本发明属于rna修饰位点检测
技术领域：
：，具体涉及一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法及其应用。
背景技术：
：：目前已知在rna上存在超过100种修饰，其中包括：n6-腺苷酸甲基化(m6a)、n1-腺苷酸甲基化(m1a)、胞嘧啶羟基化(m5c)等，而m6a是其中含量最多的修饰，影响rna的代谢，肿瘤的发生、发展以及细胞的生长、发育等。目前已知的m6a检测方法主要有二大类：一类是质谱检测法，可以检测样本m6a修饰的总体水平，但是无法得知m6a修饰具体的修饰位置以及是哪些基因上存在修饰。另一类是高通量测序法，如应用最广泛的methylatedrnaimmunoprecipitationandsequencing(merip-seqorm6a-seq)技术，可以精确的知道基因的某些区域上存在m6a修饰。但是，基因的功能体现在mrna上，而mrna只占总rna的1-2％，因此merip-seq需要从大量的总rna中提取mrna，另外，merip-seq是在抗体免疫沉淀后获得rna样品上开始构建测序文库，受限于连接法构建文库的策略，因此merip-seq的初始样品通常需要大于100微克的总rna作为实验材料，从而极大的限制了该方法在一些难以获得样品的材料以及病人的组织样品上的应用。虽然最新的研究方案通过改进实验流程和策略，将初始样品的用量降低至0.5微克的总rna，也可以获得较好的m6a高通量数据，但是仍然不能满足微量样品的需要，特别是单细胞的需要。因此，有必要创建一种新的高通量测序方法，以便于研究微量样品的m6a修饰。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，通过tn5转座酶在mrna/dna杂合链上添加测序接头得到的m6a修饰检测文库可以极大地降低了高通量测序样品的初始投入量。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：本发明提供了一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，即通过tn5转座酶在mrna/dna杂合链上添加测序接头，构建得到input测序文库和ip测序文库，所述测序接头的核苷酸序列如seqidno:1所示。作为本发明的一个优选的实施方式，上述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，包括以下步骤：s1、提取待测样品的总rna或含有总rna的细胞裂解物；s2、通过tn5转座酶建库试剂盒去除总rna中的基因组dna；s3、以去除基因组dna的总rna作为模板，tn5转座酶建库试剂盒中的oligo(dt)20vn引物作为反转录的引物，通过转录获得mrna/dna的杂合链产物；s4、通过tn5转座酶建库试剂盒使mrna/dna的杂合链片段化，并且加上测序接头，所述测序接头的核苷酸序列如seqidno:1所示；s5、通过tn5转座酶建库试剂盒将片段化产物上产生的缺口补平；s6、将补平缺口的产物分为两份：1/9体积作为input样品，直接用于构建常规的tn5测序文库；剩下的8/9体积作为ip样品，用于构建ip测序文库；s7、首先对ip样品进行变性处理，然后往变性后的ip样品中加入m6a抗体和免疫磁珠，对含有m6a甲基化的mrna/dna片段进行富集；s8、对ip样品和input样品进行第一轮测序文库的扩增；s9、使用磁珠纯化第一轮扩增的产物，并洗脱磁珠上的dna；s10、对ip样品和input样品的洗脱产物进行第二轮测序文库的扩增；s11、使用磁珠纯化第二轮扩增的产物，并洗脱磁珠上的dna，选取符合文库浓度和文库大小的扩增产物，即可构建得到m6a修饰检测文库，包括input测序文库和ip测序文库。优选地，所述总rna的量不小于60ng或细胞裂解物中的细胞数不少于2000个(可保证细胞裂解物中的总rna的量不小于60ng)。优选地，在步骤s8中，可以将富集后的ip样品直接进行第一轮测序文库的扩增，也可以先将富集后的ip样品转变为cdna，然后再进行第一轮测序文库的扩增。优选地，步骤s2为使用rna建库试剂盒中的5×gdnawipermix试剂将总rna中的基因组dna去除。进一步地，具体的dna去除方法如下：将总rna置于70℃下加热3min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min(预变性)，然后按照下列组分和成分配制体系：用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。优选地，步骤s3中的转录为：首先按照下列组分和成分配制体系：去除基因组dna的总rna10μl10×rtmix2μlhiscriptiiienzymemix2μloligo(dt)20vn1μlnuclease-freeddh2o5μl然后混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：42℃60min,10cyclesof[50℃2min,42℃2min],70℃10min。优选地，步骤s4为使用tn5转座酶建库试剂盒中的tn5vr100试剂使mrna/dna的杂合链片段化，并且加上测序接头。进一步地，具体的片段化方法如下：首先按照下列组分和成分配制体系：杂合链产物20μltagmentbuffer10μltn5vr1002μl然后混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：55℃30min，反应完成后，加入2μltstopsolution；充分混匀，室温孵育5min。优选地，步骤s5为使用tn5转座酶建库试剂盒中的tse试剂将片段化产物上产生的缺口补平。进一步地，具体的缺口补平方法如下：首先按照下列组分和成分配制体系：片段化产物34μlvahtshifiamplificationmix50μltse1μlnuclease-freeddh2o5μl然后混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：55℃15min，60℃15min，85℃5min。优选地，所述免疫磁珠在使用前需要进行预处理，即用免疫磁珠的预先处理，用反应缓冲液洗2次免疫磁珠(proteingbeads)，然后用反应缓冲液重悬免疫磁珠。同时，步骤s7的免疫沉淀反应(ip)后需要依次用反应缓冲液，低盐缓冲液，高盐缓冲液冲洗免疫磁珠2次，降低非特异性结合。反应缓冲液、低盐缓冲液和高盐缓冲液的组成如下表所示：反应缓冲液组分最终浓度nacl150mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％低盐缓冲液组分最终浓度nacl50mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％高盐缓冲液组分最终浓度nacl500mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％优选地，步骤s7中，ip样品在富集前需进行变性处理。进一步地，所述变性处理的方法为：置于pcr仪内，95℃10min或者95℃20min。通过在抗体免疫沉淀反应前，将样品进行95℃10min或者95℃20min的变性处理，从而将mrna/dna杂合链部分或者完全打开，更有利于后续对含有m6a甲基化的mrna/dna片段进行富集。本发明还提供了通过上述的方法构建得到的m6a修饰检测文库在m6a修饰检测中的应用。优选地，上述应用的领域为非疾病诊断治疗领域。本发明还提供了一种tn5转座酶辅助的检测微量样品m6a修饰的高通量测序方法(此方法命名为tmerip-seq)，具体为：将通过上述的方法构建得到的m6a修饰检测文库采用高通量测序平台进行高通量测序，下载测序结果经数据分析后即可得到m6a修饰检测结果。优选地，所述高通量测序平台包括但不局限于illumina的hiseqx、miseq等测序平台，abi的seriesgeneticanalyzer和iontorrentpgm测序平台。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出了一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，在文库的构建中，通过tn5转座酶在mrna/dna杂合链上添加测序接头，通过该方法构建得到的m6a修饰检测文库可以极大地降低了高通量测序样品的初始投入量。总体而言，本发明具有以下优点：(1)通过使用oligo(dt)20vn作为反转录引物，从而获得mrna/dna杂合链产物，不仅节省了初始样品rrna去除的步骤，而且可以有效的避免rrna污染测序数据，并降低成本。(2)通过tn5转座酶将mrna/dna杂合链片段化，并且加上测序接头，从而可以极大的降低高通量测序样品的初始投入量：降低至0.06微克。(3)使用本发明方法可以检测现有merip-seq方法不能应用的微量样品：例如微量病理样品。附图说明图1为片段化流程图；图2为用于m6a的ip文库构建流程图；图3为测序文库大小分布图；图4为实施例1的m6a修饰检测的数据分析图；图5为实施例2的m6a修饰检测的数据分析图；图6为血液样品的m6a修饰检测流程图；图7为实施例2的m6a修饰检测的数据分析图。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。本实施例中所采用的免疫磁珠在使用前需要进行预处理，即用免疫磁珠的预先处理，用反应缓冲液洗2次免疫磁珠(proteingbeads)，然后用250μl反应缓冲液重悬免疫磁珠。同时，免疫沉淀反应(ip)后需要依次用反应缓冲液，低盐缓冲液，高盐缓冲液冲洗免疫磁珠2次，降低非特异性结合。反应缓冲液、低盐缓冲液和高盐缓冲液的组成如下表所示：反应缓冲液组分最终浓度nacl150mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％低盐缓冲液组分最终浓度nacl50mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％高盐缓冲液组分最终浓度nacl500mmtris-hcl(ph7.4)10mmigepalca-6300.01％例1一种tn5转座酶辅助的检测微量样品m6a修饰的高通量测序方法本实施例需要用到的引物(vazyme,cat.no.td202)如下(n5-index包括n501-508、n7-index包括n701-712)：本实施例需要的总rna为0.06微克，步骤(1)-(7)的流程如图1所示，步骤(8)-(16)的流程如图2所示：(1)使用二氧化碳培养箱，将293t细胞(购买于中国科学院细胞库)置于改良dmem培养基(dmem；273corning,cat.no.10-017-cv)，并添加10％(v/v)胎牛血清(fbs；gibco)，5％co2，37℃培养至细胞数达到十万级。(2)将细胞培养基弃掉，用pbs清洗两次，使用胰酶消化细胞，对细胞悬浊液进行离心(1000rpm/5min)，弃上清，保留底层细胞。(3)使用经典的trizol(thermofisherscientific,catalogno.15596026)法提取总rna，按照产品说明书进行操作，获得总rna(取0.06微克作为检测样品)。(4)使用tn5转座酶建库试剂盒(vazyme,tr501-01)中的5×gdnawipermix试剂，将总rna中的基因组dna去除，具体如下：将60ng总rna置于70℃下加热3min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min(预变性)，然后按照下列组分和成分配制体系：预变性rna60ng5×gdnawipermix(vazyme,tr501-01)2μlnuclease-freeddh2oupto10μl用移液器轻轻吹打混匀反应体系，42℃孵育2min。(5)使用tn5转座酶建库试剂盒(vazyme,tr501-01)中的试剂合成mrna/dna杂合链，具体如下：首先按照下列组分和成分配制体系：然后用移液器轻轻吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：42℃60min,10cyclesof[50℃2min,42℃2min],70℃10min。(6)使用tn5转座酶建库试剂盒(vazyme,tr501-01)中的tn5vr100试剂将mrna/dna杂合链片段化，并且在片段的两端分别随机加上测序接头(接头存在于tn5vr100酶上，tn5vr100酶在片段化模板的时候，会将两端的接头序列随机插入模板的两端)：5′-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3′(接头1)和5′-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3′(接头2)，如seqidno:1所示。具体操作如下：首先按照下列组分和成分配制体系：上一步的反应液(杂合链产物)20μltagmentbuffer10μltn5vr100(vazyme,tr501-01)2μl然后用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：55℃30min，反应完成后，加入2μltstopsolution；充分混匀，室温孵育5min。(7)使用tn5转座酶建库试剂盒(vazyme,tr501-01)中的tse试剂将片段化后产生的缺口补平，具体如下：首先按照下列组分和成分配制体系：上一步的产物(片段化产物)34μlvahtshifiamplificationmix50μltse(vazyme,tr501-01)1μlnuclease-freeddh2o5μl然后用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：55℃15min，60℃15min，85℃5min。(8)将上一步补平缺口的产物分成两份：1/9体积(10微升)作为input样品，直接用于构建常规的tn5测序文库；剩下的8/9体积(80微升)作为ip样品，用于构建ip测序文库；(9)首先对ip样品进行变性，即在pcr仪内，按照以下参数设置反应：95℃10min(方法一)或者95℃20min(方法二)，然后迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min；然后在变性后的ip样品中加入m6a抗体和免疫磁珠(需要预先处理)，对含有m6a甲基化的mrna/dna片段进行富集，具体如下：首先按照下列组分和成分配制体系：等分后的变性ip样品(加入了m6a抗体和免疫磁珠)40μlm6aantibody(cellsignalingtechnology,56593)2μlproteingbeads(thermofisherscientific,1004d)250μlrecombinantribonucleaseinhibitor(takara,2313)4μl然后用移液器充分吹打混匀反应体系，在4℃冰箱内，将样品置于旋转仪上颠倒混匀过夜。(10)去除免疫磁珠的非特异性结合，即依次用反应缓冲液，低盐缓冲液，高盐缓冲液冲洗免疫磁珠2次。(11)第一轮扩增测序文库：1)ip样品第一轮扩增测序文库：方法一，将免疫磁珠中的液体吸干净，随后加入pcr反应体系开始第一轮扩增测序文库(参考文献：mcevoy,c.r.,semple,t.,yellapu,b.,choong,d.y.,xu,h.,mirarnau,g.,fellowes,a.p.,andfox,s.b.(2020).improvednext-generationsequencingpre-capturelibraryyieldsandsequencingparametersusingon-beadpcr.biotechniques68,48-51)，以免疫磁珠为样品，加入以下反应体系：2xkapahifihotstartreadymix(kapabiosystems,kk2601)25μlindexedcommonprimersn5引物序列1.5μlindexedcommonprimersn7引物序列1.5μlp5-primer1.5μlp7-primer1.5μlnuclease-freeddh2o19μl用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：98℃3min,10cyclesof[98℃20s,60℃20s,72℃1min],72℃3min。方法二，将免疫磁珠中的液体吸干净，随后加入反转录体系，将rna反转录成cdna，以免疫磁珠为样品，加入以下反应体系：步骤一2xkapahifihotstartreadymix(kapabiosystems,kk2601)10μlindexedcommonprimers(vazyme,cat.no.td202)0.5μlnuclease-freeddh2o9.5μl步骤二ribolockrnaseinhibitor(thermoscientific,k1622)0.5μlrevertaidm-mulvrt(thermoscientific,k1622)1μl首先按照步骤一加入相应的试剂，用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：85℃30s,60℃2min,缓慢冷却到4℃；然后加入步骤二的试剂，用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：42℃30min，反应结束后，加入pcr反应体系开始第一轮扩增测序文库，具体按照以下反应体系进行：2xkapahifihotstartreadymix(kapabiosystems,kk2601)25μlindexedcommonprimersn5引物序列1.0μlindexedcommonprimersn7引物序列1.0μlp5-primer1.0μlp7-primer1.0μl上一步反应产物(步骤二的pcr产物)21μl用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：98℃3min,10cyclesof[98℃20s,60℃20s,72℃1min],72℃3min。2)input样品第一轮扩增测序文库：将input样品加入pcr反应体系开始第一轮扩增测序文库，反应体系具体如下：(12)按1：1的体积比使用商业化的pcr产物纯化磁珠(vazyme,n411)纯化pcr产物(ip样品和input样品的pcr产物)，最后用10μl无核酶的纯水洗脱磁珠上的dna。(13)第二轮扩增测序文库，具体按照以下反应体系进行：上一步的洗脱产物(ip样品和input样品的dna)10μlkapahifihotstartreadymix(kapabiosystems,kk2601)25μlp5-primer1.5μlp7-primer1.5μlnuclease-freeddh2o12μl用移液器充分吹打混匀反应体系，在pcr仪内，按照以下参数设置反应：input样品：98℃3min,8cyclesof[98℃20s,60℃20s,72℃1min],72℃3min。ip样品：98℃3min,12cyclesof[98℃20s,60℃20s,72℃1min],72℃3min。(14)按1：1的体积比使用商业化的pcr产物纯化磁珠(vazyme,n411)纯化pcr产物(ip样品和input样品的pcr产物)，最后用15μl洗脱磁珠上的dna。一方面用商业化试剂qubitdsdnahsassaykit(thermofisherscientific,q32851)测定文库浓度(文库浓度大于4ng/μl，符合测序要求[即不低于2ng/μl])，另一方面检测文库大小的分布情况(如图3所示，文库大小为200-500bp，符合要求)。由此构建得到input测序文库和ip测序文库。(15)将input测序文库样品和ip测序文库样品送测序公司，在hiseqx测序平台进行高通量测序。(16)下载测序结果，并进行分析。首先，使用fastqc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序结果进行质量评估，并使用cutadapt(https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)进行质量控制，去除接头序列、低质量的碱基。然后，使用hisat2(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)将测序片段比对到参考基因组，使用samtools(https://github.com/samtools/samtools)软件对比对结果进行排序，建索引等处理。最后，使用r语言包exomepeak2(https://github.com/zw-xjtlu/exomepeak2)进行callpeak分析，以鉴定出m6a修饰的富集区域。目前，大量的研究都表明m6a修饰趋向于富集在终止密码子附近，并且许多研究都以m6a修饰在mrna上的分布模式作为判断其结果好坏的依据。根据方法一和方法二鉴定得到的m6apeak，展示了其在mrna的分布情况，结果如图4-a所示，样品的m6apeak主要分布在终止编码区域附近，motif分析结果所示如图4-b和4-c，motif具有明显的“rrach”(r＝gora；h＝a,c,oru)富集，与已知的结论相符合(参考文献：meyer,k.d.,saletore,y.,zumbo,p.,elemento,o.,mason,c.e.,andjaffrey,s.r.(2012).comprehensiveanalysisofmrnamethylationrevealsenrichmentin3'utrsandnearstopcodons.cell149,1635-1646)。实施例2一种tn5转座酶辅助的检测微量样品m6a修饰的高通量测序方法本实施例的检测样品为293t细胞(2000个细胞)，即以细胞裂解物作为检测样品。本实施例需要用到的引物同实施例1。步骤(1)-(7)的流程如图1所示，步骤(8)-(16)的流程如图2所示：(1)使用二氧化碳培养箱，将293t细胞置于改良dmem培养基(dmem；273corning,cat.no.10-017-cv)并添加10％(v/v)胎牛血清(fbs；gibco)。(2)将细胞培养基弃掉，用pbs清洗两次，使用胰酶消化细胞，对细胞悬浊液进行离心(1000rpm/5min)，弃上清，用pbs重选细胞，随后用流式细胞分选仪，分选出2000个细胞。(3)将3μl细胞裂解液加入步骤2中分选好的细胞中并且充分混匀，然后将样品置于pcr仪器中，72℃3min，随后立即插入冰中，以备使用(裂解细胞膜，获得含有总rna的细胞裂解物)。细胞裂解液的组成如下：细胞裂解液50μltritonx-100(sigma-aldrich,cat.no.t9284)0.1μlrecombinantribonucleaseinhibitor(takara,cat.no.2313)2μlnuclease-freeddh2o47.8μl(4)以下的m6a修饰检测方法与同实施例1。根据方法一和方法二鉴定得到的m6apeak，展示了其在mrna的分布情况，结果如图5所示，样品的m6apeak主要分布在终止编码区域附近，motif分析结果所示如图5-a和5-b，motif具有明显的“rrach”(r＝gora；h＝a,c,oru)富集，与已知的结论相符合(参考文献：meyer,k.d.,saletore,y.,zumbo,p.,elemento,o.,mason,c.e.,andjaffrey,s.r.(2012).comprehensiveanalysisofmrnamethylationrevealsenrichmentin3'utrsandnearstopcodons.cell149,1635-1646)。实施例3一种tn5转座酶辅助的检测微量样品m6a修饰的高通量测序方法本实施例的检测样品为一滴血样品(5微升)。本实施例需要用到的引物同实施例1。本实施例的操作流程如图6所示：(1)使用采血针从健康的志愿者获得指尖外周血5微升/样品。(2)使用红细胞裂解液(roche,11814389001)，将外周血中的红细胞去除，从而获得大量的白细胞。(3)使用经典的trizol(thermofisherscientific,catalogno.15596026)法提取总rna，按照说明书进行操作，获得总rna。(4)以下的m6a修饰检测方法与同实施例1，其中步骤(11)采用方法二。根据方法二鉴定得到的m6apeak，展示了其在mrna的分布情况，结果如图7-a所示，样品的m6apeak主要分布在终止编码区域附近，与已知的结论相符合。motif分析结果所示如图7-b，motif具有明显的“rrach”(r＝gora；h＝a,c,oru)富集，与已知的结论相符合(参考文献：meyer,k.d.,saletore,y.,zumbo,p.,elemento,o.,mason,c.e.,andjaffrey,s.r.(2012).comprehensiveanalysisofmrnamethylationrevealsenrichmentin3'utrsandnearstopcodons.cell149,1635-1646)。以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。序列表<110>中山大学<120>一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法及其应用<160>27<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>接头1(人工序列)<400>1tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag33<210>2<211>34<212>dna<213>接头2(人工序列)<400>2gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag34<210>3<211>8<212>dna<213>n501(人工序列)<400>3tagatcgc8<210>4<211>8<212>dna<213>n502(人工序列)<400>4ctctctat8<210>5<211>8<212>dna<213>n503(人工序列)<400>5tatcctct8<210>6<211>8<212>dna<213>n504(人工序列)<400>6agagtaga8<210>7<211>8<212>dna<213>n505(人工序列)<400>7gtaaggag8<210>8<211>8<212>dna<213>n506(人工序列)<400>8actgcata8<210>9<211>8<212>dna<213>n507(人工序列)<400>9aaggagta8<210>10<211>8<212>dna<213>n508(人工序列)<400>10ctaagcct8<210>11<211>8<212>dna<213>n701(人工序列)<400>11taaggcga8<210>12<211>8<212>dna<213>n702(人工序列)<400>12cgtactag8<210>13<211>8<212>dna<213>n703(人工序列)<400>13aggcagaa8<210>14<211>8<212>dna<213>n704(人工序列)<400>14tcctgagc8<210>15<211>8<212>dna<213>n705(人工序列)<400>15ggactcct8<210>16<211>8<212>dna<213>n706(人工序列)<400>16taggcatg8<210>17<211>8<212>dna<213>n707(人工序列)<400>17ctctctac8<210>18<211>8<212>dna<213>n708(人工序列)<400>18cagagagg8<210>19<211>8<212>dna<213>n709(人工序列)<400>19gctacgct8<210>20<211>8<212>dna<213>n710(人工序列)<400>20cgaggctg8<210>21<211>8<212>dna<213>n711(人工序列)<400>21aagaggca8<210>22<211>8<212>dna<213>n712(人工序列)<400>22gtagagga8<210>23<211>20<212>dna<213>p5-primer(人工序列)<400>23aatgatacggcgaccaccga20<210>24<211>21<212>dna<213>p7-primer(人工序列)<400>24caagcagaagacggcatacga21<210>25<211>22<212>dna<213>oligo(dt)20vn(人工序列)<220><223>v=da,dc,ordg；n=da,dc,dgordt<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>nisa,c,g,toru<400>25ttttttttttttttttttttvn22<210>26<211>43<212>dna<213>n5引物(人工序列)<220><223>5′-aatgatacggcgaccaccgagatctacac-[n5-index]-tcgtcggcagcgtc-3′<400>26aatgatacggcgaccaccgagatctacactcgtcggcagcgtc43<210>27<211>39<212>dna<213>n7引物(人工序列)<220><223>5′-caagcagaagacggcatacgagat-[n7-index]-gtctcgtgggctcgg-3′<400>27caagcagaagacggcatacgagatgtctcgtgggctcgg39当前第1页1 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技术特征：1.一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，通过tn5转座酶在mrna/dna杂合链上添加测序接头，构建得到input测序文库和ip测序文库，所述测序接头的核苷酸序列如seqidno:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、提取待测样品的总rna或含有总rna的细胞裂解物；
s2、通过tn5转座酶建库试剂盒去除总rna中的基因组dna；
s3、以去除基因组dna的总rna作为模板，tn5转座酶建库试剂盒中的oligo(dt)20vn引物作为反转录的引物，通过转录获得mrna/dna的杂合链产物；
s4、通过tn5转座酶建库试剂盒使mrna/dna的杂合链片段化，并且加上测序接头，所述测序接头的核苷酸序列如seqidno:1所示；
s5、通过tn5转座酶建库试剂盒将片段化产物上产生的缺口补平；
s6、将补平缺口的产物分为两份：1/9体积作为input样品，直接用于构建常规的tn5测序文库；剩下的8/9体积作为ip样品，用于构建ip测序文库；
s7、首先对ip样品进行变性处理，然后往变性后的ip样品中加入m6a抗体和免疫磁珠，对含有m6a甲基化的mrna/dna片段进行富集；
s8、对ip样品和input样品进行第一轮测序文库的扩增；
s9、使用磁珠纯化第一轮扩增的产物，并洗脱磁珠上的dna；
s10、对ip样品和input样品的洗脱产物进行第二轮测序文库的扩增；
s11、使用磁珠纯化第二轮扩增的产物，并洗脱磁珠上的dna，选取符合文库浓度和文库大小的扩增产物，即可构建得到m6a修饰检测文库，包括input测序文库和ip测序文库。
3.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，所述总rna的量不小于60ng或细胞裂解物中的细胞数不少于2000个。
4.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，在步骤s8中，可以将富集后的ip样品直接进行第一轮测序文库的扩增，也可以先将富集后的ip样品转变为cdna，然后再进行第一轮测序文库的扩增。
5.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，步骤s2为使用rna建库试剂盒中的5×gdnawipermix试剂将总rna中的基因组dna去除。
6.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，步骤s4为使用tn5转座酶建库试剂盒中的tn5vr100试剂使mrna/dna的杂合链片段化，并且加上测序接头。
7.根据权利要求1所述的一种采用tn5转座酶辅助构建微量样品m6a修饰检测文库的方法，其特征在于，步骤s5为使用tn5转座酶建库试剂盒中的tse试剂将片段化产物上产生的缺口补平。
8.通过权利要求1-7任一项所述的方法构建得到的m6a修饰检测文库在m6a修饰检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的领域为非疾病诊断治疗领域。
10.一种tn5转座酶辅助的检测微量样品m6a修饰的高通量测序方法，其特征在于，将通过权利要求1-7任一项所述的方法构建得到的m6a修饰检测文库采用高通量测序平台进行高通量测序，下载测序结果经数据分析后即可得到m6a修饰检测结果。
技术总结本发明属于RNA修饰位点检测技术领域，具体涉及一种采用Tn5转座酶辅助构建微量样品m6A修饰检测文库的方法及其应用，本发明在文库的构建中，通过Tn5转座酶在mRNA/DNA杂合链上添加测序接头，通过该方法构建得到的m6A修饰检测文库可以极大地降低了高通量测序样品的初始投入量，使用本发明方法可以检测现有MeRIP‑seq方法不能应用的微量样品，使高通量测序样品的初始总RNA投入量降低至0.06微克。
技术研发人员：骆观正;陈涛;李言;马冬曌;张璋;奚剑飞
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2021.03.24
技术公布日：2021.07.02
