本发明涉及基因标志物检测技术领域，尤其涉及一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法。
背景技术：
肝硬化是临床上常见的慢性进行性疾病，其发病主要以肝炎病毒感染后肝硬化为主。通常会伴随出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症，肝硬化转为肝癌的几率高达70％，因此，肝硬化不仅被视为肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中期。据世界卫生组织统计，因肝硬化致死人数仅次于恶性肿瘤、心脑血管病和意外事故，居死亡原因第5位。目前对于肝硬化患者这类肝癌的高危人群，临床上主要通过血清肿瘤标志物检测，如检查血液中甲胎蛋白(afp)含量、异常凝血酶原(dcp)等，但两者灵敏度分别为不足60％和44％。同时，afp水平容易受到怀孕或其他疾病因素的影响，如一些慢性肝炎患者中，血清afp也会升高，这会导致易出现假阳性的检测结果。此外，目前临床上还会采取超声检查和ct检查等影像学手段进行诊断，但是单纯的b超或ct检查存在着漏诊率较大，而且影像学操作易受操作者经验影响，对设备依赖性较高，且费用昂贵，不适宜频繁使用。这使得多数患者不能得到早发现早治疗的机会，失去了最佳治疗时期。
因此，寻找新的肝硬化标志物，尤其是对于肝硬化晚期转为肝癌的高危人群的诊断标志物，这能有效提高早期肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，对于降低病死率意义重大。
技术实现要素：
(一)发明目的
为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法。本发明基于5hmc能经t4-β-葡萄糖转移酶进行糖基化修饰的特性，将叠氮修饰葡萄糖基团转移至5hmc,然后采用点击化学的方法捕获含有糖基化修饰的序列，该过程中利用点击化学高反应效率的特点，实现极大效率的目标序列捕获，其效率远远高于使用抗体等的捕获方法，尤其适合cfdna这种极低样本起始量核酸的检测；此外本发明是对5hmc差异region的检测技术，相较于5hmc单碱基的检测方法，成本更低。
(二)技术方案
为解决上述问题，本发明提供了一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，步骤如下：
s1、提取cfdna；
s2、将cfdna片段进行末端修复并补齐；
s3、将末端补齐的dna与测序接头进行连接，得到连接产物；
s4、通过t4-β-葡萄糖转移酶，将含叠氮修饰基团的糖udp-6-n3-glucose的修饰基团转移到连接产物中5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；
s5、在5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin；
s6、将含有上述5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；
s7、利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的dna片段；
s8、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的dna为模板，进行pcr扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；
s9、对测序文库进行质量检查；
s10、将含有不同barcode的测序文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果。
优选的，在s2中，首先将提取的cfdna进行片段长度检测，再将筛选的cfdna进行末端修复并补齐。
优选的，在s5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin。
优选的，在s6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
优选的，在s7中，所述缓冲液包括tris-hcl、edta、nacl和表面活性剂tween20。
本发明又提出一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，该方法的应用包括，根据测序结果分析确定基因标志物和诊断模型的加权系数，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)，再将初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)与临床血清学指标afp和dcp结合，获得区分肝硬化与肝癌的最终诊断分值(ad-wdscore)，使用ad-wdscore区分肝硬化与肝癌患者。
优选的，通过偏最小二乘法和弹性网络对测序结果数据进行建模分析，得到每个模型marker的加权系数，并对样本进行打分，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)。
优选的，ad-wdscore计算公式：
ad-wdscore＝0.528*log2(afp) 0.3935*log2(dcp) 1.8577*wdscore。
本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
5hmc是一种表观修饰，已证明其修饰丰度的改变与多种疾病，包括癌症，的发生发展密切相关，且表观遗传修饰的改变一般发生在癌症发展早期，相较与癌症相关突变，更适合癌症早期的诊断。因此本发明基于5hmc(5-羟甲基胞嘧啶)能经t4-β-葡萄糖转移酶进行糖基化修饰的特性，将叠氮修饰葡萄糖基团转移至5hmc,然后采用点击化学的方法捕获含有糖基化修饰的序列，该过程中利用点击化学高反应效率的特点，实现极大效率的目标序列捕获，其效率远远高于使用抗体等的捕获方法，尤其适合cfdna这种极低样本起始量核酸的检测；此外本发明是对5hmc差异region的检测技术，相较于5hmc单碱基的检测方法，成本更低。
附图说明
图1为使用本发明中提出的一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法筛选得到的差异markers结合临床指标进行肝癌及肝硬化区分线形图。
图2为ad-wdscore诊断模型和临床指标afp区分肝癌及肝硬化患者结果分布图。
图3为ad-wdscore诊断模型和临床指标dcp区分肝癌及肝硬化患者结果分布图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1
本发明提出的一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，步骤如下：
s1、提取cfdna：从117个肝硬化患者样本中抽提10ng血浆cfdna，可通过本领域技术人员熟知的任何适用于提取血浆cfdna的方法进行抽提；
s2、将cfdna片段进行末端修复并补齐，将末端补齐的dna与测序接头进行连接，得到连接产物；方法如下：
根据vazymednalibraryprepkit说明书，在pcr管里制备含有10ngcfdna、15μl的end-prepmix4、1μlspikein以及用nuclease-freewater补齐到总体积为50μl的体系，在20℃孵育30分钟，然后在65℃孵育15分钟；向反应混合物中加入25μl的rapidligationbuffer2、5μl的rapiddnaligase、1μl的adapter以及用nuclease-freewater补齐到总体积为100μl的体系，在20℃孵育15分钟，然后保持在4℃；使用ampurexpbeads对反应产物进行纯化，用21μl的nuclease-freewater进行洗脱获得最终dna连接样品；
s4、通过t4-β-葡萄糖转移酶，将含叠氮修饰基团的糖udp-6-n3-glucose的修饰基团转移到连接产物中5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；再在5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin；方法如下：
制备总体积为25μl的标记反应混合液，包括t4-β-葡萄糖转移酶、带有叠氮修饰基团的糖udp-6-n3-glucose、10×buffer和上述21μl的纯化产物；将混合液在37℃孵育2小时；向反应产物中加入2.5μl的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，在37℃孵育2小时；向反应混合物中加入10μg的shearedsalmonspermdna(鲑鱼精dna)，使用bio-rad的microbio-spin30column对上述反应混合液进行纯化，将纯化产物定容至50μl；
s5、将含有上述5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；利用缓冲液多次洗涤所述固相材料，去除未结合的dna片段；方法如下：
首先，进行磁珠准备步骤：取出5μl的链霉素亲和素免疫磁珠c1streptadvinbeads(lifetechnoiogy)吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μl的2*buffer1(1mph7.5tris，0.5medta，5mnacl，tween20)在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μl的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；然后，将磁珠与上述纯化定容的标记产物1:1混合(各50μl)，在旋转混匀仪中混匀30分钟，使其充分结合；最后，分别用100μl的buffer1(1x)、buffer2(1x)、buffer3和buffer4洗脱，每种buffer洗涤两次，每次洗时置于旋转架上5min(旋转之后先瞬离一下避免损失盖上液体)；
s6、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的dna为模板，进行pcr扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；
制备总体积为50μl的反应体系，包含25μl的vahtshifiamplicationmix、2μl的pcrprimermix3forillumina以及23μl的nuclease-freewater，将反应混合物加入到上述已洗涤的磁珠中，根据表1的pcr反应条件进行扩增：
表1
使用ampurexpbeads纯化扩增产物，获得最终测序文库。
s7、对测序文库进行质量检查后进行高通量测序，方法如下：
使用qubit对获得的测序文库进行浓度测定，并使用labchipgxtouch对文库dna片段大小含量进行确定。通过质检的测序文库可用于高通量测序，将一定数量(1-96个)含有不同barcode的文库按相同浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序。
在一个可选的实施例中，首先将提取的cfdna进行片段长度检测，再将筛选的cfdna进行末端修复并补齐。
在一个可选的实施例中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin。
在一个可选的实施例中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
实施例2
本发明又提出一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，该方法的应用包括，将获得的5hmc测序结果进行初步质控，切除接头序列和低质量测序位点后，利用bowtie2将质控合格的测序数据比对到人类标准参考基因组上。用samtools提取出完美匹配到参考基因组上的reads后再利用picard去掉重复片段。通过macs2callpeak得到5hmc富集的位点信息，在summit前后扩增100bp，得到201bp固定长度的5hmc富集区域。然后利用bedtools工具来统计每个5hmc富集区域的5hmc修饰水平(fpkm)。利用偏最小二乘法及和弹性网络对数据进行建模分析，得到每个模型marker的加权系数，并对样本进行打分，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)。将wdscore与临床血清学指标afp和dcp结合，获得区分肝硬化与肝癌的最终诊断分值(ad-wdscore)，使用该检测该分值区分肝硬化与肝癌患者。
在一个可选的实施例中，ad-wdscore计算公式：
ad-wdscore＝0.528*log2(afp) 0.3935*log2(dcp) 1.8577*wdscore
使用本发明的10个可区分肝硬化、肝癌的早期肝硬化癌变早期标志物。如图1所示，在117例肝硬化患者和134例肝癌患者的样本中，使用本发明涉及的标志物具有0.9756左右的灵敏度和0.9167左右的特异性。如图2、3所示，ad-wdscore(阈值3.382203)对肝硬化及肝癌的区分度显著优于现有的临床指标afp(阈值40mg/ml)及dcp(阈值40mg/ml)。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
1.一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，其特征在于，步骤如下：
s1、提取cfdna；
s2、将cfdna片段进行末端修复并补齐；
s3、将末端补齐的dna与测序接头进行连接，得到连接产物；
s4、通过t4-β-葡萄糖转移酶，将含叠氮修饰基团的糖udp-6-n3-glucose的修饰基团转移到连接产物中5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；
s5、在5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin；
s6、将含有上述5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；
s7、利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的dna片段；
s8、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的dna为模板，进行pcr扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；
s9、对测序文库进行质量检查；
s10、将含有不同barcode的测序文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果。
2.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，其特征在于，在s2中，首先将提取的cfdna进行片段长度检测，再将筛选的cfdna进行末端修复并补齐。
3.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，其特征在于，在s5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素dbco-peg4-biotin。
4.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，其特征在于，在s6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。
5.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的方法，其特征在于，在s7中，所述缓冲液包括tris-hcl、edta、nacl和表面活性剂tween20。
6.一种包括权利要求1-5任一项所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的应用。
7.根据权利要求6所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的应用，其特征在于，根据测序结果分析确定基因标志物和诊断模型的加权系数，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)，再将初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)与临床血清学指标afp和dcp结合，获得区分肝硬化与肝癌的最终诊断分值(ad-wdscore)，使用ad-wdscore区分肝硬化与肝癌患者。
8.根据权利要求7所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的应用，其特征在于，通过偏最小二乘法和弹性网络对测序结果数据进行建模分析，得到每个模型marker的加权系数，并对样本进行打分，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)。
9.根据权利要求7所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的应用，其特征在于，ad-wdscore计算公式：
ad-wdscore＝0.528*log2(afp) 0.3935*log2(dcp) 1.8577*wdscore。
10.一种用于肝癌诊断的试剂盒，包括：
a、用于测定权利要求1-5任一项所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmc含量的试剂；
b、说明书。
技术总结