本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物及检测试剂盒。
背景技术：
随着社会的发展，男女成婚年龄、生育年龄不断增长，在生育方面遇到的问题也越来越多。优生少生概念成为社会的主流思想，对新生儿健康的关注度也越来越高。其中，唐氏综合症(ds，down'ssyndrome)或21三体综合症是当前最常见的遗传疾病。在新生儿中，ds的发病率高达1/700，并且发病率会随着产妇年龄的增加而增加。目前，主要是通过产前筛查来避免ds新生儿的出现，产前筛查的手段分唐氏筛查、无创dna诊断和羊水穿刺，而这些检测方法都存在一些缺点，唐氏筛查准确率低，只能作为预筛选手段，无创dna检测时间较长、费用高，羊水穿刺是检测的金标准可是却有流产的风险。目前，产前筛选通过唐氏筛查确定高风险组(21三体风险值≥1/270或18三体风险值≥1/350)和临界风险组(1/1000≤21三体风险值<1/270或1/1000≤18三体风险值<1/350)，之后进行无创dna检测，最后对高风险产妇做羊水穿刺。
无创dna检测是利用高通量测序技术，对产妇外周血中游离dna做测序分析，但该操作程序繁杂，自动化程度不高，而且单次运行成本偏高等问题。此外，因cfdna片段化严重，提取得率不高等问题，加大了高质量文库制备的难度和数据分析的难度。整项检测时间较长，且对样本的要求较高，一旦测试失败就会浪费大量的时间，对产妇生育造成不良的影响。
所以现在需要一种更可靠的方案。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物及检测试剂盒。本发明利用胎儿与母体甲基化位点存在差异的特点，针对胎儿特异的甲基化位点设计了3组特异引物，通过对母体血液游离dna(cfdna)进行分析，由于母体血液游离dna(cfdna)中胎儿dna占总游离dna的5％～10％，经过数量对比关系对比可以对胎儿是否患21三体综合征做出判断，整个检测过程时间短，成本低，可有望代替无创dna检测，能减轻产妇家庭的检测费支出，带来良好的经济效益和社会效益。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物，所述pcr扩增组合物包括3对特异性引物，用于扩增21染色体的3个位点：sim、ybeb和sik，所述3对特异性引物分别为：
扩增sim的上游引物的核酸序列为：actcagtggtgtcgcctcg，
扩增sim的下游引物的核酸序列为：cgtccccaaccatccaag，
扩增ybeb的上游引物的核酸序列为：cgcacggcctactcaagtctc，
扩增ybeb的下游引物的核酸序列为：tggcgtcggaggtgaggc，
扩增sik的上游引物的核酸序列为：gagccaggtctgttctccacg，
扩增sik的下游引物的核酸序列为：agccgatgcccttgttgc。
优选的是，还包括荧光定量pcr预混液。
本发明还提供一种用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其包括如上所述的用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物。
优选的是，还包括阳性对照和阴性对照。
优选的是，阳性对照为：人工合成的模板dna，其中未甲基化处理的dna与甲基化处理的dna质量比为20:1，,浓度控制为：50ng/μl。
优选的是，阴性对照为：人工合成的模板dna，均未进行未甲基化处理的dna，浓度控制为：50ng/μl。
本发明还提供一种如上所述的检测试剂盒在产前无创检测21三体综合征中的应用。
本发明的有益效果是：本发明可以快速进行产前胎儿三体检测，能广泛应用到产前检测环节，具有灵敏度高、检测过程时间短、成本低等优点，有望代替无创dna检测，可减轻产妇家庭的检测费支出，带来良好的经济效益和社会效益；本发明的试剂盒可通过引物合成快速构成，随时应用到检测当中，具有良好的产品开发潜质。
附图说明
图1-3为本发明的实施例2中的3种待测样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例的一种用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物，所述pcr扩增组合物包括3对特异性引物，用于扩增21染色体的3个位点：位点1：sim、位点2：ybeb和位点3：sik，所述3对特异性引物分别为：
扩增sim的上游引物的核酸序列为：actcagtggtgtcgcctcg，
扩增sim的下游引物的核酸序列为：cgtccccaaccatccaag，
扩增ybeb的上游引物的核酸序列为：cgcacggcctactcaagtctc，
扩增ybeb的下游引物的核酸序列为：tggcgtcggaggtgaggc，
扩增sik的上游引物的核酸序列为：gagccaggtctgttctccacg，
扩增sik的下游引物的核酸序列为：agccgatgcccttgttgc。
其中，3对特异性引物与21染色体的3个位点具有极强的互补配对性质，能确保目标位点的准确性。
其中，该pcr扩增组合物，其特征在于，还包括荧光定量pcr2×预混液，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(南京，
实施例2
一种用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其包括实施例1的用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物、阳性对照和阴性对照。
其中，阳性对照为：人工合成的模板dna，其中未甲基化处理的dna与甲基化处理的dna(甲基化dna通过采购获得)质量比为20:1，浓度控制为：50ng/μl。阴性对照为：人工合成的均未进行未甲基化处理的模板dna，浓度控制为：50ng/μl。
本发明利用胎儿与母体甲基化位点存在差异的特点，针对胎儿特异的甲基化位点设计了3组特异引物，通过对母体血液游离dna(cfdna)进行检测，通过数量对比关系判定胎儿三体患病几率。
本实施例中，使用该检测试剂盒进行产前无创检测21三体综合征的步骤包括：
1、待测样品采集：待测母体采集外周血，体积范围：500μl-1ml，采用通用核酸柱式抽提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司、fastpureblood/cell/tissue/bacteriadnaisolationminikit)进行血液游离dna提取，所获得dna经微量紫外分光光度计(thermo，nanodropone)检测获得浓度及纯度；纯度为1.8～2.0之间，将样品浓度稀释成50ng/μl。
2、将获得的待测样品(sample)、阳性对照(positivecontrol)、阴性对照(negativecontrol)使用3组引物按照如下体系进行配比，每个样本配置3个体系重复。
3、使用lightcycler96实时荧光定量pcr仪进行荧光测定，pcr程序如下所示：
4、使用lightcycler96自带的分析软件分析实验结果，获得样本的cq(cqsam)与阳性对照的cq(cqpc)的比值cqsam/cqpc以及样本的cq(cqsam)与阴性对照的cq(cqnc)的比值cqsam/cqnc，若cqsam/cqnc显著大于cqsam/cqpc，说明胎儿三体概率极高建议进行羊水穿刺，进行核型分析确认。
参照图1-3，为3种待测样品的检测结果，其中，位点1：sim、位点2：ybeb和位点3：sik的阳性对照的cqpc分别表示为：cqpc-1、cqpc-2、cqpc-3，阴性对照的cqnc分别表示为：cqnc-1、cqnc-2、cqnc-3。图1的样品检测结果中，cqsam/cqnc明显大于cqsam/cqpc，说明胎儿大概率为三体胎儿，该结果与该样品的羊水穿刺检验结果相符。图2的样品检测结果中，cqsam/cqnc约等于cqsam/cqpc，说明胎儿大概率为正常胎儿，该结果与该样品的羊水穿刺检验结果相符。图3的样品检测结果中，cqsam/cqnc明显大于cqsam/cqpc，说明胎儿大概率为三体胎儿，该结果与该样品的羊水穿刺检验结果相符。
可以理解的是，可在本发明公开的上述方案的基础上增添新的特异性引物来进行21三体综合征的检测，也可同步进行18三体综合征，13三体综合征检测，本发明应用范围广，有良好的发展应用前景。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
济南国科医工科技发展有限公司
发明名称：用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物及检测试剂盒
扩增sim的上游引物的核酸序列为：actcagtggtgtcgcctcg，
扩增sim的下游引物的核酸序列为：cgtccccaaccatccaag，
扩增ybeb的上游引物的核酸序列为：cgcacggcctactcaagtctc，
扩增ybeb的下游引物的核酸序列为：tggcgtcggaggtgaggc，
扩增sik的上游引物的核酸序列为：gagccaggtctgttctccacg，
扩增sik的下游引物的核酸序列为：agccgatgcccttgttgc。
1.一种用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物，其特征在于，所述pcr扩增组合物包括3对特异性引物，用于扩增21染色体的3个位点：sim、ybeb和sik，所述3对特异性引物分别为：
扩增sim的上游引物的核酸序列为：actcagtggtgtcgcctcg，
扩增sim的下游引物的核酸序列为：cgtccccaaccatccaag，
扩增ybeb的上游引物的核酸序列为：cgcacggcctactcaagtctc，
扩增ybeb的下游引物的核酸序列为：tggcgtcggaggtgaggc，
扩增sik的上游引物的核酸序列为：gagccaggtctgttctccacg，
扩增sik的下游引物的核酸序列为：agccgatgcccttgttgc。
2.根据权利要求1所述的用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物，其特征在于，还包括荧光定量pcr预混液。
3.一种用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物。
4.根据权利要求3所述的用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为：人工合成的模板dna，其中未甲基化处理的dna与甲基化处理的dna质量比为20:1，浓度控制为：50ng/μl。
6.根据权利要求4所述的用于产前无创检测21三体综合征的检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为：人工合成的均未进行未甲基化处理的模板dna，浓度控制为：50ng/μl。
7.一种如权利要求3-6中任意一项所述的检测试剂盒在产前无创检测21三体综合征中的应用。
技术总结