本发明属于分子鉴定
技术领域：
，具体涉及一种鉴定沉香的dna条形码、试剂及其检测方法与应用。
背景技术：
：沉香是瑞香科(thymelaeaceae)沉香属(aquilaria)植物含树脂的香心材制成的，也是一种传统名贵药材和天然香料。沉香性味辛、苦，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于治疗肾虚气逆喘急、胃寒呕吐呃逆、胸腹胀闷疼痛等。梁代陶弘景的《名医别录》将其列为上品。有研究发现，沉香具有镇痛、镇静、抗炎、抗菌、神经保护等活性。在我国每年用于临床的沉香量约1000吨。沉香参与了八味清心沉香散、再造丸、沉香化气丸等160种中成药，其中有4种中成药完全依赖沉香中的土沉香。沉香能够作为一种香料是由于沉香树长期感染一种霉菌后会分泌树脂并浸润沉积于木质部中散发出特有的香味。高品质的沉香一般需要30年结聚形成。目前，沉香的市场价值预计60-80亿美元，后续几年还会增长。沉香药材分为国产沉香和进口沉香。进口沉香的香气比国产的更强烈持久且被直接用于药用目的，导致了市场上经常出现价格相对较高的、各种形状、香气各异的沉香。由于沉香存在巨大的商业利润和非法贸易，使得世界各地的沉香资源越来越少。现在沉香属大部分植物已列入世界自然保护联盟(iucn，2002)濒危植物红皮书中的“受威胁(threatened)”等级，属于世界限制贸易的野生濒危树种。目前市场上出现了人工造香技术生产的沉香，制伪情况严重，这对于《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)科学和管理部门评估沉香来源及确定贸易中的沉香来自栽培树木(合法)还是天然树木(非法)是非常重要。虽然根据沉香的蒴果和叶的特征可以很容易地识别出沉香属的栽培品种，但对于一般沉香，不同沉香鉴定更多的依赖于繁殖部位，尤其是果实和花萼的特征。然而市场上沉香以木制品形式存在，其不能作为沉香鉴定或识别产地的依据。化学成分分析技术是评估沉香材料来源的方法之一。沉香属的化学成分表明，来自不同沉香植物的沉香有一些共同的化合物，也有一些不同的化合物。化学成分的差异虽然在一定程度上有助于区分栽培沉香和野生沉香，但基于化学组分聚类的opls-da模型的预测能力通常不高，甚至不到50％，此外，其指标成分的含量在不同的生物来源中被证明是非常不一致的，以及没有果实和花卉，市场上的沉香木制品在品种层面上难以识别，直接增加了化学分析的难度。近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍稀物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是沉香鉴定领域的关键技术之一。技术实现要素：本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种dna条形码，能够准确、快速、特异地鉴定沉香的来源。本发明还提出一种鉴定沉香来源的试剂。本发明还提出一种上述试剂的应用。本发明还提出一种鉴定沉香来源的试剂盒。根据本发明的一个方面，提出了一种dna条形码，所述dna条形码为核苷酸序列如seqidno.1所示的沉香matk序列片段。在本发明的一些实施方式中，所述dna条形码序列上存在可用于分子标记的8个多态性位点，所述多态性位点分别位于核苷酸序列seqidno.1上第202位碱基处，多态性为g或t；第249位碱基处，多态性为c或a，第435位碱基处，多态性为t或g；第470位碱基处，多态性为t或g；第547位碱基处，多态性为g或c；第576位碱基处，多态性为a或g；第640位碱基处，多态性为g或a；第684位碱基处，多态性为t或g。根据本发明的第二方面，提出了一种鉴定沉香来源的试剂，所述试剂包括对matk序列特异性扩增引物，所述引物包括序列如seqidno.2所示的上游引物和序列如seqidno.3所示的下游引物。在本发明的一些实施方式中，所述鉴定沉香来源的试剂还包括序列如seqidno.4及seqidno.5所示的第一引物对及序列如seqidno.6及seqidno.7所示的第二引物对。在本发明的一些实施方式中，所述第一引物对用于鉴定国产沉香。在本发明的一些实施方式中，所述第二引物对用于鉴定进口沉香。根据本发明的第三方面，上述试剂在在鉴别沉香中的应用。在本发明的一些实施方式中，上述试剂在鉴别国产沉香与进口沉香中的应用。在本发明的一些实施方式中，上述试剂在制备鉴定沉香来源试剂中的应用。根据本发明的第四方面，提出了一种鉴定沉香方法，所述方法包括如下步骤：对上述dna条形码对待鉴别沉香样本进行检测。在本发明的一些实施方式中，一种鉴定沉香方法，所述方法包括如下步骤：s1、提取待鉴别样本的基因组dna；s2、用上述的试剂扩增所述的待鉴别样本的基因组dna，得扩增产物；s3、对扩增产物进行测序，与seqidno.7进行比对，判断沉香来源。在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，判断沉香来源的具体方法为：若待测沉香的matk序列与seqidno.7比对，第249为碱基为c，则鉴定为国产沉香；若待测沉香的matk序列与seqidno.7比对，第249位碱基为a，则鉴定为进口沉香。在本发明的一些实施方式中，所述国产沉香包括白木香aquilariasinensi和云南沉香aquilariayunnanensis。在本发明的一些实施方式中，所述进口沉香包括东南亚国家出产的野生或栽培的沉香品种。在本发明的一些实施方式中，所述进口沉香品种为aquilariaapiculata、aquilariabrachyantha、aquilariacitrinicarpa、aquilariacumingiana、aquilariadecemcostata、aquilariafilaria、aquilariamalaccensis、aquilariaparvifolia、aquilariaurdanetensis、aquilariamicrocarpa、aquilariabeccariana、aquilariabanaensis、aquilariacrassna、aquilariarugosa的一种。在本发明的一些实施方式中，所述引物扩增体系为：2×premixpcrhs12.5μl，引物0.5μl，模板dna10ng，ddh2o补至25μl。在本发明的一些实施方式中，所述引物扩增条件为：94℃预变性2～5min；98℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸7min，12℃终止反应。在本发明的一些实施方式中，上述方法还包括如下步骤：用上述序列如seqidno.4及seqidno.5所示的第一引物对及序列如seqidno.6及seqidno.7所示的第二引物对扩增待鉴别样本的基因组dna；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若产物的条带大小约为300bp，则为国产沉香，若产物的条带大小约为600bp，则为进口沉香。根据本发明的第五方面，提出了一种试剂盒，包括检测权1或2所述dna条形码的试剂，所述试剂优选为seqidno.1所示的上游引物和序列如seqidno.2所示的下游引物，所述试剂盒中优选还包括zgcx.f/r、jkcx.f/r。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒在制备鉴定沉香来源的试剂中的应用。根据本发明方案实施方式的一种鉴定沉香来源的dna条形码、试剂及其检测方法与应用，至少具有如下有益效果：通过本发明方案制备得到的dna条形码能快速区分进口沉香和国产沉香，与以往的形态学分析法相比较，它具有省时、省力、准确性高的优点，对种质资源的鉴定、保护及育种工作都具有重要的意义。将这种方法应用在育种上会大大增加育种效率，在此过程中还可以很好的区分品种，甚至可以发现新品种。结合dna条形码技术的研究，将成为一种非常有效的分子标记，这也将会在作物的遗传育种上发挥重大的作用，同时本申请方案还提出了两对扩增鉴定的沉香叶绿体基因组dna引物来鉴定国产沉香和进口沉香，准确性高，操作简便，检测时间短，为种质资源的鉴定及保护提供了便利的方法。附图说明下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：图1为本发明实施例2中的鉴定沉香属植物的特异核苷酸位点图；图2为本发明实施例2中的不同来源沉香基因组的系统发育树图；图3为本发明实施例2中的matk核苷酸序列图；图4为本发明实施例2中matk序列对36个沉香属植物的鉴定图；图5为本发明实施例3中pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1筛选用于沉香鉴定的基因位点及引物设计收集大量已测沉香叶绿体基因片段、核基因片段筛选沉香植物中高变的基因片段的初始数据集，然后对它们的单倍型和snp％进行计数和分析，以初步评估物种基因分型。根据基因片段将数据集分组，保留基因片段至少包含5个种以上，然后使用bioedit软件进行序列比对和聚类分析。对不同沉香进行多次比对，统计单倍型和多态位点。matk参考序列的ncbi序列号为>ky927336，切割头尾后，用mega5.0计算种内距离和种间距离，以及比对序列中的缺口，根据筛选出的多态性位点来设计特异性引物。matk序列片段的核苷酸序列如seqidno.1所示。引物设计采用primer5.0。dna条形码分析首先将每条序列与ncbi下载的所有序列进行比对，发现并提取绝对同源区域，进行通用引物设计。而非同源区域也需要专门设计引物。针对上述条形码和特异性位点的引物设计也可以在对应的dna反向序列的相应位置进行设计。从图1中可以看出，从matk序列中筛选出8个snps位点可以用来鉴定国产沉香和进口沉香，国产沉香(白木香、云南沉香)以及进口沉香(其他12个物种)特异性的位点在图上进行了标识。其中第2、3、8号位点适合设计特异性引物来区分上述国产沉香和进口沉香。为了保证扩增的稳定性和一致性，本研究考虑并设计引物长度为18～25nt。将设计好的引物送到华大基因香港合成，并将分子量为2od的引物粉末放入1.5mlep管中送回。设计的引物核苷酸序列如表1所示。表1引物核苷酸序列引物名称核苷酸序列(5’～3’)cxs1atccgctgtgataatgag(seqidno.2)cxs2cttggttcaagcctttcg(seqidno.3)zgcx.fatatgtgagtgcgaatta(seqidno.4)zgcx.ragcctagaaagtcaagag(seqidno.5)jkcx.fcaatcagagaaatcattgga(seqidno.6)jkcx.rccatatggaaatcttggt(seqidno.7)实施例2沉香的鉴定一种沉香的鉴定方法，包括如下步骤：1、样品dna的提取待测样品：在中山市采集了21批不同性状的沉香木或叶片新鲜样品；从肇庆市东兴市、崇左市、鼎湖山收集了13批市面上的沉香药材，包括澳门海关，共收集了36批沉香药材供研究使用。从ncbi上下载matk的不同序列，用bioeditor软件进行分析。(1)沉香木材样品dna的提取1)取2g待测样品，将待测样品浸泡在75％乙醇中5min，取出，放置在无菌环境中风干；2)将风干的材料放置在2.0ml的eppendorf离心管中，最后在液氮处理下用tissuelyserii仪器(qiagen，德国)研磨成粉末。研磨后的粉末转移至50ml离心管中，然后加入5ml65℃预热的3×ctab提取液，65℃水浴2h，期间每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述3×ctab提取液配方为：4％ctab，1.4mol/lnacl，100mmol/ltris-hcl，1％pvpp，25mmol/ledta，2％β-巯基乙醇，ph8.0；体系中的“％”代表体积分数；3)水浴结束后，12000rpm离心5min，取上清分装在1.5ml离心管中，用等体积氯仿-异戊醇(24：1)，tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)和氯仿-异戊醇先后各抽提一次，10000rpm离心5min；4)取上清液至新1.5ml离心管中，加0.8倍体积异丙醇和0.2倍体积3mol/l醋酸钠，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min；5)弃上清液，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复洗涤2-3次；6)洗涤结束后，将沉淀自然风干，加100μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品的dna。(2)沉香叶片样本dna的提取先将沉香叶片用75％乙醇消毒，无菌环境下切成小块，放入2.0ml的eppendorf管中，在液氮处理下用tissuelyserii仪器(qiagen，germany)研磨成粉末。dna的提取采用植物dna分离试剂盒(plantminikit，qiagen)。2、matk序列片段的扩增(1)引物cxs1和cxs2的序列如表1所示。(2)pcr反应体系2×premixpcrhs12.5μl，引物0.5μl，模板dna10ng，ddh2o补至25μl。(3)pcr扩增参数94℃预变性5min；98℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸7min，12℃终止反应。3、pcr产物纯化、连接及转化采用dna凝胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)对pcr扩增产物进行割胶回收。matk序列的pcr扩增产物从1％的琼脂凝胶中割胶纯化。纯化产物连接到pmd18-t-vecter(takara)，连接产物转化到escherichiacolijm109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择。4、matk序列测定挑取单克隆菌落送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序引物与上述pcr引物一致。5、matk序列分析(1)从ncbi上下载了已报道的沉香(aquilaria)和同属瑞香科gyrinops、gonystylus、wikstroemia、phaleria和matk序列，并根据实验数据对测序中引入的错误序列进行了修正或删除。使用clustalxversion1.83进行序列比对，使用dnapversion4.20和phaseversion2.1进行基因单倍型的确认和筛选。网络版本4.6软件中的median-joining程序用于构建基因单倍型网络图。从ncbi网站上下载具有特定起源信息的序列，并与已获得的序列相结合，并使用mega7.0对所有这些序列进行了分析，通过计算种间k2p进化距离来构建系统进化树，该距离是根据经常使用的最大似然和邻域进行的-连接方法(bootstrap＝1000)，然后将这些不同的序列依次分类为不同的组，并在系统发育树结果中显示，系统发育树的结果如图2所示，沉香14个物种的各个国家分布情况如表2所示。表2沉香14个物种的各个国家分布情况(2)将实验获得的matk序列和从genbank下载的matk序列，一起导入mega(版本7.0)软件进行比对，切除引物端后，去除中间存在高变的插入或缺失的序列，得到用于机器学习的数据集，matk区序列如图3所示。(3)以barcodingwithlogic作为机器学习方法，将数据集随机分成训练集和测试集，其中训练集占总集合的80％，测试集占总集合的20％，进行1000次迭代计算，获得鉴定沉香属植物的特异核苷酸位点，实验结果如图1所示。实验结果如图1所示，从图中可以看出表明， 684位点的胸腺嘧啶和在 435位点的鸟嘌呤具有用于药用沉香的标记功能， 249位点的胞嘧啶可以用作鉴定国产沉香的辅助标记。6、36个沉香属植物的鉴定实验结果如图4所示，从图中可以看出，训练集和测试集对36个沉香属物种的鉴定成功率均为100％。可以准确鉴定36个沉香属植物的来源。实施例3：国产沉香和进口沉香的测试实验(1)特异性引物对国产沉香和进口沉香的测试实验选取国产沉香a.sinensis以及云南沉香a.yunnanensis和进口沉香importedagarwood，其基因组dna的提取实验如实施例1所示，两对引物zgcx.f、zgcx.r和jkcx.f、jkcx.r来扩增需鉴定的沉香叶绿体基因组dna，pcr扩增反应体系为：2×premixpcrhs12.5μl，10nm引物0.5μl，模板dna10ng，ddh2o补至25μl，pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min，98℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸30s，72℃终延伸7min，12℃终止反应，共30个循环。对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，实验结果如图5所示，从图中可以看出，与dnamarker比较，产物的条带大小约为300bp，为国产沉香，产物的条带大小约为600bp，为进口沉香。因此，使用这两对特异性引物可以清楚地区分国产沉香和进口沉香。(2)沉香matk参考序列对国产沉香和进口沉香的测试实验选取国产沉香a.sinensis和进口沉香importedagarwood进行检测，实验步骤与实施例2相同。根据机器学习结果可知，训练集的鉴定成功率为100％，从训练集中获取的鉴别沉香属植物的核苷酸规则如图3所示，从图中可以看出：若第249为碱基为c，则鉴定为国产沉香aquilariasinensis；若第249位碱基为a，则鉴定为进口沉香importedagarwood。综上所述，通过本发明方案制备的检测沉香来源的试剂，可以高效的区分国产沉香和进口沉香，同时还可以根据本发明方案得到的matk序列，快速、准确的区分沉香的来源，为种质资源的鉴定及保护提供了便利的方法。上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属
技术领域：
普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。序列表<110>澳门科技大学<120>一种鉴定沉香的dna条形码、试剂及其检测方法与应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>8<211>886<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cgtacagtacttttgtgtttacgagccaaagttttaagacaagaaagccgaagtatatat60tttattcgatacaaaccctttttttttgaggatccgctgtgataatgagaaaaatttctg120catatacgcaaaaatcggtcgataatatcagaatctgatgaatcgacccaagttggctta180ctaataggatgacacgatgcgttacaaaaattcgctttagacaatgatccaatcagagaa240atcattggcatttttgtatctagctttttaatagtattatctattagaaagaagttttct300agcatttgactgcgtaccactgaaggatttaatcgcacatttgaaagatagcctagaaag360tcaagagaatatttgcataattggtttatacggacccctcctgattgagaccacacataa420aaatgatattgccataaattgataaagtaatatttccacttattcatcataagaggcgta480tcgtttgaagcaagaatagattttccttgatatctaacaaaatgtatgaagggatccttg540aacaaggataggttgttctgaaaatcattagaaaaaacttctacaagatgttcgattttt600ccatagaaatagatccgttcaagaaagattgcagaagatgttgatcgtaaatgataggat660tggttacggagaaaaaggaaaattaattcgcactcacatatatgagaattatataggaaa720aaaaagaatcttggattcaaattcaaaatagaaatggatttctttgaagtaataagactc780ttcaaattcaaatactcgtagaaaaaaaaccgtaataaatgcaaaaaagaggcatctttt840aaccagcagcgaaaggcttgaaccaagatttccagatggactgggt886<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atccgctgtgataatgag18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cttggttcaagcctttcg18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atatgtgagtgcgaatta18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agcctagaaagtcaagag18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6caatcagagaaatcattgga20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccatatggaaatcttggt18当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种dna条形码，其特征在于，所述dna条形码为核苷酸序列如seqidno.1所示的沉香matk序列片段。
2.根据权利要求1所述的dna条形码，其特征在于，所述dna条形码序列上存在可用于分子标记的8个多态性位点，所述多态性位点分别位于核苷酸序列seqidno.1上第202位碱基处，多态性为g或t；第249位碱基处，多态性为c或a，第435位碱基处，多态性为t或g；第470位碱基处，多态性为t或g；第547位碱基处，多态性为g或c；第576位碱基处，多态性为a或g；第640位碱基处，多态性为g或a；第684位碱基处，多态性为t或g。
3.一种鉴定沉香的试剂，其特征在于，包括：对沉香matk序列特异性扩增引物，所述引物包括序列如seqidno.2所示的上游引物和序列如seqidno.3所示的下游引物。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括序列如seqidno.3及seqidno.4所示的第一引物对及序列如seqidno.5及seqidno.6所示的第二引物对；所述第一引物对用于鉴定国产沉香；所述第二引物对用于鉴定进口沉香。
5.根据权利要求3～4任一所述的试剂在鉴别国产沉香与外国沉香中的应用。
6.一种鉴别沉香的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使用权利要求1～2任一所述的dna条形码对待鉴别沉香样本进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
s1、提取待鉴别沉香样本的基因组dna；
s2、用权利要求3～4任一所述的试剂扩增所述的待鉴别沉香样本的基因组dna，得扩增产物；
s3、对扩增产物进行测序，与seqidno.7进行比对，判断沉香来源。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3中，判断沉香来源的具体方法为：若待测沉香的matk序列与seqidno.7比对，第249为碱基为c，则鉴定为国产沉香；若待测沉香的matk序列与seqidno.7比对，第249位碱基为a，则鉴定为进口沉香。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用权利要求4所述的第一引物对和/或第二引物对扩增待鉴别样本的基因组dna；对扩增产物进行电泳检测，若产物的条带大小约为300bp，则为国产沉香，若产物的条带大小约为600bp，则为进口沉香。
10.一种试剂盒，包括检测权利要求1或2所述dna条形码的试剂，所述试剂优选为seqidno.1所示的上游引物和序列如seqidno.2所示的下游引物，所述试剂盒中优选还包括zgcx.f/r、jkcx.f/r。
技术总结本发明公开了一种鉴定沉香的DNA条形码、试剂及其检测方法与应用，所述DNA条形码为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的沉香matK序列片段，使用本发明方案得到的DNA条形码能快速区分进口沉香和国产沉香，具有省时、省力、准确性高的优点，对海关进出口沉香的检测、种质资源的鉴定、保护及育种工作都具有重要的意义。
技术研发人员：周华;程春松;范思庆;崔颢;刘智祖
受保护的技术使用者：澳门科技大学
技术研发日：2021.04.21
技术公布日：2021.07.02
