本发明属于生物技术领域，涉及一个针对高侵袭性肿瘤进行分子分型的基因，及该基因在预判高侵袭性肿瘤的发生和转移风险中的应用。
背景技术：
癌症被认为是世界上每个国家的主要死亡原因和延长预期寿命的重要障碍。根据世界卫生组织(who)2019年的估计，在183个国家中，有112个国家中，癌症是年龄小于70岁人类中数一数二的死亡原因，在另外23个国家中癌症的致死率排名第三或第四。癌症作为主要死亡原因的重要性进一步上升。据2020的统计，女性乳腺癌的发生率已经超过肺癌，成为全球范围内最高频发生的癌症类型，在新发的1930万癌症患者中，女性乳腺癌的发生率为11.7％。乳腺癌是全球癌症死亡的第五大原因，2020年有685,000例死亡。在女性中，乳腺癌占四分之一的癌症病例，占六分之一的癌症死亡，在绝大多数国家(185个国家中的159个)的发病率中排名第一，在110个国家中的死亡率中排名第一。
在许多欧美国家中，乳腺癌的发病率在1980年代和1990年代期间迅速增加，然后，在2000年代初，发病率趋于下降或稳定，这在很大程度上归因于更年期激素疗法的使用减少以及筛查参与的平稳期。自2007年以来，欧美国家的发病率呈缓慢上升。欧美国家利用癌症患者随访信息和肿瘤分子标志，发现2007年后新增加的发病率仅限于雌激素受体阳性的癌症，而雌激素受体阴性的癌症的发病率正在下降。因此，随着检测技术的提升，对乳腺癌的检出率也会提升。在我国乳腺癌的发生率同样为第一，但是在我国乳腺癌的致死率低于肺癌。据2015年中国注册的癌症患者信息，约有15％的新发癌症患者为乳腺癌。
乳腺癌是一种高度异质性疾病，致病因素包括遗传因素、激素水平和环境因素等。约有10％-15％的癌症患者具有家族遗传史。随着高度外显肿瘤易感基因brca1和brca2的鉴定，针对brca1和brca2基因的遗传筛查，促进了乳腺癌遗传风险评估和控制。虽然针对乳腺癌的基因筛查已经逐渐变成常规的临床检测方案，但是，目前针对乳腺癌的基因筛查基因只包括少数基因，极大的限制了对肿瘤易感性的评估。
技术实现要素：
本发明针对非brca1/2突变的乳腺癌患者遗传筛查，提供了一个用于评估乳腺癌患癌风险的基因及其检测试剂盒。
本发明提供一个用于乳腺癌患癌风险预测的基因，该基因为recql4基因。
本发明提供一种用于乳腺癌患癌风险和乳腺癌预后分析的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括捕获本发明所述recql4基因的探针。
其中，所述的检测试剂盒较佳地还包括：基因组dna提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂，选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、dna连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、pcr预混液、接头封闭剂、dna封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库pcr引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
其中，所述基因组dna提取试剂为本领域常规的基因组dna提取试剂。
其中，所述文库构建试剂和二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能满足对所得序列构建文库并进行二代测序的要求即可。所述的二代测序为本领域常规的二代测序。
本发明所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。
本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组dna即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织。
本发明所述检测试剂盒适用于乳腺癌遗传风险评估，使用方法如下：
(1)提取血液和组织样本中的基因组dna双链核酸；
(2)将步骤(1)的所述dna双链核酸变性处理得到dna单链，使用捕获探针捕获recql4基因的dna单链；捕获区域如下：染色体编号：chr8；区域位置：144511288-144517833；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。针对捕获对象设计探针为本领域的常用技术手段，探针的序列捕获包括但不限于染色体编号：chr8；区域位置：144511288-144517833；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。
(3)将步骤(2)所捕获的dna单链进行测序，得到血液和组织样本中的核酸序列；
(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，计算组织样本中的recql4基因的变异位点数量，若变异位点数量为0，则为recql4野生型；若变异位点数量大于0，则为recql4突变型，患乳腺癌的概率大。
其中步骤(1-4)所述的提取方法、文库构建、测序方法和基因变异位点计算方法均为本领域常规方法。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明所取得的有益效果是：本发明首次提出了可用于非brca1/2乳腺癌患癌风险预测的基因，同时提供了一种可用于非brca1/2乳腺癌的预后标志物，将recql4基因预后预测模型用于区分预后较差和预后较好的患者。recql4基因突变乳腺癌患者突变压显著提升，由于突变压是免疫治疗预后好的一个重要标志物，提示recql4基因突变乳腺癌患者可能从免疫治疗中获益。
附图说明
图1为recql4突变患者和野生型患者的微卫星不稳定性分值统计图；
图2为乳腺癌患者recql4基因突变状态与乳腺癌患者总体生存时间的分析结果。与recql4野生型组的患者相比，recql4突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。hr(hazardratio)：风险比；ci(confidenceinterval)：置信区间；p值使用logrank检验计算。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列是实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书。
实施例1基因组dna样品的制备和肿瘤突变位点的测定
为检测乳腺癌的肿瘤易感基因，本发明分两个阶段进行分析，第一阶段完成了10例非brca1/2家族遗传型乳腺癌样本的全外显子组测序数据和78例散发乳腺癌样本测序数据的重分析。数据来源于sra数据库。通过第一阶段的肿瘤易感基因分析，进一步结合tcga数据库和cosmic数据库中的高频基因，以及nccn遗传性乳腺癌诊疗指南，本发明设计了一个包括226个基因的基因群(表1)，定制了针对这个基因群的捕获探针，用于第二阶段的测序。第二阶段使用该捕获探针完成了213例乳腺癌组织标本(样本收集于)的靶向测序工作。所有标本收集至浙江大学医学院附属第二医院，为患者手术切除的组织标本，经病理诊断后多余的部分用于测序研究。
表1.基因列表
实施例2鉴定新的乳腺癌易感基因
为鉴定新的乳腺癌易感基因，将78例散发乳腺癌样本与千人基因组(1000genome)数据库中收集的260例东亚人群的女性正常样本进行基于病例-对照的全外显子组关联分析。相对于正常样本，recql4的罕见变异在乳腺癌患者中显著富集p＝0.00064,相对危险度(oddratio)or＝8.96(95％置信区间：1.86-40.53)，具体见表2。提示recql4基因为乳腺癌易感基因，可用于乳腺癌遗传筛查。
表2.东亚人群乳腺癌易感基因突变谱
表中，lrm表示低转移风险(lowriskofmetastasis)，hrm高转移风险(highriskofmetastasis)
实施例3recql4突变可导致患者突变压显著提升
通过msisensor对全外显子组数据进行分析(n＝88)，其中出现recql4拷贝数变异的患者5例，出现recql4点突变的患者4例，我们发现recql4突变患者微卫星不稳定性显著提升(p<0.001)，提示recql4突变患者突变压显著提升(图1)。由于突变压是免疫治疗预后好的一个重要标志物，提示recql4基因突变患者可能从免疫治疗中获益。
实施例4recql4变异状态预测乳腺癌生存模型
生存分析是评价某个因素和患者预后是否存在关联的重要手段。在实施例1的所有数据中(n＝301)，按recql4的变异状态，乳腺癌患者分为两组，一组为recql4变异组，包含简单变异和拷贝数变异，共计56例；另一组为recql4野生组，共计245例。经log-rank检验的结果显示两组之间存在显著差异(p＝0.0057)本发明进一步使用单因素cox比例风险模型评价了recql4基因变异状态和总体生存时间之间的关系，计算得到风险比为1.56(95％置信区间为1.13-2.12),与突变组患者相比，recql4基因野生组患者预后较好，死亡风险更低。因此本发明通过检测recql4基因的突变状态，发现recql4变异的患者总体生存更差(图2)。乳腺癌是一个高度遗传异质性疾病，因此在临床实践中需结合本发明的试剂盒检测结果和其他临床诊疗指南综合判断患者的基因筛查结果。
1.用于乳腺癌遗传筛查的基因，其特征在于，该基因为recql4基因。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述乳腺癌包括：非brca1/2突变乳腺癌。
3.一种如权利要求1所述的基因的检测试剂在制备乳腺癌患病风险预测试剂盒、乳腺癌预后分析试剂盒中的应用。
4.一种乳腺癌遗传筛查的检测试剂盒，其特征在于，所述检测的试剂盒包括：捕获权利要求1中所述基因的探针。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的捕获区域为染色体编号：chr8；区域位置：144511288-144517833；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：基因组dna提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂。
7.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括从检测对象提取检测样本的器械。
8.一种乳腺癌预后分析试剂盒，其特征在于，所述检测的试剂盒包括：捕获权利要求1中所述基因的探针。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的捕获区域为染色体编号：chr8；区域位置：144511288-144517833；区域：外显子区域及外显子内含子交接区域。
10.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：基因组dna提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂。
技术总结