上下文中，术语“基本相同”表示同一性％值是至少80％、优选至少90％、更优选至少98％、最优选至少99％。可以理解，术语“基本相同”包括100％的同一性。上述规定加以必要的变通适用于术语“基本上互补”。
12.本发明中使用的术语“药物组合物”指至少包含指定化合物的组合物，即至少包含抗原和两亲免疫刺激剂，二者均如本发明其他地方所述，是医药上可接受的形式，且任选地，与至少一种如本发明其他地方所述的医药上可接受的载体组合，特别地与至少一种填充剂组合。所述化合物可以作为医药上可接受的盐提供；所述可接受的盐特别地包括乙酸盐、盐酸盐、硫酸盐、氯盐等。
13.常规施用的合适施用途径是局部施用或全身施用，特别地是口服、静脉注射或非消化道施用以及吸入。本发明所述的药物组合物是吸入用药物组合物。因此，该药物组合物适合通过吸入施用。优选地，所述吸入用药物组合物通过吸入施用。本发明中，术语“吸入”是指将空气或其他气体载体吸入对象体内，所述空气或气体载体中包含本发明所述的药物组合物。因此，优选地，吸入导致对象的至少部分呼吸系统与药物组合物接触。如技术人员所理解的，吸入可以是通过嘴吸入和/或通过鼻子吸入。因此，优选地，吸入包括将对象的口腔、鼻腔、咽、气管和肺中的至少一个与药物组合物接触。因此，更优选地，吸入导致口腔、鼻腔、咽、气管和/或肺的上皮细胞与药物组合物接触。因此，优选地，药物组合物被局部地施用于上述身体部位。
14.所述药物组合物为干燥药物组合物；因此，优选地，所述药物组合物是粉末，优选地是干燥粉末；更优选地，所述药物组合物的含水量最高是5％，优选地是最高2％，最优选最高1％。优选地，所述干燥药物组合物包含体积中径最高10μm、更优选最高7.5μm、最优选最高5μm的颗粒。还优选地，所述干燥药物组合物包含体积中径0.5μm至10μm、优选1μm至7.5
μm、更优选1.5μm至5μm的颗粒。
15.所述药物组合物是通过喷雾干燥法制备的，即是通过包括喷雾干燥步骤的方法制备的。术语“喷雾干燥”原则上是技术人员已知的。本发明使用的该术语优选地涉及包括在高温下将包含指定化合物的溶液喷雾到气态干燥剂流如热空气流中的工艺步骤。干燥步骤的优选实施方案在本发明其他部分有详细说明，特别地是在制备干燥药物组合物的方法的上下文中和在实施例中。因此，所述药物组合物优选地是通过对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液喷雾干燥获得或能够获得的，优选地根据如下面所述的根据本发明的用于制备干燥药物组合物的方法。此外，所述药物组合物还可以包含其他载体、佐剂或无毒的、非治疗性、非免疫原性的稳定剂以及诸如此类。
16.优选地，在干燥药物组合物中包含的抗原比例是0.1％(重量/重量)至10％(重量/重量)，优选0.2％(重量/重量)至5％(重量/重量)，更优选0.3％(重量/重量)至2.5％(重量/重量)，最优选约2％(重量/重量)。还优选地，在干燥药物组合物中包含的两亲免疫刺激剂比例是0.05％(重量/重量)至10％(重量/重量)，优选0.1％(重量/重量)至5％(重量/重量)，更优选0.15％(重量/重量)至2％(重量/重量)，最优选约0.2％(重量/重量)。还优选地，填充剂:抗原的比例是1000:1(重量/重量)至10:1(重量/重量)，优选500:1(重量/重量)至25:1(重量/重量)，更优选300:1(重量/重量)至30:1(重量/重量)，甚至更优选约49:1(重量/重量)，最优选49(重量/重量)。优选地，两亲免疫刺激剂至少部分地覆盖干燥药物组合物中的抗原。优选地，干燥药物组合物包含由核心部分和包衣部分组成的颗粒，其中所述核心部分包含抗原的绝大部分和任选的填充剂，其中所述包衣部分包含两亲免疫刺激剂的绝大部分。如技术人员应当理解的，本发明使用的术语“包含大部分”涉及在事实是干燥药物组合物颗粒的一部分，优选地是子结构，包含所指示化合物总量的主要部分。因此，优选地，干燥药物组合物包含由核心部分和包衣部分组成的颗粒，其中核心部分包含在所述颗粒中包含的抗原总量的至少75％、优选至少85％、更优选至少90％，和任选地至少一种填充剂；并且其中包衣部分包含在所述颗粒中包含的两亲免疫刺激剂总量的至少75％、优选至少85％、更优选至少90％。因此，优选地，干燥药物组合物包含基本上由抗原和如果存在的填充剂组成的颗粒，被两亲免疫刺激剂包衣。此外，所述药物组合物可以包含普通药物组合物中的其他药物；而且，所述药物组合物可以与其他药物组合物结合使用，所述其他药物组合物可以以分部分的试剂盒的形式提供。
17.治疗有效剂量是指将用于预防、改善或治疗本发明所述情况的一剂药物组合物中的化合物的量。化合物的治疗效果和毒性可以通过细胞培养或实验动物的标准制药程序确定，例如通过测定ed
50
(在50％群体中治疗有效的剂量)和/或ld
50
(在50％群体中致死的剂量)。治疗效果和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，它可以用ld
50
/ed
50
的比值表示。剂量方案将由主治医生决定，优选地考虑到相关的临床因素，以及优选地，与本发明其他部分所描述的任一种方法一致。在医学界众所周知，任何一个患者的剂量可以取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、时间和施用途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监控进展情况。例如，典型的剂量可以是1μg至10000μg；然而，特别是考虑到上述因素，预期剂量低于或高于这一示例范围。一般地，该方案包括初次免疫施用1μg至10mg的抗原，然后一次或多于一次施用相同的抗原加强免疫，优选地以相同的剂量施用。然而，根据对象和施用方式，施用剂量可以有很大的不同，优
选地，从每kg体重0.01mg到每kg体重约1mg不等。为了治疗或预防本说明书中所述的疾病或状况，此处提及的药物组合物和配方至少施用一次。然而，所述药物组合物可以施用超过一次，例如，优选地是一次至四次，更优选地是两次或者三次。
18.优选地，药物组合物还包含至少一种医药上可接受的载体(赋形剂)，特别是填充剂。应该认识到，医药上可接受的载体或稀释剂的形式和特性取决于与之结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量。从与配方中的其他成分兼容且对其接受者无害的意义上来说，所述载体必须是可接受的。例如，使用的药物载体可以是固体、凝胶或液体。典型的固体载体是糖、糖醇、白土、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、金合欢胶、硬脂酸镁、硬脂酸以及诸如此类。类似地，载体和稀释剂可以包含本领域众所周知的时间延迟材料，例如单独使用或与蜡一起使用的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。更优选地，所述赋形剂包含至少一种填充剂，优选地是至少一种填充剂。本发明使用的术语“填充剂”指包含在药物组合物中的医药上可接受的赋形剂，用来增加产品的总质量，特别是增加药物组合物中颗粒的质量和/或尺寸。因此，优选的填充剂是药学惰性化合物，优选不吸湿的，还优选结晶良好的。因此，优选的填充剂化合物是药学惰性的糖或糖醇化合物，优选地选自甘露醇、乳糖和海藻糖。优选地，填充剂包含甘露醇，优选地是甘露醇。
19.术语“抗原”被本领域技术人员理解为能够优选在适当的条件下在对象中诱导免疫应答的任何化学化合物或其混合物。优选地，抗原是生物聚合物，更优选地是生物大分子，依然更优选地是分子量是至少1000da的生物大分子，更优选地是分子量是至少5000da的生物大分子，最优选地是多肽。优选地，抗原包含硫氧还蛋白或其片段，更优选地包含适温生物的硫氧还蛋白或其片段，其中适温生物优选是嗜热古菌，更优选是激烈火球菌(pyrococcus furiosus)。依然更优选地，抗原包含硫氧还蛋白，更优选地包含适温生物的硫氧还蛋白，其中适温生物优选是嗜热古菌，更优选是激烈火球菌。优选地，上述硫氧还蛋白具有支架功能，即作为为至少一个抗原表位提供稳定框架的化合物，术语“抗原表位”指生物大分子、优选多肽的结构，在对象体内呈递给免疫系统，优选地通过主要组织相容性分子(mhc)和/或作为抗体的结合位点。因此，优选地，抗原表位是多肽的抗原片段，即抗原肽。优选地，抗原表位是乳头状瘤病毒的抗原表位，优选地包含至少一个肽，所述肽含有与hpv16 l2多肽的20位至38位氨基酸一致的氨基酸序列，更优选地包含至少三个肽，所述肽含有与hpv16 l2多肽的20位至38位氨基酸一致的氨基酸序列，依然更优选地包含至少三个肽，所述肽含有hpv16 l2多肽的20位至38位氨基酸序列，最优选地包含至少三个肽，所述肽由hpv16 l2多肽的20位至38位氨基酸序列组成。因此，优选的抗原是如wo 2010/070052和wo 2017/211886记载的免疫原性多肽。优选地，抗原是热稳定的，更优选地是热稳定抗原，其中术语“热稳定”指化合物在ph＝7的水溶液中，在50℃、更优选60℃、甚至更优选70℃孵育至少20分钟后，基本上保持其化学性质、更优选其免疫原性的性质。如果抗原是多肽，也可以优选地通过测定所述多肽溶液在乙醇存在下的圆二色性确定其热稳定性；在本发明中，与相同多肽在相同水溶液中无乙醇的情况进行比较，如果在含有至多20％乙醇、优选地至多30％乙醇、更优选地至多50％乙醇的水溶液中，在200nm至260nm范围内在标准条件下测定的圆二色性基本不变，则优选地认为该多肽是热稳定的。
20.本发明使用的术语“免疫刺激剂”指在增强对象的免疫反应的强度而优选地本身不是免疫原性的化合物。因此，优选地，所述免疫刺激剂是原则上技术人员已知的免疫佐
剂。优选地，免疫刺激剂是toll样受体(tlr)的激动剂，优选地是tlr4的激动剂。本发明中涉及的免疫刺激剂是“两亲免疫刺激剂”；因此，所述免疫刺激剂具有亲脂性和亲水性。还优选地，所述两亲免疫刺激剂具有含有亲水端和亲脂端的整体延伸结构。优选地，两亲免疫刺激剂在空气
‑
水界面上形成有序的单分子阵列或单分子层。还优选地，两亲免疫刺激剂在水溶液中浓度增加时形成胶束；因此，优选地，两亲免疫刺激剂具有临界胶束浓度(cmc)；更优选地，两亲免疫刺激剂的cmc值最高是1mm，优选地最高100μm，更优选地最高10μm。优选地，两亲免疫刺激剂是力控制剂，更优选地，两亲免疫刺激剂是表面活性剂。优选地，两亲免疫刺激剂选自单磷酰基脂质a、合成脂质a、脂质a类似物、脂质a模拟物、细胞因子、皂苷、革兰氏阴性细菌的脂多糖(lps)和内毒素。更优选地，两亲免疫刺激剂是单磷酰基脂质a(cas no：143110
‑
73
‑
0)。
21.有利地，在本发明的基础工作中发现，本发明的干燥药物组合物允许高效、非侵入免疫。同时，两亲免疫刺激剂作为增强免疫反应的生物活性成分，也作为工艺赋形剂，以提高粉末的流动性、雾化性能和呼吸性，同时增强抗原稳定性，降低对环境湿度的敏感性。此外，发现干燥药物组合物即使在环境温度下也是稳定的，因此，特别适合在不能保证疫苗冷藏的地区使用。
22.以上定义作必要修改后适用于下列各项。下面进一步的定义和说明加以必要的变通适用于本说明书中描述的所有实施方案。
23.本发明还涉及根据本发明的干燥药物混合物，其用于药物；本发明还涉及根据本发明的干燥药物混合物，其用于治疗和/或预防对象的感染，优选地用于对象的疫苗接种。
24.术语“治疗”指在很大程度上减轻本发明所指的疾病或病症或其伴随症状。本发明使用的所述治疗还包括使本发明所指的疾病或病症的健康情况完全康复。应当理解，本发明使用的术语治疗可以不对所有需要治疗的对象都有效。然而，优选地，该术语应需要统计学上显著部分的患有本发明所指疾病或病症的对象能够被成功治疗。某部分是否是统计学显著的可以由技术人员使用各种公知的统计评估工具轻易地确定，例如置信区间确定、p值检验、学生t检验、曼
‑
惠特尼检验等。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选地是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，治疗应当对给定组群或人群的至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的对象有效。
25.术语“预防”指使对象在一定时间段内保持对本发明所指的疾病或病症的健康。应当理解，所述的时间段可以取决于药物化合物的施用量和对象的个体因素。应当理解，所述预防可以不对所有使用根据本发明的化合物治疗的对象有效。然而，优选地，该术语应需要统计学上显著部分的组群或人群的对象有效预防了本发明所述的疾病或病症或其伴随症状。优选地，在这种情况下设想对象组群或人群通常，即没有采取根据本发明的预防措施，会患上本发明提到的疾病或病症。某部分是否是统计学显著的可以由技术人员使用各种公知的、在本说明书其他部分讨论的统计评估工具轻易地确定。
26.术语“接种疫苗”原则上是技术人员已知的，涉及向对象施用至少一种抗原结构，特别是至少一种表位，以调节对包含所述抗原结构的化合物的免疫反应。优选地，所述调节是抑制免疫反应；更优选地，所述调节是激活免疫反应。技术人员应当理解，疫苗接种可以不在所有接种疫苗的对象中引起显著的免疫应答。同时，应当理解，疫苗接种可以不使所有
接种疫苗的对象有效地预防感染。然而，该术语应需要部分的组群或人群的对象有效地接种疫苗，其中所述部分优选地是统计学上显著的部分。如果感染源是hpv，优选地，有效的疫苗接种是指预防或减少hpv引发的病变的数量，例如疣的数量。
27.优选地，疫苗接种是治疗性疫苗接种，即疫苗接种用于治疗需要对象体内存在抗原结构的疾病或病症。优选地，治疗性疫苗接种诱导对用于疫苗接种例如过敏性疾病或自身免疫性疾病的抗原结构产生耐受性，优选地产生外周耐受；诱导耐受性的方法是本领域已知的，特别地包括重复施用(自身)抗原、抑制t细胞的cd28信号传导和刺激调节t细胞。更优选地，治疗性疫苗接种激发或刺激免疫，即对于用于疫苗接种的抗原结构的防御反应，其中所述疫苗接种例如是癌症或已存在的持续性感染的疫苗接种，例如是潜在的病毒感染的疫苗接种。因此，优选的抗原结构来自肿瘤抗原、肿瘤特异性抗原和/或在持续感染过程中由感染原表达的基因，例如病毒的潜伏基因。
28.更优选地，疫苗接种是预防性疫苗接种，即疫苗接种用于预防需要对象体内存在用于疫苗接种的抗原结构的疾病或病症。因此，优选地，如果是感染原引发的疾病，上述预防措施可以是预防性疫苗接种。因此，优选地，所述术语预防指施用本发明所述化合物以引发针对至少一种感染原的免疫反应。因此，优选地，疫苗接种刺激免疫系统并建立或提高对感染原感染的免疫力。优选地，根据本发明的疫苗接种允许建立或提高对感染原感染的免疫力，其中感染原优选地是人乳头状瘤病毒基因型。应当理解，根据本发明的疫苗可以包含其他组分，特别是本发明其他部分所述的组分。
29.本发明使用的术语“感染源”指病原体，优选为微生物，能在对象中引起传染性疾病。优选地，感染源是细菌、真核感染性病原体如疟原虫或者病毒，更优选地是病毒，例如乳头状瘤病毒、肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒(hiv)。更优选地，感染源是肿瘤病毒，更优选地是乳头状瘤病毒、eb病毒、肝炎病毒、人类嗜t淋巴球病毒1型、人类疱疹病毒8型，更优选地是乳头状瘤病毒(pv)，最优选地是人乳头状瘤病毒(hpv)。优选地，感染源是引起慢性疾病的病原体。更优选地，感染源是引起慢性和/或持续性感染的病原体。
30.本发明使用的术语“对象”指动物，优选地是脊椎动物，更优选地是哺乳动物，特别是牛、马、猪、绵羊和山羊等家畜，或大鼠、小鼠和豚鼠等试验动物。最优选地，对象是人类。
31.本发明还涉及用于生产干燥药物组合物的方法，其包括对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液进行喷雾干燥。
32.本发明的方法是离体法。此外，除上述明确所述外，其还可以包括其他步骤。例如，其他步骤例如可以涉及提供用于喷雾干燥的包含所述化合物的溶液，和/或与所述喷雾干燥产物有关的进一步制造步骤。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动设备执行。优选地，所述方法还包含将两亲免疫刺激剂混合到包含所述抗原和任选地所述填充剂的溶液中。并且优选地，上述溶液还包含乙醇/水混合物作为溶剂。优选地，所述溶剂包含10％(体积/体积)至50％(体积/体积)、更优选地20％(体积/体积)至40％(体积/体积)、甚至更优选地约30％(体积/体积)、最优选地30％(体积/体积)的乙醇水溶液。因此，优选地，所述溶剂中乙醇/水比例是2:1(体积/体积)至10:1(体积/体积)，优选地是5:1(体积/体积)至9:1(体积/体积)，更优选地是6:1(体积/体积)至8:1(体积/体积)，最优选地是约70％(体积/体积)。
33.优选地，包含抗原和两亲免疫刺激剂的溶液中含有抗原的浓度是0.01mg/ml至
1mg/ml，优选0.025mg/ml至0.75mg/ml，更优选0.05mg/ml至0.5mg/ml，甚至更优选0.075mg/ml至0.25mg/ml，仍然更优选约0.1mg/ml，最优选0.1mg/ml。还优选地，包含抗原和两亲免疫刺激剂的溶液中含有两亲免疫刺激剂的浓度是0.1μg/ml至1mg/ml，优选地是1μg/ml至500μg/ml，更优选地是10μg/ml至250μg/ml，仍然更优选地是约15μg/ml，最优选地是10.4μg/ml。还优选地，在还包含抗原和两亲免疫刺激剂的溶液中，填充剂的浓度、优选甘露醇的浓度是0.1mg/ml至3mg/ml，优选0.25mg/ml至1.5mg/ml，更优选0.4mg/ml至1mg/ml，甚至更优选0.5mg/ml至0.75mg/ml，仍然更优选约0.6mg/ml，最优选0.59mg/ml。
34.本发明所述的术语“喷雾干燥”是技术人员已知的并优选涉及包括在高温下将包含指定化合物的溶液喷雾到气态干燥剂流如热空气流中的工艺步骤。优选地，喷雾干燥包括将干燥气流、优选地干燥空气流加热到80℃至150℃、优选100℃至140℃、最优选约125℃的温度。优选地，气流量是100l/h至1000l/h、更优选250l/h至750l/h、仍然更优选500l/h至700l/h、最优选约600l/h，优选地其吸气量是10m3/h至100m3/h、更优选15m3/h至65m3/h、仍然更优选25m3/h至50m3/h、最优选约37m3/h。优选地，干燥药物组合物的粒径分布是dv10 1.43 /
‑
0.09μm；dv50 2.65 /
‑
0.17μm；和/或dv90 4.78 /
‑
0.55μm。
35.本发明还涉及在外壳内包含根据本发明的干燥药物组合物的试剂盒。
36.本发明使用的术语“试剂盒”是指可以包装或可以不包装在一起的上述化合物、手段或试剂的集合。优选地，所述试剂盒用于实践本发明前面所述的药物组合物的医学用途。优选地，设想以随时可用的方式提供所有的组件以实践上述用途。此外，优选地，试剂盒中包含实施所述用途的说明书。说明书可以由纸质或电子形式的用户手册提供。另外，该手册可包含使用本发明的试剂盒实践上述用途的施用说明书和/或剂量说明书。优选地，试剂盒的外壳包含分配装置；因此，优选地，外壳是吸入器，优选的是自动吸入器。优选地，试剂盒包含其他组件，例如吸入辅助器和/或适配器。在这种情况下，试剂盒的组件可以包含单独的外壳(即作为试剂盒的单独零件)，或者在一个外壳中提供。
37.本发明还涉及根据本发明的干燥药物组合物，其用于药物制备，优选地用于疫苗制备。
38.本发明还涉及治疗和/或预防对象感染的方法，其包括使所述对象与根据本发明的任一种干燥药物组合物接触，从而治疗和/或预防感染。
39.本发明的治疗和/或预防感染的方法是体内方法。此外，除上述明确所述外，其还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及例如在步骤a)之前诊断感染或感染风险，和/或提供治疗、预防感染和/或其一种并发症的额外治疗方法。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动设备执行。
40.鉴于上述情况，优选以下实施方案：
41.1.一种含有抗原和两亲免疫刺激剂的吸入用干燥药物组合物，其中所述药物组合物是通过喷雾干燥法制备的。
42.2.根据权利要求1所述的干燥药物组合物，其还包含至少一种填充剂。
43.3.根据权利要求2所述的干燥药物组合物，其中所述填充剂是糖或糖醇，优选选自甘露醇、乳糖和海藻糖，更优选是甘露醇。
44.4.根据权利要求1至3中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述干燥药物组合物包含由核心部分和包衣部分组成的颗粒，其中核心部分包含在所述颗粒中包含的抗原总量
的至少75％、优选至少85％、更优选至少90％，和任选地至少一种填充剂；其中包衣部分包含在所述颗粒中包含的两亲免疫刺激物总量的至少75％、优选至少85％、更优选至少90％。
45.5.根据权利要求1至4中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述干燥药物组合物包含体积中径最高10μm、更优选最高7.5μm、最优选最高5μm的颗粒。
46.6.根据权利要求1至5中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述干燥药物组合物包含体积中径0.5μm至10μm、优选1μm至7.5μm、更优选1.5μm至5μm的颗粒。
47.7.根据权利要求1至6中任一项所述的干燥药物组合物，其中在所述干燥药物组合物中包含的所述抗原的比例是0.1％(重量/重量)至10％(重量/重量)，优选0.2％(重量/重量)至5％(重量/重量)，更优选0.3％(重量/重量)至2.5％(重量/重量)，最优选约2％(重量/重量)。
48.8.根据权利要求1至7中任一项所述的干燥药物组合物，其中在所述干燥药物组合物中包含的所述两亲免疫刺激剂的比例是0.1％(重量/重量)至10％(重量/重量)，优选1％(重量/重量)至5％(重量/重量)，更优选0.5％(重量/重量)至2％(重量/重量)，最优选约0.2％(重量/重量)。
49.9.根据权利要求2至8中任一项所述的干燥药物组合物，其中填充剂:抗原的比例是1000:1(重量/重量)至10:1(重量/重量)，优选500:1(重量/重量)至25:1(重量/重量)，更优选300:1(重量/重量)至30:1(重量/重量)，最优选约49:1(重量/重量)。
50.10.根据权利要求4至9中任一项所述的干燥药物组合物，其中在所述包衣部分中的所述两亲免疫刺激剂至少部分地包覆所述颗粒的所述核心部分。
51.11.根据权利要求1至10中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂是toll样受体(tlr)的激动剂，优选tlr4的激动剂。
52.12.根据权利要求1至11中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂是力控制剂。
53.13.根据权利要求1至12中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂选自单磷酰基脂质a、合成脂质a、脂质a类似物、脂质a模拟物、细胞因子、皂苷、革兰氏阴性细菌的脂多糖(lps)和内毒素。
54.14.根据权利要求1至13中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂是单磷酰基脂质a。
55.15.根据权利要求1至14中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原是生物大分子。
56.16.根据权利要求1至15中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原是多肽。
57.17.根据权利要求1至16中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原是热稳定的。
58.18.根据权利要求1至17中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原是热稳定多肽。
59.19.根据权利要求1至18中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原含有硫氧还蛋白。
60.20.根据权利要求1至19中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原包含适温生物，优选嗜热古菌，更优选激烈火球菌的硫氧还蛋白。
61.21.根据权利要求1至20中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少一个乳头状瘤病毒的抗原表位。
62.22.根据权利要求1至21中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少一个肽，所述肽含有与hpv16 l2多肽的第20位至38位氨基酸一致的氨基酸序列。
63.23.根据权利要求1至22中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少三个肽，所述肽含有与hpv16 l2多肽的第20位至38位氨基酸一致的氨基酸序列。
64.24.根据权利要求1至23中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述药物组合物的含水量最高是5％，优选最高2％，最优选最高1％。
65.25.一种干燥药物组合物，其通过对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液喷雾干燥获得或能够获得的，优选是根据权利要求31至35中任一项所述的方法获得或能够获得的。
66.26.根据权利要求1至25中任一项所述的干燥药物组合物，其用于药物。
67.27.根据权利要求1至25中任一项所述的干燥药物组合物，其用于对象的疫苗接种。
68.28.根据权利要求27所述之用途的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少一个乳头状瘤病毒的抗原表位，其中所述疫苗接种是针对乳头状瘤病毒的疫苗接种。
69.29.根据权利要求26至28中任一项所述之用途的干燥药物组合物，其中所述之用途包含通过吸入施用。
70.30.根据权利要求25至29中任一项所述之用途的干燥药物组合物，其中所述对象是哺乳动物，优选地是人类。
71.31.一种用于生产干燥药物组合物的方法，所述方法包括对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液进行喷雾干燥。
72.32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法还包括将所述两亲免疫刺激剂混合到包含所述抗原和任选地所述填充剂的溶液中。
73.33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述溶液还包含乙醇/水混合物作为溶剂。
74.34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述溶剂中乙醇/水的比例是2:1(体积/体积)至10:1(体积/体积)，优选5:1(体积/体积)至9:1(体积/体积)，更优选6:1(体积/体积)至8:1(体积/体积)，最优选约70％(体积/体积)。
75.35.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述喷雾干燥包括将干燥空气流加热到80℃至150℃、优选100℃至140℃、最优选约125℃的温度。
76.36.一种试剂盒，其在外壳中包含根据权利要求1至30中任一项所述的干燥药物组合物。
77.37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含施用装置，或其中所述外壳是施用装置。
78.38.根据权利要求1至30中任一项所述的干燥药物组合物用于制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于制备药物，优选用于制备疫苗。
79.39.一种用于治疗和/或预防对象感染的方法，所述方法包括使所述对象与根据权利要求1至30中任一项所述的干燥药物组合物接触，从而治疗和/或预防感染。
80.本说明书中引用的所有文献，关于其全部公开内容和本说明书中特别提到的公开内容，均通过引用并入本文。
附图说明
81.图1：对使用含有用alexa fluor 750预先标记的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原的配制成干粉的疫苗经气管内注射的小鼠肺(l)和气管(t)外植体的可溶性组织上清液(20000
×
g，15分钟)进行sds
‑
page分离和荧光分析。显示了用源自两只小鼠(l1，t1；l2，t2)的生物重复组织样品获得的结果；alexa fluor 750标记的输入抗原(c )和来自未注射荧光标记的干粉疫苗的小鼠肺组织样品(c
‑
)分别作为阳性对照和阴性对照。
82.图2：配制成干粉的hpv
‑
l2疫苗免疫原性的评价。(a)免疫和采血方案。(b)小鼠个体(用所指示的符号表示)的gst
‑
l2 elisa检测结果，所述小鼠个体注射了：i)皮下注射无抗原的粉末(#1；阴性对照)；ii)皮下注射可溶性双佐剂疫苗(20μg的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原)(#2；阳性对照)；气管内施用配制成干粉的hpv
‑
l2疫苗(1mg总粉末相当于约20μg的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原)(#3；测试样品)；皮下注射溶解于pbs的单佐剂预配置成干粉的疫苗(#4；与#3用量相同)。y轴显示了测定的抗
‑
l2抗体滴度，其是通过使用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体和色原底物邻苯二胺(用分光光度法在450nm读取)测定的。(c)使用大鼠抗小鼠ig亚类特异性、缀合有辣根过氧化物酶的二级抗体以固定的免疫血清稀释测定免疫球蛋白同种型。
83.图3：来自小鼠的免疫血清对比分析，其中小鼠被气管内注射了含有参考抗原pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3(#3)或经修饰的ovx313
‑
pftrx
‑
hpv
‑
l2x3抗原(#5)作为活性成分的配制成干粉的疫苗。以抗
‑
hpv
‑
l2抗体滴度表示的免疫原性是采用如图2图例所示的gst
‑
l2俘获elisa测定的。
84.以下实施例仅用于说明本发明。任何情况下，其不应解释为对本发明范围的限制。
85.实施例1：
86.疫苗通过喷雾干燥法生产，使用甘露醇作为填充剂，从70:30体积/体积的乙醇水溶液开始。通常将抗原溶解在1mm至25mm浓度的磷酸钾溶液中。为制备100ml的喷雾干燥进料溶液，将58.7mg的甘露醇溶解在69ml纯化水中，并加入1ml通常含有10mg抗原的磷酸钾水溶液。将单磷酰基脂质a(mpla；通常1.04mg)溶解在30ml乙醇(95体积/体积％)中，并将得到的溶液加入含有甘露醇和抗原的预混合溶液中。
87.最后，使用buchi 290喷雾干燥机按照以下工艺参数对完成的溶液进行喷雾：进料口温度125℃；进料速度3.5ml/min；气流量601l/h；吸气量37m3/h。
88.相对于最终制剂，抗原浓度可以是0.31重量/重量％至2.00重量/重量％。当粉末溶解在水中时，获得7.75的ph值。所得粉末的粒径分布是dv10 1.43 /
‑
0.09μm；dv50 2.65 /
‑
0.17μm；dv90 4.78 /
‑
0.55μm。该粉末在室温下可以稳定至少1年。
89.使用(plastiape)吸入装置，根据ph.eur.9.0进行离体/实验室雾化测量疫苗的空气动力学性能，结果发射部分占负载剂量的81.35 /
‑
11.2％，可呼吸部分占发射剂量的74.86 /
‑
12.04％。
90.实施例2：
91.为监控干粉疫苗向肺部的有效递送，在抗原蛋白(即激烈火球菌硫氧还蛋白，其展
示跨越次要衣壳蛋白l2的第20至38氨基酸位置的hpv16
‑
l2肽表位的三个串联重复序列；以下命名为pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3)通过喷雾干燥掺入吸入粉末制剂之前，用alexa fluor 750对之进行标记。然后将含有疫苗的粉末(1.7mg和2.0mg，分别对应于10μg和12μg的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原)通过使用penn century微型喷雾器施用给两只balb/c小鼠。随后15分钟后处死小鼠并进行器官(肺、气管)移植，将组织均质化，在4℃下以20000
×
g离心15分钟，在变性的、含sds的聚丙烯酰胺凝胶(11％)上分离得到的可溶性上清液，然后用近红外荧光(nir)成像(odyssey，li
‑
cor)进行可视化处理。如图1所示，在肺(l)和气管(t)样品中检测到与显示pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3预期分子量(18294.3da)的多肽条带相关的特定nir信号。
92.实施例3：
93.已证明配制成干粉的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原可在小鼠气管内递送到达呼吸道(人类自动吸入器辅助的自身施用的替代)后，对mpla佐剂的干粉疫苗的免疫原性进行了评估。为此，在通过喷雾干燥掺入含mpla的粉末之前，将pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原交换到pbs缓冲液中，经triton x
‑
114处理解毒，并且使用penn century微型喷雾器将该抗原在气管内施用给6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠。这些小鼠被分成四组：
94.1)阴性对照组，由5只皮下施用空粉末(即，含有mpla但不含有作为“活性成分”的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原的粉末)(1mg)的小鼠组成。
95.2)阳性对照组，由7只皮下施用可溶性的、以明矾(50μg) mpla(10μg)为佐剂的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3疫苗(20μg)的小鼠组成。
96.3)测试组，由10只气管内施用配制成干粉的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3疫苗(1mg总粉末相当于约20μg的蛋白抗原)的小鼠组成。
97.4)内部对照组，由7只施用在皮下施用前刚溶解于pbs的预配置成干粉的疫苗(与#3用量相同)的小鼠组成。
98.免疫方案由初次免疫和之后一周一次的两次增强组成(图2a)，在此之前采集免疫前血清，作为后续免疫分析的背景参照。最后一次免疫后两周，处死小鼠，通过心脏穿刺取血，用于制备免疫血清，免疫血清在
‑
80℃储存待后续免疫分析。这是通过间接gst
‑
l2俘获酶联免疫吸附试验(elisa)来测量抗
‑
l2血清抗体总滴度，以及通过定量同种型分型、间接双夹心elisa法进行的，以测定各种免疫类型诱导的特异性免疫球蛋白(ig)的同种型和亚型。
99.如图2b所示，测量的组#3(气管内递送的干粉疫苗)的抗
‑
hpv l2抗体滴度是25至800，平均值是1:255，与用双佐剂(明矾 mpla)的pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3疫苗(组#2)进行标准皮下免疫所得的滴度无显著差异(p<0.2790)。在相同的实验条件下，无抗原的阴性对照组(#1)中未检测到上述背景免疫反应，而采用单佐剂、溶于pbs的干粉疫苗进行皮下免疫后，检测到的抗体滴度与双佐剂阳性对照组(#2)相近(或略高于，但无统计学显著性)。
100.如图2(小图c)进一步所示，3个免疫组(#2、#3和#4)中测出了大体相似的ig同种型(和亚型)，但与皮下施用的可溶性双佐剂疫苗相比，对于配制成干粉的疫苗而言，无论直接施用(即，气管内施用；组#3)或溶解后通过皮下注射施用(组#4)，具有向普遍的igg2b亚型的可再现性倾斜，并伴随着早期形成的(且成熟度很低)五聚体igm同种型的减少。
101.实施例4：
102.为评估上述干粉疫苗配制过程的通用性，将替代的hpv
‑
l2x3抗原(命名为ovx313
‑
pftrx
‑
hpv
‑
l2x3)经喷雾干燥转化成含mpla佐剂的粉末形式，所述hpv
‑
l2x3抗原和参照pftrx
‑
hpv16
‑
l2x3抗原具有相同的免疫表位，但在尺寸(247560da对比18294da)和总净电荷( 6对比 2)上不同，且据报道hpv
‑
l2x3抗原具有更高的免疫原性。为测试这种替代的干粉疫苗的免疫性能，将1mg含有ovx313
‑
pftrx
‑
hpv
‑
l2x3的粉末(对应于约20μg蛋白抗原)按照实施例2中描述的相同免疫方案(见图2a)通过气管施用于13只balb/c小鼠。处死小鼠并收集血液后，使用gst
‑
l2俘获elisa法分析免疫血清，并将获得的抗
‑
hpv l2滴度与配制成干粉的并经气管施用的pftrx
‑
hpv
‑
l2x3疫苗获得的抗
‑
hpv l2滴度进行比较。如图3所示，用配制成干粉的ovx313
‑
pftrx
‑
hpv
‑
l2x3疫苗经肺部接种获得的抗
‑
hpv l2抗体滴度略高(平均值是1:500，与pftrx
‑
hpv
‑
l2x3达到的平均1:255的滴度相比)。
103.引用的非标准文献：
104.‑
nardelli
‑
haefliger等人(2005),vaccine,23:3634
‑
3641
105.‑
wo 2010/003465
106.‑
wo 2010/070052
107.‑
wo 2017/211886

技术特征：
1.一种吸入用干燥药物组合物，其包含抗原和两亲免疫刺激剂，其中所述药物组合物是通过喷雾干燥法制备的，优选地其中所述抗原是热稳定多肽，其中所述抗原包含硫氧还蛋白，和/或其中所述抗原包含至少一个乳头状瘤病毒的抗原表位。2.根据权利要求1所述的干燥药物组合物，还包含至少一种填充剂，所述填充剂优选地选自甘露醇、乳糖和海藻糖，更优选地是甘露醇。3.根据权利要求1或2所述的干燥药物组合物，其中在所述干燥药物组合物中包含的所述抗原的比例是0.1％(重量/重量)至10％(重量/重量)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的干燥药物组合物，其中在所述干燥药物组合物中包含的所述抗原的比例是0.3％(重量/重量)至2.5％(重量/重量)，优选约2％(重量/重量)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的干燥药物组合物，其中在所述干燥药物组合物中包含的所述两亲免疫刺激剂的比例是0.1％(重量/重量)至10％(重量/重量)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂是toll样受体(tlr)的激动剂，优选tlr4的激动剂，更优选地选自单磷酰基脂质a、合成脂质a、脂质a类似物、脂质a模拟物、细胞因子、皂苷、革兰氏阴性细菌的脂多糖(lps)和内毒素。7.根据权利要求1至6中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述两亲免疫刺激剂是单磷酰基脂质a。8.根据权利要求1至7中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述喷雾干燥包括在高温下将包含指定化合物的溶液喷雾到气态干燥剂流中。9.根据权利要求1至8中任一项所述的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少一个肽，所述肽含有与hpv16 l2多肽的第20位至38位氨基酸一致的氨基酸序列。10.一种干燥药物组合物，其是通过对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液喷雾干燥获得或能够获得的，优选地是根据权利要求15所述的方法获得或能够获得的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的干燥药物组合物，其用于药物。12.根据权利要求1至10中任一项所述的干燥药物组合物，其用于对象的疫苗接种。13.根据权利要求12所述之用途的干燥药物组合物，其中所述抗原包含至少一个乳头状瘤病毒的抗原表位，其中所述疫苗接种是针对乳头状瘤病毒的疫苗接种。14.一种用于生产干燥药物组合物的方法，所述方法包括对包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液进行喷雾干燥。15.一种试剂盒，其在外壳中包含根据权利要求1至10任一项所述的干燥药物组合物。
技术总结
本发明涉及包含抗原和两亲免疫刺激剂的吸入用干燥药物组合物，其中所述药物组合物是通过喷雾干燥法制备的；涉及通过喷雾干燥包含抗原、两亲免疫刺激剂和任选的填充剂的溶液获得或能够获得的干燥药物组合物。本发明还涉及所述干燥药物组合物，其用于药物，特别用于对象的疫苗接种；并且涉及与之相关的方法和试剂盒。盒。


技术研发人员：马丁
受保护的技术使用者：德国癌症研究中心
技术研发日：2019.10.17
技术公布日：2021/6/29