本申请涉及病毒体外核酸检测
技术领域：
，特别涉及一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物及其试剂盒。
背景技术：
：非洲马瘟(africanhousesickness,ahs)是由呼肠病毒科的双股rna环状病毒属引起的一种马属动物非接触性急性或亚急性传染病，通过库蠓等吸血昆虫叮咬传播，主要症状为发热、皮下水肿和病毒血症，严重时伴有组织和脏器出血，马最易感，病死率可达95％。ahs的死亡率与感染动物的种类、病毒的血清型或株型相关。马属动物中马最为敏感，死亡率为50％～95％，其次为骡，死亡率约50％。在ahs呈地方性流行的非洲地区，驴的抵抗力较强，仅呈亚临床感染。在欧洲和亚洲国家，驴对ahsv中等敏感，死亡率为10％。到2020年4月，泰国已有一百多匹马死于非洲马瘟，最近疫点离我国边境直线距离不足800公里。而且，我国已在国内检出非洲马瘟传播媒介昆虫，疫情传入我国的风险较高，我国马属动物均易感，疫情传入我国后的暴露风险高、后果和损失将非常严重。ahsv的检测方法有快速抗原捕捉elisa方法、pcr法、病毒的细胞培养和乳鼠接种试验法。除pcr法外，快速抗原捕捉elisa方法、病毒的细胞培养和乳鼠接种试验法，操作复杂，检测时间长。荧光pcr技术作为一种成熟的核酸检测方法，特异性强，敏感性高，可在短时间内完成样本的检测。但目前相关的采用荧光pcr技术检测非洲马瘟病毒的试剂盒灵敏度不高，容易出现假阴性结果。所以，研制开发一种供兽医诊断使用的高灵敏度的非洲马瘟病毒荧光rt-pcr检测试剂盒具有现实意义。技术实现要素：针对相关技术中检测非洲马瘟病毒试剂盒的灵敏度不高的问题，本申请提供一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物及其试剂盒。第一方面，本申请的一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，是通过以下技术方案得以实现的。一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，包括上游引物、下游引物和检测探针；上游引物序列如seqidno.1所示；下游引物序列如seqidno.2所示；检测探针序列如seqidno.3所示。通过采用上述技术方案，本申请针对非洲马瘟病毒结构蛋白7基因区域的高度保守区设计了特异性的引物和探针序列，设计的引物能够与非洲马瘟病毒的核酸结合，从而特异性的指示待测样品中是否存在非洲马瘟病毒。而且，本申请设计得到的引物和探针不会发生相互配对或自我配对的情况，提高了引物和探针的有效性和检测的灵敏度。可选的，所述核酸组合物还包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针；内标上游引物序列如seqidno.4所示；内标下游引物序列如seqidno.5所示；内标探针序列如seqidno.6所示。通过采用上述技术方案，本申请还针对目的基因组的内标设计了引物和探针，实现同时对ahsv靶基因及外源性目的基因的扩增，可对整个检测过程进行质量监控，保证检测结果的有效性。可选的，所述检测探针序列和内标探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，检测探针序列和内标探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。通过采用上述技术方案，本申请检测探针和内标探针的两端分别引入了荧光报告基团和荧光淬灭基团。在dna聚合酶不进行催化反应时，检测探针一端的荧光淬灭基团能够淬灭检测探针另一端的荧光报告基团，反应体系中无荧光信号产生；而当dna聚合酶进行催化反应时，dna聚合酶的5’外切酶活性能够对检测探针进行酶切，使荧光报告基团与荧光淬灭基团相互分离，荧光淬灭基团无法再淬灭荧光报告基团，荧光报告基团得以报告荧光信号并被监测系统监测和收集，并且随着pcr反应的不断进行，荧光信号也不断积累增加，最终可通过系统收集的荧光信号强度来判断样本中是否存在目的基因，从而实现对检测样本中是否存在非洲马瘟病毒的判断。可选的，荧光报告基团选用fam或rox基团；荧光淬灭基团选用mgb基团。优选的，检测探针的5’端采用fam基团修饰，3’端采用mgb1基团修饰；内标探针的5’端采用rox基团修饰，3’端采用mgb2基团修饰。通过采用上述技术方案，本申请检测探针和内标探针的5’端采用不同的荧光报告基团标记，3’端采用不同的荧光淬灭基团标记，可以将待测基因与内标进行有效区分，目标基因的检测不会受到干扰，从而保证了检测结果的准确性。第二方面，本申请提供一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，是通过以下技术方案得以实现的。一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，包括上述的核酸组合物。通过采用上述技术方案，本申请试剂盒利用一步法实时荧光rt-pcr技术，以非洲马瘟病毒结构蛋白7基因区域的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及探针，通过检测荧光信号的变化，对样本中的非洲马瘟病毒核酸进行定性检测。同时设计内标，可对整个检测过程进行质控。本申请的非洲马瘟病毒荧光rt-pcr检测试剂盒敏感性、特异性和可重复性优异，检测结果准确可靠，检测方法步骤简单，检测过程耗时短，提高了检测效率。可选的，所述试剂盒中，上游引物和下游引物的终浓度均为400nmol/l；检测探针的终浓度为200nmol/l。通过采用上述技术方案，本申请通过实验确定了最优的引物浓度和探针浓度，有效降低了由于引物浓度过高引发错配而导致非特异扩增的概率，同时也减少了由于引物浓度过低影响pcr产物生成的情况的发生。另外，荧光探针的浓度对ct值及荧光响应强度值均有一定影响，可直接影响荧光定量结果的好坏，所以，本申请同时对探针的浓度进行了优化。可选的，所述试剂盒中，内标上游引物和内标下游引物的终浓度均为80nmol/l；内标探针的终浓度为40nmol/l。通过采用上述技术方案，本申请还对内标引物和探针的浓度进行优化，从而更好的指示检测结果的有效性，更好的达到对检测过程的质量控制，提高检测结果的可信度。可选的，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、酶混合物、dntp。通过采用上述技术方案，本申请试剂盒还包括逆转录及荧光pcr反应所需的所有试剂，其中酶混合物用于催化逆转录反应以及pcr反应的进行，pcr缓冲液用于提供扩增反应最适的反应条件，dntp用于提供反应原料，在上述试剂的共同作用下，实现了对待测样本中非洲马瘟病毒的定性和定量分析。可选的，所述酶混合物包括dna聚合酶和逆转录酶。通过采用上述技术方案，本申请的逆转录酶可以将待测样本中的rna反转录成cdna，cdna在dna聚合酶的作用下进行pcr反应，从而实现目的基因的扩增，达到检测待测样品中是否存在非洲马瘟病毒的目的。综上所述，本申请具有以下有益效果：1、本申请针对非洲马瘟病毒结构蛋白7基因设计了高度特异性的引物和检测探针，可以特异性的检测待测样本中的非洲马瘟病毒，且与马脑炎病毒等8种病原体无交叉反应；2、本申请针对目标基因进行引物和探针设计的同时还设计了内标的引物和探针，从而实现对整个检测过程的质量控制；3、本申请含有上述引物探针的试剂盒灵敏度高，能够对含有103copies/ml的病毒样本进行检测，降低了假阴性发生的概率；4、本申请利用一步法实时荧光rt-pcr技术，检测步骤简单，检测过程耗时短，检测效率高。附图说明图1是本申请试剂盒采用不同浓度的上、下游引物rt-pcr扩增得到的实验结果图(引物浓度依次为：a：0.4μmol/l；b：0.6μmol/l；c：0.8μmol/l；d：0.20μmol/l；e：1.0μmol/l)；图2是本申请试剂盒采用不同浓度的检测探针rt-pcr扩增得到的实验结果图(探针浓度依次为：a：0.2μmol/l；b：0.4μmol/l；c：0.8μmol/l；d：0.01μmol/l)；图3是本申请试剂盒采用不同浓度的内标引物rt-pcr扩增得到的实验结果图(曲线从上到下对应浓度分别为60nmol/l，80nmol/l，100nmol/l，200nmol/l；每个浓度两个平行)；图4是本申请试剂盒采用不同浓度的内标探针rt-pcr扩增得到的实验结果图(曲线从上到下对应浓度分别为40nmol/l，30nmol/l，50nmol/l，6nmol/l；每个浓度两个平行)；图5是本申请试剂盒对梯度稀释阳性样本的检测结果图；图6是本申请试剂盒对103copies/ml阳性样本重复检测10次的结果图；图7是本申请试剂盒对102copies/ml阳性样本重复检测10次的结果图；图8是本申请试剂盒对8种病原体的检测结果图；图9是本申请试剂盒对精密度参考品的检测结果图；图10是本申请试剂盒对最低检出限参考品的检测结果图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。本申请的内标为含荧光素酶ic目的基因片段的质粒菌。实施例1将ncbi上公布的非洲马瘟病毒结构蛋白7基因区域的高度保守区作为靶区域，应用引物设计软件设计特异性引物及探针，同时设计内标引物和探针。引物和探针序列如表1所示。表1引物、探针序列信息本申请探针的5’端可选用fam荧光基团、rox荧光基团、hex荧光基团、cy3基团及cy5基团中的任意一种标记；优选地，检测探针的5’端选用fam荧光基团标记，内标探针的5’端选用rox荧光基团标记。检测探针的3’端采用mgb1基团标记，内标探针的3’端采用mgb2基团标记。实施例2一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，包括实施例1中记载的引物和探针、pcrbuffer、dna聚合酶、c-mmlv逆转录酶、dntps和depch2o。(1)引物浓度的确定在pcr体系中，本实施例设置5个浓度的引物，分别为200nmol/l，400nmol/l，600nmol/l，800nmol/l，1000nmol/l，上下游引物浓度相同。具体操作程序如下：配制含不同浓度引物的pcr反应液，pcr反应液还包含5×neoscriptrtpremixbuffer，200nmol/l检测探针，80nmol/l内标上、下游引物，40nmol/l内标探针，10×neoscriptrtasemix，非洲马瘟病毒阳性灭活样本和阴性样本(无酶无核酸水)15.0μl，并加灭菌水补齐至30μl。将上述成分混匀后，在bioradcfx-96实时pcr检测仪上进行荧光pcr扩增，反应参数为：表2荧光rt-pcr反应条件实验结果参见图1，结果表明，当引物浓度过低或过高时，扩增效率差，而且荧光响应强度低；当引物浓度为400nmol/l时，其扩增效率最好。(2)检测探针浓度的确定在pcr体系中，本实施例设置了4个浓度的检测探针，分别为800nmol/l、400nmol/l，200nmol/l，100nmol/l。具体操作程序如下：配制含不同浓度检测探针的pcr反应液，pcr反应液还包含5×neoscriptrtpremixbuffer，400nmol/l上、下游引物，80nmol/l内标上、下游引物，40nmol/l内标探针，10×neoscriptrtasemix，非洲猪瘟病毒阳性灭活样本和阴性样本(无酶无核酸水)15.0μl，并加灭菌水补齐至30μl。将上述成分混匀后，在bio-radcfx-96实时pcr检测仪上进行荧光pcr扩增，反应参数与上述记载相同。实验结果参见图2，结果表明不同的探针浓度对ct值及荧光响应强度值(rfu)均有一定影响，当探针浓度与引物浓度之比为1:2时，其荧光响应强度越高，最终确定检测探针浓度为200nmol/l。(3)内标的优化本实施例配制含不同浓度内标引物的pcr反应液，内标引物浓度依次为60nmol/l，80nmol/l，100nmol/l，200nmol/l(每个浓度两个平行)，上下游引物浓度相同；pcr反应液还包含5×neoscriptrtpremixbuffer，400nmol/l上、下游引物，200nmol/l检测探针，40nmol/l内标探针，10×neoscriptrtasemix，内标和阴性样本(无酶无核酸水)15.0μl，并加灭菌水补齐至30μl。实验结果参见图3，结果表明当内标引物浓度为60nmol/l时，内标扩增曲线较低；当内标引物浓度为80nmol/l以上时，内标扩增效果较好。而低浓度样本扩增效率随内标引物浓度加大而降低。综合考虑，内标引物终浓度选用为80nmol/l。采用与确定检测探针浓度相同的方法，确定内标探针的浓度，探针浓度依次为40nmol/l，30nmol/l，50nmol/l，6nmol/l(每个浓度两个平行)。实验结果参见图4，结果表明不同的探针浓度对ct值及荧光响应强度值(rfu)均有一定影响，当探针浓度与引物浓度之比为1:2时，其荧光响应强度越高，最终确定内标探针浓度为40nmol/l。综上，本实施例优化后的rt-pcr反应体系参见表3。表3质控标准表4对照品fam通道rox通道阴性对照未检出ct值≤36阳性对照ct值≤36无关以上条件必须同时满足，否则，本次实验无效，应重新进行检测。结果判定表5[1]建议对“复检”样本进行浓缩处理。将样本涡旋充分，取1ml，12000rpm4℃离心5min，小心移除上清，留底层约200μl作为复检样本。[2]复检结果若有明显扩增曲线，则判定结果为阳性；若无明显扩增曲线，则判定结果为阴性。性能检测(1)最低检出限将非洲马瘟病毒阳性灭活样本进行梯度稀释，稀释为5个梯度，即102copies/ml-106copies/ml，采用实施例2优化后的荧光pcr反应体系进行检测，每个浓度样品设置3个平行试验，再对检测限附近的两个梯度进行10次重复检测确定试剂盒的灵敏度。实验结果参见表6和图5-7。梯度稀释的阳性样本检测结果显示，浓度为103copies/ml～106copies/ml的阳性样本都能够检测出阳性；浓度为102copies/ml的阳性样本不能全部检出为阳性(表6和图5)。103copies/ml阳性样本重复检测10次结果为阳性(图6)，102copies/ml阳性样本重复检测10次结果不全为阳性(图7)。以上实验结果表明，本申请试剂盒的最低检出限为103copies/ml，灵敏度较高，有效降低了假阴性的发生率。表6灵敏度实验结果(2)特异性检测采用本申请实施例2的试剂盒对马脑炎病毒、出血性紫癜/血小板减少紫癜、马病毒性动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马流行性淋巴管炎、马流行性感冒病毒以及巴贝斯虫、伊氏锥虫病等8种确认为阳性的病原体(由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所提供)进行检测，8种病原体用te缓冲液稀释10倍，在bio-radcfx96实时pcr检测仪上进行荧光pcr扩增，分析本申请试剂盒扩增体系的特异性。实验结果如图8所示，8种病原体用本申请实施例2试剂盒进行检测，检测结果均为阴性。以上实验结果表明，本申请实施例2试剂盒与马脑炎病毒、出血性紫癜/血小板减少紫癜、马病毒性动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马流行性淋巴管炎、马流行性感冒病毒以及巴贝斯虫、伊氏锥虫病等8种病原体无交叉反应，特异性好。(3)重复性检测采用本申请实施例2试剂盒对购于非洲马瘟标准实验室pirbright的精密度参考品和最低检出限参考品(103copies/ml)进行检测，每个样本检测10次。实验结果参见表7和图9-10。实验结果表明，每个样本进行10次检测得到的ct值间的cv值均小于1％，具有较高的精密度，从而提高了每次检测结果的准确性、一致性和可靠性。表7精密度参考品和最低检出限参考品的ct值统计结果本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。序列表<110>百沃特（天津）生物技术有限公司<120>一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物及其试剂盒<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1ccagtaggccagatcaacag20<210>2<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>2ctaatgaaagcggtgaccgt20<210>3<211>18<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>3gctaggagcctaccacta18<210>4<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>4aaagtaaatgcgccgtcgtc20<210>5<211>20<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>5gaatacgggatcactgttag20<210>6<211>18<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>6aggctttaagccttcgaa18当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，其特征在于：包括上游引物、下游引物和检测探针；
上游引物序列如seqidno.1所示；
下游引物序列如seqidno.2所示；
检测探针序列如seqidno.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，其特征在于：所述核酸组合物还包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针；
内标上游引物序列如seqidno.4所示；
内标下游引物序列如seqidno.5所示；
内标探针序列如seqidno.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，其特征在于：所述检测探针序列和内标探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，检测探针序列和内标探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物，其特征在于：荧光报告基团选用fam或rox基团；荧光淬灭基团选用mgb基团。
5.一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一所述的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，上游引物和下游引物的终浓度均为400nmol/l；检测探针的终浓度为200nmol/l。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，内标上游引物和内标下游引物的终浓度均为80nmol/l；内标探针的终浓度为40nmol/l。
8.根据权利要求5所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括pcr缓冲液、酶混合物、dntp。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测非洲马瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述酶混合物包括dna聚合酶和逆转录酶。
技术总结本申请公开了一种用于检测非洲马瘟病毒的核酸组合物及其试剂盒，属于病毒体外核酸检测技术领域。所述核酸组合物包括上游引物、下游引物和检测探针，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，检测探针序列如SEQ ID NO.3所示。含有上述核酸组合物的试剂盒能够特异性的检测待测样品中非洲马瘟病毒，与马脑炎病毒等8种病原体无交叉反应；且灵敏度高，可达103copies/mL，重复性好，质量可控，整个RT‑PCR检测过程操作简单，检测时间短，检测效率高。
技术研发人员：马增彬;杨若松;龚雅云;田小;杨天意;梁健平
受保护的技术使用者：百沃特(天津)生物技术有限公司
技术研发日：2021.03.30
技术公布日：2021.07.02
