本发明涉及组织工程技术领域，具体地，涉及一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用。
背景技术：
由于疾病、损伤和发育缺陷，世界上每年都有大量的人罹患终末期器官衰竭，这已经成为重要的经济和医疗保健问题。器官移植是临床上最有效的治疗方式。在中国，每年大约有30万病人需要器官移植，但只有大约1万人能够得到移植，器官供体缺口巨大，这很大程度限制了器官移植对终末期器官衰竭的治疗范围。同时器官移植后可能出现的免疫排斥限制了器官移植对终末期器官衰竭的治疗效果。
langer等在1993年首次应用生命科学和工程学的原理和方法提出了组织工程技术以恢复、维持或改善组织功能。组织工程的基本原理是将细胞播散到一个可降解的三维支架中，用于替代生物组织受损或丢失的组织，重建生物组织，这给终末期器官衰竭患者带来了新的治疗方案。组织工程已被广泛应用于骨组织缺损修复，软骨组织修复，肝脏损伤修复，心脏瓣膜修复和血管修复和皮肤等。
传统的组织工程时常使用胰酶或胶原蛋白酶来分解细胞外基质以获取培养的细胞，但此方式会破坏细胞的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)，如胶原蛋白、纤连蛋白、整合素和钙黏素家族等，影响收获细胞再培养时形成良好的间隙连接。细胞膜上的钙粘蛋白家族，为细胞骨架蛋白与细胞外基质的连接提供锚点，被胰酶破坏后会影响细胞迁移和细胞粘附。此外组织工程方法中支架的生物降解常导致炎症反应。几乎所有的支架材料在植入后都可引起非特异性的炎症反应。在创口愈合的早期阶段，炎症反应将破坏接种的种子细胞，从而导致组织工程构建的失败。因此构建一种不需要引入酶进行消化的细胞培养技术被人们所期望。
1990年日本的norikoy和teruoo等人首次使用表面接有聚异丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide)，pnipaam或pipaam)的聚苯乙烯(polystyrene，pst)培养皿培养牛肝细胞，将温度作为细胞吸附和脱附的开关，通过改变培养温度来控制细胞粘附和细胞脱离((yamadan,okanot,sakaih,etal.thermo-responsivepolymericsurfaces；controlofattachmentanddetachmentofculturedcells[j].macromolecularrapidcommunications,1990,11(11):571-576.)。这项技术被称为细胞片层工程(cellsheetengineering)，实现了无需引入的酶类物质即可完成细胞的脱落，避免了酶类物质对体外培养的细胞的损害。
pnipaam现在已经是一种研究充分的温敏材料，其在水溶液中的构象是温度响应的。在低温时pnipaam溶解在水中，当温度升高时，pnipaam从水溶液中分离出来，并且这种相变是可逆的。发生这种相变的温度被称为低临界溶解温度(lowercriticalsolutiontemperature，lcst)，pnipaam的lcst约为32℃。利用pnipaam的这种温敏性质，将其接枝于细胞培养皿上形成一层温敏膜，当温度高于lcst时，表面的pnipaam膜变为脱水的紧密的疏水性构象，这将有利于细胞在其表面吸附生长。但温度下降到lcst之下，温敏膜变为水合舒展的亲水性构象，这有利于贴壁细胞完整的脱附，细胞薄片还保留下完整的细胞外基质，它们在将细胞薄片转移到其他培养材料或其他细胞薄片上时起着理想的黏附作用。而使用酶解的方法，细胞外的细胞外基质被破坏，细胞单独释放，粘附作用大大降低。
pnipaam的相变行为是由于pnipaam侧链中同时含有疏水性的异丙基(ch-(ch3)2)和亲水性的酰胺基(-conh-)。当温度较低时，pnipaam水溶液中亲水性酰胺基通过氢键与水分子结合，使得水分子扩散进入pnipaam高分子中，使其发生溶胀行为，体积增大。当温度较高时，疏水基团异丙基疏水作用增强，分子间的氢键发生断裂，酰胺基与水分子的结合减少，pnipaam高分子收缩，形成沉淀析出。
akiyama等人利用接枝了pnipaam的聚苯丙烯板上培养牛劲动脉内皮细胞，当温度由37℃降至20℃时，收获了细胞片层。leiy等人也利用此方法研究了人宫颈癌细胞(hela细胞)和人胚胎肾细胞(hek293)在温敏薄膜上的吸附和脱落，发现在不使用任何酶的情况下，实现了有效的细胞增殖和收获。yuq等人发现接枝了pnipaam的聚乙烯板可能拥有良好的血液相容性。kenichin合成了基于pnipaam热敏阴离子聚合物刷，利用人主动脉平滑肌细胞(smc)和人脐静脉内皮细胞(huvec)在细胞粘附和分离性能上的差异，只需改变温度即可分离huvec和smc的混合物。
但是，研究表明并非所有以pnipaam为基底的细胞培养板都适合用于细胞培养和收获。聚合物的制备方法、接枝厚度，和其它功能材料的比例等参数均会改变细胞培养基底的表面润湿性和微观结构，从而影响细胞的粘附和后续的生长。通过修饰其他物质可以调节材料的lcst，亲水共聚物会使pnipaam的lcst向更高的温度移动，疏水共聚物则相反。通过修饰其他物质也可以改变材料对贴壁细胞的脱附速度，olivere将聚乙二醇(peg)引入pnipaam，分别制备了含peg质量分数为15％和19％的两种温敏材料，将它们接枝于金载玻片并用其培养小鼠成纤维细胞(l929)，发现含19％peg的温敏材料上细胞脱附的时间是含15％peg的材料的一半。通过细胞片层工程收获的细胞薄片，由于不需要蛋白水解酶，即使在分离后，基底表面细胞外基质蛋白也得以保存，并产生一种基本的构建块，可以进一步操纵它来组装更复杂的组织和器官。细胞片层工程已经在临床实验上有大量的应用，尤其是作为技术的先驱者，teruoo的团队利用细胞片层工程重建组织做了大量临床试验。其中包括了眼角膜重建、食管溃疡的治疗、心脏修复、肝再生、肺漏气封胶和牙周组织再生等。其他团队也用了细胞片层工程取得临床成功。这些临床试验的成功都说明了细胞片层工程正展现出其在再生医学中潜在的巨大作用。
阳离子聚合物聚丙烯酰胺(polyallylamine，paam)分子具有大量伯胺基团。前期研究发现接种于携带正电荷的pst-azphpaam-igf-1/tnf-α材料上的骨髓间充质干细胞，21天后几乎未被检测到β-半乳糖苷酶的表达，mtt法检测表明细胞具有较好的活性，sod基因表达的mrna表达水平显著提高。这说明正电荷的pst-azphpaam-igf-1/tnf-α材料具有抑制骨髓间充质干细胞衰老的作用(yangr,wul,chenj,etal.effectsofdifferentiationandanti-senescencefrombmscstohepatocy-likecellsofthepaam-igf/tnf-αbiomaterial[j].acsappliedmaterials&interfaces,2016:10377-10386.)。但目前仍没有人对paam修饰到基于nipaam的温敏材料上是否会对温敏材料的各种特性以及温敏材料用来培养细胞片进行研究。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法。
本发明的第二个目的是提供任一所述的制备方法制备得到的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物。
本发明的第三个目的是提供所述的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物在细胞培养中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种细胞培养容器。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明将具有抗细胞衰老作用的阳离子聚合物paam修饰于温敏材料上，制备一种低温时使细胞保留完整细胞外基质脱附且细胞具有较高的活性的新型温敏膜细胞培养板，并用其培养细胞。
具体地，peg-nipaam-paam合成是本课题开展的基础，peg和paam不能直接与nipaam连接，因此设计以三乙胺做缚酸剂利用丙烯酰氯使peg和paam带上碳碳双键，得到peg-ac和paam-ac。将都具有碳碳双键的peg-ac、paam-ac和nipaam溶于异丁醇，加入引发剂偶氮二异丁腈(aibn)。在60℃下，aibn分子容易发生分裂反应，产生1个自由基，而使整个反应体系开始发生自由基聚合而合成共聚物peg-nipaam-paam。将共聚物peg-nipaam-paam与4-叠氮苯甲酸在edc的活化下合成peg-nipaam-azphpaam。在紫外光条件下将peg-nipaam-azphpaam接枝在聚苯乙烯(pst)板上形成pst-peg-nipaam-azphpaam。
将nipaam的聚合物接枝到各种物质上有很多方法，如光引发聚合、活性基质和功能化聚合物接枝、辐照接枝等。其中辐照接枝由于仪器和成本的缘故难以进行，而活性基质和功能化聚合物接枝仅需要光引发剂和紫外灯，实际操作起来方便，因此本次实验也选用了这种方法。4-叠氮苯甲酸中的具有叠氮基团的光活性，通过照射紫外线即可产生自由基，将连有4-叠氮苯甲酸的温敏材料peg-nipaam-azphpaam以共价键的形式接枝于基底材料pst表面。igf-1与tnf-α也通过4-叠氮苯甲酸光活化后，紫外光照射接枝于pst表面。
进一步，红外光谱对合成物质分子进行的分析和鉴定，其结果表明温敏薄膜材料合成成功。进一步通过扫描电镜分析结果显示，接枝peg-nipaam-azphpaam、igf-1和tnf-α温敏聚合物的聚苯乙烯细胞培养板表面存在均匀的凸起，为温敏聚合物和生长因子干燥坍缩而成，说明新型二维温敏薄膜细胞培养板合成成功；通过分析温敏薄膜表面的接触角，发现其在10℃和37℃的接触角差满足细胞脱附要求。通过紫外分光光度法检测得温敏材料的lcst约在31-35℃之间。说明材料的温敏特性满足细胞在37℃中吸附于其表面生长，在10℃中细胞片能够自行脱附的要求；通过细胞脱附实验，发现当peg-nipaam-azphpaam的水溶液浓度为1mg/ml和10mg/ml接枝成的细胞培养板能够使mcf-7在温度37℃的环境中吸附生长，在10℃环境中保温30分钟后自行脱附，部分细胞保持细胞片的状态。
因此本发明要求保护一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法，包括如下步骤：
s1.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入peg和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到peg-ac(聚乙二醇丙烯酸酯)；
s2.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入聚丙烯酰胺(paam)和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到paam-ac(聚丙烯酰胺丙烯酸酯)；
s3.将n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、peg-ac和paam-ac的异丁醇溶液与偶氮二异丁腈混合，在没有气体的条件下充分反应，纯化干燥得到peg-nipaam-paam(聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺)；
s4.将peg-nipaam-paam和4-叠氮基苯甲酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的活化下，在2-吗啉代乙磺酸缓冲溶液充分反应，离心弃上清，避光干燥即得peg-nipaam-azphpaam(聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺-叠氮苯甲酯)。
步骤s1和s2向聚乙二醇(peg)和聚丙烯酰胺(paam)引入双键。
优选地，步骤s1中，丙烯酰氯：peg：三乙胺的质量比为9～27：200：10～30。
更优选地，步骤s1中，丙烯酰氯：peg：三乙胺的质量比为18：200：20。
优选地，步骤s2中，丙烯酰氯：聚丙烯酰胺：三乙胺的质量比为9～27：16：10～30。
更优选地，步骤s2中，丙烯酰氯：聚丙烯酰胺：三乙胺的质量比为9：16：10。
优选地，步骤s1和/或s2中，搅拌12～24小时充分反应。
更优选地，步骤s1和/或s2中，搅拌12小时充分反应。
优选地，步骤s1和/或s2中，通过冷却的正己烷降温得到沉淀。
优选地，步骤s1和/或s2中，将沉淀物在室温下真空干燥24～48小时。
更优选地，步骤s1和/或s2中，将沉淀物在室温下真空干燥24小时。
优选地，步骤s3中，n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、peg-ac和paam-ac的质量比为45：2：1～5。
更优选地，步骤s3中，n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、peg-ac和paam-ac的质量比为45：2：3。
优选地，步骤s3中，除去溶液中的气体，用氮气吹扫，在没有气体的条件下充分反应。
优选地，步骤s3中，60～80℃下充分反应3～24小时。
更优选地，步骤s3中，60℃下充分反应24小时。
优选地，步骤s3中，使用截留分子量20000的透析袋在去离子水中透析进行纯化。
优选地，步骤s3中，真空干燥24～48小时。
更优选地，步骤s3中，真空干燥24小时。
优选地，步骤s3中，偶氮二异丁腈的用量为n-异丙基丙烯酰胺的摩尔数的0.1～0.5％。
更优选地，步骤s3中，偶氮二异丁腈的用量为n-异丙基丙烯酰胺的摩尔数的0.5％。
优选地，步骤s4中，共聚物peg-nipaam-paam和4-叠氮基苯甲酸用量的质量比为5：1～2
更优选地，步骤s4中，共聚物peg-nipaam-paam和4-叠氮基苯甲酸用量的质量比为5：1。
优选地，步骤s4中，2-吗啉代乙磺酸缓冲溶液ph3.5～5.5。
更优选地，步骤s4中，2-吗啉代乙磺酸缓冲溶液ph4.5。
优选地，步骤s4中，0～4℃下搅拌24～48小时充分反应。
更优选地，步骤s4中，4℃下搅拌24小时充分反应。
优选地，步骤s4中，35～60℃下离心。
更优选地，步骤s4中，40℃下离心。
优选地，步骤s4中，避光真空干燥24～48小时。
更优选地，步骤s4中，避光真空干燥24小时。
任一所述的制备方法制备得到的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护所述的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物在细胞培养中的应用。
优选地，将所述的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物紫外光接枝到聚苯乙烯细胞培养容器表面。
本发明进一步要求保护一种细胞培养容器，聚苯乙烯细胞培养容器表面紫外光接枝有所述的聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物。
优选地，所述细胞培养容器还紫外光接枝有胰岛素样生长因子-1(igf-1)和/或肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的一种或两种。
更优选地，所述细胞培养容器还紫外光接枝有胰岛素样生长因子-1(igf-1)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。
优选地，所述紫外光接枝为距离5～10cm用50～100w紫外线灯照射5～30秒钟。
更优选地，所述紫外光接枝为距离5cm用100w紫外线灯照射10秒钟。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
以异丙基丙烯酰胺为基础，利用paam和peg修饰合成了peg-nipaam-paam温敏材料，将该温敏材料接枝于聚苯乙烯细胞培养板上形成温敏薄膜。利用该温敏薄膜细胞培养板培养细胞，通过控制温度，改变温敏薄膜的亲水-疏水性质，实现通过温度控制细胞吸附生长和保留细胞外基质的细胞片完整脱附。
本发明具有以下的两点创新：1、本发明合成的温敏薄膜材料具有的创新性：本发明使用阳离子聚合物paam、peg与nipaam交联，制备出的材料不仅具有良好的温敏特性，保证细胞片能够在低温下保留完整的细胞外基质脱附，保持细胞的活性的功能；2、本发明温敏材料接枝方式具有创新性：本发明将paam与4-叠氮苯甲酸连接，使得paam与nipaam共聚后具有光活性，使制备得到的温敏材料仅需通过紫外光照射即可共价接枝于聚苯乙烯(pst)细胞培养板上，接枝方式无需贵重仪器，简便快捷。
附图说明
图1为合成示意图。
图2为红外检测结果；图中依次为合成过程中不同材料的红外结果，a：聚乙二醇；b：丙烯酰氯；c：聚乙二醇丙烯酸酯；d：n-异丙基丙烯酰胺；e：聚丙烯酰胺；f：聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺；g：4-叠氮苯甲酸；i：聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-叠氮苯甲酯；h：.聚苯乙烯培养板；j：聚苯乙烯培养板-聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺-叠氮苯甲酯。
图3为pst-peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α扫描电镜检测结果：(a)：未修饰的聚苯乙烯培养板(b)：未修饰的聚苯乙烯培养板(c)：光活性peg–nipaam–azphpaam-igf-1/tnf-α温敏聚合物接枝的聚苯乙烯培养板(d)：光活性peg–nipaam–azphpaam-igf-1/tnf-α温敏聚合物接枝的聚苯乙烯培养板。
图4为pst-peg-nipaam-azphpaam接触角检测结果。
图5为pst-peg-nipaam-azphpaam热重检测结果。
图6为peg-nipaam-paam紫外分光光度法检测结果。
图7降温前后mcf-7在不同浓度共聚物薄膜上的吸附于脱附情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、细胞株
人乳腺癌细胞系(mcf-7)来源为中国科学院深圳先进技术研究院，经本实验室传代培养。
2、主要试剂
丙烯酰氯(acryloylchloride，accl)购至美国sigma公司；peg2000购至美国sigma公司；异丙基丙烯酰胺购至美国sigma公司；聚丙烯酰胺(分子量17kda)购至广州展晨生物科技有限公司；igf-1购至广州威佳生物科技有限公司；tnf-α购至广州威佳生物科技有限公司；二氯甲烷(dichloromethane，dcm)购至美国sigma公司；三乙胺购至美国sigma公司；透析袋(20kda)购至美国spectrumlabs；异丁醇购至美国sigma公司；偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile，aibn)购至美国sigma公司；丙酮购至美国sigma公司。
3、仪器
江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器；德国tg209f1热重分析仪；日本日立公司扫描电子显微镜；荷兰飞利浦紫外灯照射仪；德国bruker公司傅里叶变换红外光谱仪；日本岛津仪器有限公司紫外可见分光光度计uv-2450；浙江金华市科迪仪器设备有限公司真空冷冻干燥机；广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅；青岛海尔集团4℃、-20℃冰箱；上海一恒科技有限公司电热恒温鼓风干燥箱；赛多利思科学仪器(北京)有限公司电子天平；荷兰飞利浦紫外灯照射仪。
实施例1温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam及温敏薄膜细胞培养板的制备
如图1所示，本发明通过在温度敏感高分子聚合物nipaam材料上共聚修饰阳离子聚合物paam，通过紫外光接枝温敏材料和细胞因子igf-1和tnf-α于聚苯乙烯细胞培养板表面，形成具有抗细胞衰功能的新型二维温敏薄膜细胞培养板。步骤如下：
一、peg-ac的合成
将丙烯酰氯(accl)溶解在四氢呋喃(thf)中，逐滴滴入聚乙二醇(peg)和三乙胺(tea)的混合液中。三者质量比例为丙烯酰氯：peg：三乙胺＝18：200：20混合溶液中。反应混合物在0℃和室温下分别搅拌12小时后通过微滤过滤除去三乙胺盐酸沉淀物，通过0℃正己烷沉淀溶液，过滤。将沉淀物在室温下真空干燥24小时，获得peg-ac。
2、paam-ac的合成
将丙烯酰氯(accl)溶解在四氢呋喃(thf)中，逐滴滴入paam(聚丙烯酰胺)和三乙胺(tea)的混合液中。三者质量比例为丙烯酰氯：paam：三乙胺＝9：16：10混合溶液中。反应混合物在0℃和室温下分别搅拌12小时后通过微滤过滤除去三乙胺盐酸沉淀物，通过0℃正己烷沉淀溶液过滤。将沉淀物在室温下真空干燥24小时，获得paam-ac。
3、peg-nipaam-paam的合成
将nipaam(n-异丙基丙烯酰胺)、peg-ac和paam-ac分别以物质的量比例为45：2：1、45：2：2、45：2：3、45：2：4和45：2：5溶解在异丁醇中，加入nipaam物质的量的0.5％的aibn(偶氮二异丁腈)作为引发剂。除去溶液中的气体，用氮气吹扫，防止氧气影响反应，密封并孵育在60℃下培养24小时。所得产物共聚物使用截留分子量20000的透析袋在去离子水中透析3天(透析液是去离子水)，每天换水2～3次，透析结束后将溶液在室温下真空干燥24小时，获得共聚物peg-nipaam-paam。
4、peg-nipaam-azphpaam的合成
在避光环境中，将共聚物peg-nipaam-paam(1g)，4-叠氮基苯甲酸(0.2g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(水溶性碳二亚胺，edc，0.35g)溶于2-吗啉代乙磺酸(mes)缓冲溶液(ph4.5)中，混合物在4℃下搅拌24小时。此后，溶液在40℃下离心。倒去上清液，避光真空干燥24小时，获得peg-nipaam-azphpaam。
5、紫外光接枝peg-nipaam-azphpaam在聚苯乙烯培养板上
分别将0.1ml10mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml合成的peg-nipaam-azphpaam铺满聚苯乙烯(pst)12孔板上的一孔，每种浓度接三个孔并做好标记。在室温下风干后，距离5cm用紫外线灯(100w)照射10秒钟。用蒸馏水(10℃)冲洗聚苯乙烯板，直到通过紫外光谱(280nm)证实洗涤液中不存在游离的共聚物，得到pst-peg-nipaam-azphpaam。
6、pst-peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α的合成
在避光环境下向pst-peg-nipaam-azphpaam表面分别滴加500ng/ml的胰岛素样生长因子-1(igf-1)与肿瘤坏死因子-α(tnf-α)40μl并置于室温下风干。距离5cm用紫外线灯(100w)照射5分钟。用蒸馏水(10℃)冲洗板子，直到通过紫外光谱(280nm)证实洗涤液中不存在游离的共聚物，得到pst-peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α。
实施例2温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam及温敏薄膜细胞培养板的表征
一、红外检测
1、实验方法
分别将1mg纯化的实施例1中所用和合成的聚乙二醇、丙烯酰氯、聚乙二醇丙烯酸酯、n-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺、4-叠氮基苯甲酸、聚苯乙烯、聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺-叠氮苯甲酯和聚苯乙烯聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺-叠氮苯甲酯与100mg干燥的溴化钾粉末(a.r.级)混介均匀，装入模具内，采用压片机压制成片并置于样品架，然后插入仪器样品室的固定位置上，采用nicoletmaga750傅里叶变换红外光谱仪进行测试，波长范围4000～500cm-1。
2、实验结果
结果如图2所示，图2为红外检测结果。
图2a为peg的ft-ir曲线，分析结果表明，3422.57cm-1为端羟基-oh吸收峰，2888.31cm-1为-ch2-的吸收峰，1113.85cm-1为c-o-c的吸收峰，分析结果符合peg的结构式。
图2b为丙烯酰胺的ft-ir曲线，分析结果表明，1781.20cm-1为c＝o的吸收峰，1655.83为c＝c双键的吸收峰，753.18为c-cl的吸收峰，分析结果符合丙烯酰氯的结构式。
图2c为peg-ac(聚乙二醇丙烯酸酯)的ft-ir曲线，3410.99cm-1为羟基-oh的吸收峰，2877.69cm-1为-ch2-的吸收峰，1720.44cm-1为c＝o的吸收峰，1107.10cm-1为-c-o-c的吸收峰。分析结果表明peg与丙烯酰氯反应生成了peg-ac。
图2d为nipaam(n-异丙基丙烯酰胺)的ft-ir曲线，3300.09cm-1,3283.7cm-1为n-h键的吸收峰，1658.72cm-1处为c＝o键的吸收峰，1621.12cm-1处为c＝c双键的吸收峰，1549.75cm-1处为n-h的振动吸收峰，同时在900～650区域是否有一个较宽的峰，这个是n-h的面外变形振动，这些都是一级胺的特征峰。
图2e为paam(聚丙烯酰胺)红外吸收峰。
图2f.为peg-nipaam-paam(聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺)的ft-ir曲线，分析结果表明，1781.20cm-1为c＝o的吸收峰，1655.83为c＝c双键的吸收峰，753.18为c-cl的吸收峰，分析结果符合丙烯酰氯的结构式。
图2g为az(4-叠氮苯甲酸)的ft-ir曲线，3410.99cm-1为羟基-oh的吸收峰，2877.69cm-1为-ch2-的吸收峰，1720.44cm-1为c＝o的吸收峰，1107.10cm-1为-c-o-c的吸收峰。分析结果表明peg与丙烯酰氯反应生成了peg-ac。
图2h为pst(聚苯乙烯培养板)的ft-ir曲线，3300.09cm-1,3283.7cm-1为n-h键的吸收峰，1658.72cm-1处为c＝o键的吸收峰，1621.12cm-1处为c＝c双键的吸收峰，1549.75cm-1处为n-h的振动吸收峰，同时在900～650区域是否有一个较宽的峰，这个是n-h的面外变形振动，这些都是一级胺的特征峰。
图2i为nipaam-peg-azphpaam(聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺-叠氮苯甲酯)的红外图谱，3300.09cm-1，3283.7cm-1为n-h键的吸收峰，1658.72cm-1处为c＝o键的吸收峰，1621.12cm-1处为c＝c双键的吸收峰，1549.75cm-1处为n-h的振动吸收峰，同时在900～650区域是否有一个较宽的峰，这个是n-h的面外变形振动。
图2j为pst-peg-nipaam-azphpaam(聚苯乙烯培养板-聚乙二醇-n-异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酰胺-叠氮苯甲酯)的红外吸收光谱3300.09cm-1，3283.7cm-1为n-h键的吸收峰，1658.72cm-1处为c＝o键的吸收峰，1621.12cm-1处为c＝c双键的吸收峰，1549.75cm-1处为n-h的振动吸收峰，同时在900～650区域是否有一个较宽的峰，这个是n-h的面外变形振动。
制备得到的温敏共聚物peg-nipaam-paam1600cm-1附近有酰胺键的特征吸收峰，1650cm-1附近有氨基的特征吸收峰，1113.76cm-1附近有c-o-c基团的特征吸收峰，表明实施例1制备得到的温敏共聚物peg-nipaam-paam合成成功。
二、扫描电镜检测
1、实验方法
扫描电镜(sem)是一种用途广泛的科学仪器，它可以根据用户的需求提供样品不同类型的信息。
为了观察接枝有温敏聚合物的聚苯乙烯培养板的表面形貌，利用扫描电镜进行表征。扫描电镜是用细聚焦的电子束轰击样品表面，通过电子与样品相互作用产生二次电子、背散射电子等对样品表面进行观察和分析。将1cm×1cm实施例1制备的pst-peg-nipaam-paam-igf-1/tnf-α冷冻干燥、喷金后用仪器为日本日立s-4800扫描电子显微镜观察表面的形貌。
2、实验结果
扫描电镜结果如图3所示。图3a和图3b为未修饰的聚苯乙烯培养板，图3c和图3d为实施例1制备的光活性温敏聚合物接枝的聚苯乙烯培养板pst-peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α，易观察到图3a和图3b表面较为平整，为未接枝聚合物的聚苯乙烯培养板，图3c和图3d表面形貌出现较均匀的白色点状凸起，凸起之间有深色的沟，点状凸起为温敏聚合物长链干燥坍缩而成。
综上，peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α温敏聚合物接枝的聚苯乙烯培养板表面较未修饰的聚苯乙烯培养板表面粗糙，出现较均匀的白色点状凸起，凸起之间有深色的沟，点状凸起为温敏聚合物长链peg-nipaam-azphpaam、igf-1和tnf-α干燥坍缩而成，深色的沟为聚苯乙烯培养板自身含有的。说明实施例1制备得到的温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam、igf-1和tnf-α成功接枝至聚苯乙烯培养板。
三、接触角检测
1、实验方法
温敏材料的亲水-疏水的表面特性会随着温度的变化而发生改变，通过接触角的测定能够表征这种改变，将实施例1制备得到的pst-peg-nipaam-paam-igf-1/tnf-α浸泡于超纯水中，后用滤纸吸取表面多余水的样品。采用卧滴法分别测试共聚物表面接触角在10℃和37℃下的。使用分析软件来测定表面接触角。
2、实验结果
如图4所示，接枝了实施例1制备得到的温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam的聚苯乙烯细胞培养板在10℃下的接触角为64.20°，升高温度至37℃后，接触角增大至81.10°。温敏材料表面接触角变化达10℃足以让细胞片在低温下脱附。温敏材料在10℃时教37℃更加亲水，在两温度下的接触角相差16.90°，接枝了peg-nipaam-azphpaam薄膜的聚苯乙烯培养板相对于聚苯乙烯培养板表面减小了，这有利于细胞的吸附作用，说明实施例1制备得到的温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam满足细胞脱附要求。现有技术中报导相对于聚苯乙烯培养板表面减小了，这有利于细胞的吸附作用。
四、热重分析
1、实验方法
热重分析(thermogravimetricanalysis，tg或tga)是指在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，用来研究材料的热稳定性和组分。tga在研发和质量控制方面都是比较常用的检测手段。热重分析在实际的材料分析中经常与其他分析方法联用，进行综合热分析，全面准确分析材料。热重分析则指观测试样在受热过程中实质上的质量变化。热重分析所用的仪器是热天平，它的基本原理是，样品重量变化所引起的天平位移量转化成电磁量，这个微小的电量经过放大器放大后，送入记录仪记录；而电量的大小正比于样品的重量变化量。分别将2mg实施例1制备的peg-nipaam-azphpaam、pst-peg-nipaam-azphpaam和pst用德国tg209f1热重分析仪对支架进行热稳定分析。
2、实验结果
如图5所示，实施例1制备得到的温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam在100℃时热重结果在90％以上，可知本材料热稳定性良好，在350℃也几乎不分解。peg-nipaam-paam在50℃内是稳定的，50℃后开始分解。pst-peg-nipaam-azphpaam在50度内也是稳定结构，125℃后开始分解。因此将peg-nipaam-paam接枝于pst板后热稳定性变强，甚至使其能够在121℃高温灭菌时不会发生分解，可以用于无菌培养细胞。适用于细胞培养和进一步的细胞实验以及动物体内实验。
五、紫外可见光分光光度法检测
1、实验方法
温敏聚合物水溶液因温度升高达到溶液的lcst时，从溶解透明状态而变浑浊，也可因温度降低从浑浊变回透明状态。在此过程中，溶液的透光率随着温度的变化发生很大的变化。这样可利用紫外可见光分光光度法测定溶液在不同温度下的透光率。一般定义透光率为其完全溶解时透光率一半时对应的温度为该聚合物的lcst。将分光光度计的测定波长设置为546nm。分将1ml超纯水和实施例1制备的peg-nipaam-paam溶液置于比色皿中依次放入分光光度计的比色皿样品室里的架子里。以超纯水的吸光值调零，测量实施例1制备的peg-nipaam-paam溶液在20℃-60℃中的吸光值。
2、实验结果
如图6所示，由图6a的紫外分光光度法实验结果可以看出，五组不同的比例的nipaam、peg和paam制备得到的peg-nipaam-paam在30℃至36℃之间时时的斜率最大，即合成的新型温敏材料的最低临界溶液温度(lcst)为30℃至36℃。
其中，质量比例为nipaam：peg-ac：paam-ac＝45：2：3和nipaam：peg：aam＝45：2：5的两组材料lsct约为31℃，nipaam：peg：paam＝45：2：1的材料lcst约为33℃。nipaam:peg:paam＝45：2：2和nipaam：peg：paam＝45：2：4的材料的lcst约为35℃。
初步说明材料可满足在37℃的温度下材料收缩，细胞吸附生长，温度低于20℃，材料水合溶胀，细胞片完整脱附。如图6b所示，peg-nipaam-paam水溶液在lcst之下为水合状态，溶液透明。当温度高于lcst，材料缩合脱水，溶液浑浊。说明实施例1制备得到的温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam的温敏特性满足后续细胞生长与脱附的需求。
实施例3温敏聚合物peg-nipaam-azphpaam对细胞脱附的影响
一、实验方法
为了证实合成的实施例1制备得到的pst-peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α细胞培养板能够满足细胞生长合脱附要求，以及不同浓度的温敏材料对细胞生长于脱附的影响，选择使用上皮样贴壁生长的mcf-7探究温敏材料的效果。设置了3种不同浓度的温敏材料(peg-nipaam-azphpaam)水溶液紫外光接枝的pst细胞培养板分别为0.5mg/ml、1mg/ml和10mg/ml，同时设置了没有接枝温敏材料的pst细胞培养板空白对照组，各组igf-1/tnf-α的量都是一样的。
1、mcf-7细胞复苏
离心管加入含新生牛血清的dmem培养基5ml。从-80度冰箱中取出mcf-7细胞冻存管，迅速置于37℃水浴1min至融化。打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。1000rpm离心4min，弃上清。细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。
2、mcf-7细胞传代培养
吸去培养瓶中原有培养液，加入2mlpbs溶液洗去残留的旧培养基。向瓶内加入1ml胰蛋白酶轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。计数，再根据分传瓶数补加至4ml新生牛血清dmem培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，拧紧后再稍回转，以利于co2气体的进入，将培养瓶放回co2培养箱。
3、细胞脱附实验
将接有实施例1制备的温敏材料peg-nipaam-azphpaam-igf-1/tnf-α的十二孔细胞板浸入75％酒精消毒1分钟，取出用pbs洗涤30min后置于紫外灯下消毒30min小时。设置空白组(未接peg-nipaam-azphpaam的孔)和对照组(接枝有0.5mg/ml、1mg/ml、10mg/ml的peg-nipaam-azphpaam的孔)，igf-1/tnf-α的量实验组都是一样的。将mcf-7接种于十二孔细胞板上培养，待细胞长至融合状态后，吸出旧的培养基，每孔加入刚从4℃冰箱中取出含新生牛血清的dmem培养基1ml，轻轻晃动孔板几次，之后将孔板放置在显微镜下持续观察拍摄细胞的脱附过程。
二、实验结果
如图7所示，当温度高于实施例1制备的温敏材料peg-nipaam-azphpaam的lsct(约31℃)的37℃下，四组细胞培养板均能满足细胞的贴壁生长。将细胞置于高于温敏材料lsct的10℃环境的冰箱中保温30分钟后，轻拍细胞培养板，发现接枝有1mg/ml和10mg/ml实施例1制备的温敏材料peg-nipaam-azphpaam的细胞培养板出现了较大区域的空白，细胞板的细胞密度明显下降，这说明接枝有实施例1制备的温敏材料peg-nipaam-azphpaam的细胞培养板在温度低于lcst时这些空白区域的细胞脱离了细胞培养板，成功实现细胞脱附。还出现了部分的细胞片。细胞片的形态与norikoy和teruoo在1990年时的细胞片类似。
并且1mg/ml组的左上角与右下角以及10mg/ml组的中部有颜色较深的脱落细胞片，这些细胞间仍然通过ecm相互连接在一起。接枝有0.5mg/ml的实施例1制备的温敏材料peg-nipaam-azphpaam和空白对照组的细胞培养板空白区域较少说明仅有少量或没有细胞脱落，是因为温敏材料浓度太低，只能满足细胞的吸附生长，不能满足低温自行脱落的条件。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
