显微镜和显微镜检查的方法与流程

专利2022-05-09  107



1.在第一方面,本发明涉及根据权利要求1的前序部分的显微镜。在第二方面,本发明涉及根据权利要求28的前序部分的显微镜检查的方法。


背景技术:

2.通用类型的显微镜包括以下部件:用于提供照明光的光源、用于可变地产生照明光的待选择的照明图案的可控操纵设备、具有用于将照明图案指引至待检验样品上的显微镜物镜的照明光束路径、具有用于检测由样品发出的荧光的多个像素的检测器、将由样品发出的荧光指引至检测器的检测光束路径、用于使照明光和荧光分离的主分束器、以及用于控制操纵设备并评估由检测器测量的数据的控制和评估单元。
3.在通用类型的显微镜检查方法中,执行以下步骤:由光源提供照明光、由用于可变地产生照明光的待选择的照明图案的可控操纵设备产生照明图案、将照明图案经由带有显微镜物镜的照明光束路径指引至待检验样品上、由样品发出的荧光经由检测光束路径指引至具有多个像素的检测器上,其中,照明光和荧光由主分束器分离,最后由检测器检测该荧光。
4.在生物医学研究中,对活细胞成像的兴趣正在稳步增长。这对所使用的成像系统,特别是显微镜提出了严格要求。一方面,为了遵循样品中的动态过程,需要高图像刷新率。另一方面,观察对样品的发育和行为的影响应当尽可能小。因此,有必要最小化入射光剂量和入射能量密度,也就是说,用于给定的焦点尺寸的激光功率,因为光对细胞具有毒性作用,从而缩短了细胞的寿命。原则上,通过宽场显微镜很好地满足这两个条件。然而,此时的问题在于,越来越多的活细胞被理解为整体,因此将检验它们之间的相互作用。结果,样品不再是二维的,而是具有有限的厚度。在使用宽场显微镜进行观察期间,导致所需信号与未清晰地成像到传感器上的散焦光叠加在一起。因此,所寻求的信息有时无法检测或仅在对比度差的情况下才可检测到。因此,在不破坏样品的情况下,允许进行光学切片的技术,也就是说,测量各个样品平面,而对其他平面的信号进行抑制或区分是必不可少的。
5.共焦激光扫描显微镜(lsm)已被建设为检测光学切片的标准;它非常有效地阻挡了共焦针孔处的散焦光,并在检测之前辨别出该光。但是,由于扫描顺序地建立图像,因此lsm非常慢。此外,在给定固有的短像素时间的情况下,相对高的光强度,即能量的量被输入到样品中,以便仍然实现可接受的信噪比。因此,在活细胞的情况下,lsm不理想地适合于成像。
6.随着dlp技术(dlp=数字光处理)的发展,文献中已经讨论了所谓的可编程阵列显微镜(pam)。在这种情况下,将dmd阵列放置在显微镜的中间图像平面中,并利用激发光照明。然后通过dmd激活照明图案,以便同时在多个位置上照明样品。然后再次经由相同的dmd阵列指引样品中激发的荧光,并且传递以在矩阵传感器,通常为scmos上进行检测。因此,dmd阵列同时用作激励针孔矩阵和检测针孔矩阵。然后,系统地切换dmd阵列的激励图案,直到实现对样品平面的完全扫描为止。
7.由于通过pam实际上可实现任何期望的大小的并行化,因此仅受相机的图像记录速率限制的帧速率是可能的。但是,与lsm相比,像素的停留时间增加,因此可以大大降低每个样品位置的平均激光功率。然后仍然有可能根据样品厚度改变平行度,以便提高与散焦光的对比度。这不利于帧速率或像素停留时间。
8.但是,关于pam的缺点首先是检测效率,因为必须经由dmd阵列引导发射,该dmd阵列通常由涂有铝的硅反射镜组成。由于铝,已经导致信号损失约20%。另外,这样的反射镜矩阵是规则的二维网格,在该二维网格的子结构处衍射发射光,结果,由于高阶衍射导致额外的信号损失。此外,在显微镜的中间图像中使用dmd矩阵是指将dmd结构直接成像在相机上,从而产生图案伪影。另外,几何尺寸可能是有问题的。目前市售的反射镜矩阵最多具有1080行微镜。相对于成像场尺寸和物镜选择,这限制了pam在光学切片中的适用性。在非常大的像场的情况下,无法协助许多物镜实现共焦扫描。由于这些原因,迄今为止,pam一直无法获得商业认可。
9.常用于活细胞成像的一种设备是旋转圆盘显微镜(sdm)。此时,相对于彼此固定定位的两个盘以高旋转速度旋转。微透镜矩阵被设置在面对激光器的盘上。每个微透镜在下游盘上指定针孔。通过激发激光大面积上照明微透镜盘,该激发激光随后聚焦通过针孔。二向色分束器被设置在两个盘之间并透射激光并反射荧光。针孔盘通过下游光学器件被成像到样品中。由于盘的旋转,通过一系列激发点,以极其平行的方式扫描样品(约1000倍)。在激发点中产生的荧光被成像到针孔盘上并在此进行共焦过滤。在下游的分束器处,荧光被偏转到相机。
10.sdm的最大优点是极其平行的共焦检测,因此对样品的影响相对较小。但是,由于必须将相机用作传感器,因此sdm纯粹是具有共焦图像质量的观察设备。由于针孔必须具有有限的尺寸,因此无法直接达到共焦分辨率极限。另外,针孔尺寸仅大致适合于特定的物镜。因此,其他物镜一开始就无法最佳地使用,因为它们在针孔处产生较小的点扩展函数,这导致检测点扩展函数变长,或者它们在针孔中曝光过度,这可以导致效率的巨大损失。除了sdm的可能性之外,提高分辨率,必需频闪照明,其相对于盘的旋转相移。另外,每次照明拍摄只能记录单个图像,因此用于高分辨率成像的帧速率极低,因此对于活细胞成像不感兴趣。由于只能读出全帧,因此无法建设远离图像采集的实验。此外,这些系统在观察区域的设定方面不是很灵活,其具有当观察到小的结构时必须同时暴露出明显较大的区域的效果。


技术实现要素:

11.可以认为本发明的目的是指定一种显微镜和一种用于显微镜检查的方法,其能够用共焦极限分辨率实现极其平行地扫描活体样品,此外除了纯成像之外,还对活体样品进行了进一步的实验技术。
12.该目的通过具有权利要求1的特征的显微镜和具有权利要求28的特征的显微镜检查的方法来实现。在下文,尤其结合从属权利要求和附图描述根据本发明的显微镜的优选配置和根据本发明的方法的有利变型。
13.根据本发明,通过下述事实开发上述类型的显微镜:操纵设备在相对于样品平面光学共轭的平面附近被设置在主分束器上游的照明光束路径中,检测器的像素可以由控制
和评估单元各个地并以待选择的读出图案激活,并且控制和评估单元被配置为各个地或以取决于所选择的照明图案的所选择的读出图案激活检测器的像素。
14.根据本发明,通过下述事实开发上述类型的方法:操纵设备在相对于样品平面光学共轭的平面附近被设置在主分束器的上游中,并且各个地或以取决于所选择的照明图案的所选择的读出图案激活检测器的像素。
15.特别优选地,操纵设备被设置在相对于样品平面光学共轭的平面中。不用说,这种指示不应当从数学的角度理解,而是应当在典型的定位误差范围之内理解。
16.可以认为是本发明的基本概念是,与先前的解决方案不同,检测光不再经由形成照明图案的操纵设备再次引导。
17.本发明提供了一种特别多用途的显微镜和一种特别多用途的显微镜检查的方法。
18.照明图案(illumination pattern)被理解为是指样品的被照明表面上的照明的实际图案,例如点图案、线图案、网格状照明或专门为生物样品定制的照明。当使用像素化的操纵设备时,在这种情况下,特定的照明图案自然对应于操纵设备的激活像素的特定组合。
19.术语读出图案被理解为基本上是指检测器待激活的像素的任何期望的组合。
20.激光方便地用作光源。但是,也可以使用其他强光源,诸如例如led。以本身已知的方式,计算设备,特别是pc,被用作控制和评估单元。
21.根据本发明的装置特别适合于执行根据本发明的方法。
22.在根据本发明的显微镜的特别优选的实施例中,例如,用于产生待选择的照明图案的操纵设备包括多个像素,并且特别是空间光调制器(slm),诸如数字微镜阵列(dmd)。例如,可以获得具有4096
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2160像素的分辨率的这类部件。可以看出这样像素化的操纵设备的主要优点在于,由于自由的可控制性,照明图案的可能性原则上仅受所使用的部件的空间分辨率和速度限制的事实。
23.在根据本发明的显微镜的另一种构造中,用于可变地产生照明图案的操纵设备包括可移动的,特别是可旋转的光阑盘(stop disc,blendenscheibe)。由于所述光阑盘的移动的结果,特别是由于旋转的结果,样品以可变的照明图案被照明。
24.为了至少部分地实现共焦,必须至少在一个空间维度上将光阑盘的光阑开口限制为共焦光阑的尺寸。例如,可以以原则上公知的方式,光阑盘可以包括螺旋地,特别是以阿基米德螺旋的形式设置的多个针孔光阑,并且可以是尼普科夫盘。具有多个槽的光阑盘同样是可能的。
25.为了至少部分地补救在光阑盘上大量损失照明光的问题,有利地,可以在可旋转光阑盘的上游存在微透镜阵列,该微透镜阵列将照明光聚焦到光阑盘的光阑开口上,并且在操作期间以与光阑盘相同的速度旋转。微透镜的尺寸适当地设计成使得它们将照明光聚焦到光阑开口上。
26.在具有可移动光阑盘的配置中,控制和评估单元被适当地配置成使检测器的读出图案与由移动,尤其是旋转光阑盘产生的照明图案同步。
27.在具有旋转光阑盘的变型中,根据本发明的显微镜的另一有利配置在于以下事实,存在用于测量通过可旋转光阑盘的间歇性光透射或测量来自可旋转光阑盘的间歇性光反射的光电二极管,用于使检测器的控制与可旋转光阑盘的移动同步。透射或反射信号为
检测器的控制提供了可靠的触发信号。
28.原则上,对于根据本发明的显微镜,可以使用任何类型的像素化检测器,通过该像素化检测器可以足够灵敏地检测待检测的光并且可以足够快地读取该像素化检测器。在根据本发明的显微镜的特别优选的变型中,检测器包括spad阵列或spad相机。用可以在cmos工艺中制作的这些传感器,可以进行高灵敏度的光子计数测量。
29.为了增加填充系数,即增加光敏面积与总像素面积之比,微透镜阵列可以有利地存在于检测器的上游。如果操纵设备和检测器的像素光栅不匹配,则该措施特别有利。
30.从样品辐射回去的光以本身已知的方式包含也可以被称为激发光的照明光的反射和反向散射的光谱分量,以及与之相比发生红移的荧光分量。主分色器用于使照明光的光谱分量与荧光分量分离。如果在主分色器的下游的检测光束路径中存在至少一个发射滤光器,特别是具有多个发射滤光器的转换器,则可以实现检测光束路径中不期望的光谱分量的进一步分离。转换器例如可以是滤光轮。
31.根据本发明的显微镜的优选变型涉及将操纵设备的像素分配给检测器的像素。严格来说,由于在主分色器处照明光在从样品返回的路径上被分离,因此这样的操纵设备没有被光学地成像到检测器上。操纵设备—也就是说特别是在dmd—中与检测器—也就是说特别是在spad阵列—中的像素的数量通常不相同。
32.通过示例,操纵设备的特定像素组可以被成像到检测器的限定像素组上。特别地,操纵设备的每个像素可以被成像到检测器的限定像素组上。同样,操纵设备的特定像素组可以被成像到检测器的特定像素上。
33.通过示例,可以以特定的数值比来分配像素。就此而言,例如,可以将dmd的一组2x2或4x4像素分配给检测器的一个像素。
34.在一种特殊情况下,操纵设备的每个像素被成像到检测器的恰好一个像素上。这种情况也被称为像素精确成像。这意味着,由操纵设备的特定像素照明的样品区域在每种情况下被成像到检测器的恰好一个像素上。
35.如果读取了整个spad矩阵,则也可以在测量重新记录后分配各个像素的信号。如果需要,spad相机上游的微透镜阵列可以提供填充系数优化。此外,如果需要,在主分色器与检测器之间或操纵设备与主分色器之间的光学变焦可以确保相应的分配或使设置适应测量任务。
36.在根据本发明的显微镜的一种特别优选的配置中,控制和评估单元被配置为用与所选择的照明图案相对应的读出图案来控制检测器。从方法的观点来看,可以有利地利用与由操纵设备产生的照明图案相对应的读出图案来控制检测器。
37.在这种情况下,读出图案被理解为是指检测器的激活像素的特定组合。在像素精确成像的情况下,这意味着当照明光通过像素精确成像关联的操纵设备的像素辐射到样品上时,将精确地激活检测器的特定像素。如果不存在精确像素的成像,则用与所选择的照明图案相对应的读出图案来控制检测器意味着只要通过缩放,即线性变换使照明图案和读出图案能够彼此转换,则照明图案和读出图案是相似的。
38.在纯荧光显微镜的情况下,控制和评估单元被适当地配置为与对应于照明图案的读出图案同步地控制检测器。在这种情况下,同步特别是指在染料的荧光寿命内激活检测器的相应像素。然而,控制和评估单元也可以被配置为以相对于辐射到样品上的照明图案
在时间上偏移,特别是在时间上可变地偏移的方式,用读出图案控制检测器。在根据本发明的方法的相应的有利变型中,以相对于辐射到样品上的照明图案在时间上偏移的方式,用读出图案控制检测器。这对于例如检查特别是在生物样品中的磷光过程或其他过程是有利的,与染料的荧光寿命相比,这些过程进行得慢得多。
39.原则上,照明图案的具体设计具有很大的自由度。在根据本发明的显微镜的有利变型中,控制和评估单元被配置为控制操纵设备用于在样品上扫描照明图案,特别是点图案、线图案或网格状图案。
40.原则上,检测光束路径的尺寸规定了通过适当控制检测器是否可以进行共焦显微镜检查。通过示例,可以对检测光束路径定尺寸,使得检测器上的检测点扩展函数照明多于一个像素,特别是多于五个像素。在这种设置的情况下,共焦测量和点扩展函数的过采样相应是可能的。
41.在该上下文中,如果在主分束器和显微镜物镜之间存在变焦光学单元以改变样品上的照明场的尺寸,则可以获得更大的自由度。通过变焦光学单元可以改变将操纵装置成像到样品上的成像比例。
42.此外,在操纵设备与主分束器之间和/或在主分束器与检测器之间可以存在变焦光学单元。结果,可以根据需要改变操纵设备的像素到检测器的像素的分配。
43.通过示例,可以选择变焦光学单元的设定,对于该设定,将操纵设备,特别是dmd矩阵成像到整个视场上。例如,光学单元可以被定尺寸为使得部分反射镜,即操纵设备的像素因此对应于具有1

2au(au=艾里单元)直径的照明光斑。然后,到检测器矩阵上的成像不受衍射限制,而是适合于快速记录概览图像。
44.但是,本发明还能够实现有利的变型,其中,选择变焦光学单元的设定,对于该设定,仅将操纵设备,特别是dmd矩阵成像到一部分视场上。在这些变型中,可以实现共焦检测或点扩展函数的过采样。
45.如果代替变焦光学单元或除了变焦光学单元之外还存在扫描单元,特别是具有检流计扫描镜的扫描单元以横向位移照明场,则也可以扩展对照明场的空间操纵的可能性。以原则上已知的方式,这样的扫描单元有利地定位在相对于显微镜物镜的后瞳开口光学共轭的平面中。照明场可以有利地借助于扫描单元在例如x方向和y方向上横向地位移。
46.原则上,通过适当控制操纵设备,可以借助于扫描单元执行具有点、线或网格照明的扫描。但是,操纵设备本身也可以执行这样的扫描。如果存在扫描单元,则可以借助该扫描单元将局部图像的光栅中的照明场位移至少一个光栅位置,然后可以借助适当控制操纵设备来再次执行扫描。
47.有利地,可以存在偏振分束器(pbs)和四分之一波片,用于调节主分束器上游的照明光束路径中的照明光。代替pbs和四分之一波片的组合,也可以将tir棱镜用在照明光束路径中,这在投影应用中很常见。tir棱镜的优点在于,可以将抑制光与所使用的光几何分离。
48.为了适当地调节照明光的光谱组成,如果在主分色器上游的照明光束路径中存在至少一个激发滤光器,特别是具有各种激发滤光器的转换器,则可能是有利的。以原则上已知的方式中,转换器特别可以是滤光轮或可线性位移的转换器。
49.为了适当地调节,例如为了均匀化照明光的空间强度分布,如果在照明光束路径
中,特别是正好在光源的下游存在衍射光学元件,则可能是有利的。通过示例,因此可以将最初基本上为高斯的空间强度分布转换为基本上具有矩形形状的空间强度分布。
50.如果在操纵设备的上游存在另一光整形单元,特别是空间光调制器(slm),则可以实现关于照明光的光谱组成和光谱空间强度分布的操纵的更多可能性。通过示例,这种另一光整形单元可以用来将激发光的特定光谱分量集中到操纵设备的特定区域上。补充地或可替代地,为此目的,在另一光整形单元的上游还可以存在至少一个分色器,用于将所选择的波长指引至另一光整形单元。
51.在该上下文中,此外,可以有利地存在至少一个单独的光源,特别是另一激光器,用于光学地操纵样品。这种另一激光器优选地提供适合于样品的光学操纵的特定波长的光。因此,在这种方法变型中,样品被多色照明。
52.优选地以脉冲方式,特别是利用在皮秒范围内的脉冲持续时间操作一个或多个激光器,特别是用于时间分辨测量的激光器。
53.此外,以本身已知的方式,可以在照明光束路径中,特别是在相对于显微镜物镜的后瞳开口光学共轭的平面中存在用于波前调制的装置,特别是空间光调制器(slm)。为此,如果需要,可以在照明光束路径中存在中继光学单元,以便提供附加的光瞳面。从而提供照明场的自适应校正,以便确保用于相对厚的样品的最佳可能激发点扩展函数。
54.在根据本发明的方法的一个优选的变型中,检测器包括光子计数传感器,特别是spad相机,其像素在盖革模式(geiger mode)下操作,并且由检测器读出对应于光子检测事件的数字计数。因此,在每种情况下,用检测器的像素计数各个光子。这意味着可以在非常低的激发光强度下执行荧光测量,从而可以尽可能避免对样品,特别是活体生物样品的损坏。听过示例,可以使用在皮秒范围内脉冲的激光来检测染料的flim信号。与spad相机的积分或读出时间非常短相比,dmd的像素移动或不同照明图案之间的切换要慢得多,也就是说,是准静态过程。
55.在根据本发明的方法的特别有利的变型中,具体地设定检测器的各个像素的曝光时间。通过示例,取决于从样品获得的测量数据,可以具体地设定检测器的各个像素的曝光时间,也就是说,针对每个像素单独地和个别地设定曝光时间。结果,例如,对样品的相对弱发射的区域可以采用较长的曝光时间,而对样品的相对强发射的其他区域采用较短的曝光时间。
56.结果,对于样品具有特别轻微影响的根据本发明的方法的变体也成为可能,其中,一旦在记录图像的样品的至少一个区域中已达到信噪比的特定值,这些区域不再受到照明光的桩基。信噪比的极限或阈值可以由用户根据需要有利地设定,原则上对于不同的区域也可以社额定不同。
57.在根据本发明的方法的优选配置中,在光学激发和/或操纵样品之后执行时间分辨测量。
58.通过示例,在flim(flim=荧光寿命成像显微镜)的情况下,可以通过评估各个光子的检测时间来确定发射染料的荧光寿命。
59.关于控制检测器的控制图案,根据本发明的方法的另一有利变型在于以下事实,外推由样品,特别是生物样品的组分执行的移动。为此,可以在控制和评估单元中使用人工智能、图案识别和机器学习的方法。
60.像素化操纵设备,特别是dmd的结构可能在相机测量的图像中造成伪影。如果在检测器的积分时间内稍微致动扫描单元,则可以减少这些伪影。
61.这意味着检测器上模糊由dmd结构引起的伪影。通过示例,可以通过扫描单元,使待求和的各个图像之间的照明场横向移动艾里斑的一部分,特别艾里斑的是1%至50%,优选3%至30%,特别优选5%到15%。如果在两个独立的坐标方向(x,y)中移动待求和的各个图像之间的照明场,则可以特别有效地减少由dmd结构引起的伪影。
62.术语积分时间可以特别地表示对传感器的像素或像素组的或所有像素的信号进行积分的时间,也就是说,对其进行数字求和。
63.用spad相机,原则上可以连续测量光子通量,即无需计时。另一方面,对于spad相机,如在常规相机中那样,时钟或同步操作同样是可能的。但是,spad相机的一个特别优点在于,可以将不同的积分时间应用于图像的不同区域。原则上,有可能在每种情况下局部地对输入脉冲求和,也就是说在不同的时间段内“数字地”积分。这是spad技术的主要优势之一。
64.在根据本发明的方法的一种优选变型中,将借助于操纵设备和spad相机一起在不同的图像区域中在不同的时间段内进行积分,这将光输入减少到最小并且在处理措施上,最佳地取决于样品。
65.原则上,根据本发明的装置能够实现大量的方法变型。通过示例,可以执行原则上已知的样品的sim照明方法。还可以使用palm、d

storm、sofi和frap方法。
附图说明
66.在下文中,结合附图说明根据本发明的显微镜和根据本发明的方法的其他优点和特征。在图中:
67.图1示出了根据本发明的显微镜的第一示例性实施例;
68.图2示出了根据本发明的显微镜的第二示例性实施例;
69.图3示出了根据本发明的显微镜的第三示例性实施例;
70.图4示出了用于阐明根据本发明的方法的一种变型的检测器区域的示意图;以及
71.图5示出了用于阐明根据本发明的方法的另一变型的检测器区域的示意图。
72.在图中,相同且作用相同的部件通常由相同的附图标记标识。
具体实施方式
73.如图1所示,根据本发明的显微镜100的第一示例性实施例包括首先作为基本部件的用于提供照明光12的光源l、用于可变地产生照明光12的待选择的照明图案18的可控操纵设备16、具有用于将照明图案18指引至待检样品s上的显微镜物镜25的照明光束路径10、具有用于检测样品s发出的荧光32的多个像素36的检测器d、用于将样品s发出的荧光32指引至检测器d上的检测光束路径30、用于使照明光12和荧光32分离的主分束器19以及用于控制操纵设备16并评估检测器d测量的数量的控制和评估单元40。
74.在所示的示例性实施例中,光源l是激光器,其也可以被称为激发激光器。在图1的示例中,将在下文中被称为dmd矩阵或简称为dmd(数字微镜设备)的数字微镜阵列用作操纵设备16。控制和评估单元40可以是其性质原则上已知的计算设备。通常使用pc。在所示的示
例性实施例中,检测器d是spad相机。
75.根据本发明,dmd被设置在主分束器19上游的照明光束路径10中,也就是说,被设置在照明光束路径10中、仅是照明光束路径而不是检测光束路径的那部分中,特别是在相对于样品平面26光学共轭的平面15中。这意味着照明光束路径10将dmd矩阵16的表面成像到样品上。根据本发明,pc 40被配置为各个地并且以将取决于所选择的照明图案18选择的读出图案来激活检测器d的像素36。
76.照明光束路径10中的dmd矩阵16被激发激光器l照明。激光器l的波长可以是可设定的,或者可以从多个波长中选择。激光器l的强度可以例如通过图1中未示出的声光元件(aom、aotf)来设定。在图1中所示的示例性实施例中,衍射光学元件(doe=衍射光学元件)11被直接设置在激光器l的下游,并且确保均匀的光分布,即基本上具有矩形形状的空间强度分布。偏振分束器(pbs=偏振分束器)13和四分之一波片14被设置在dmd矩阵16的上游,使得来自激光器l并且线性偏振的光可以传播到dmd矩阵16。在dmd矩阵16处反射的照明光12由于其两次通过四分之一波片14而经历了90
°
的偏振旋转,并且在偏振分束器13处反射并经由透镜17传递到主分束器19。dmd矩阵16下游的照明光12具有分别选择的照明图案18。
77.代替偏振分束器(pbs=偏振分束器)13和四分之一波片14的组合,也可以使用tir棱镜,这在投影应用中是常见的。后一种解决方案的优点在于,可以将抑制光在几何上与所使用的光分离。
78.在图1所示的示例性实施例中,在主分束器19的下游,照明光12通过变焦光学单元20,并且在偏转镜21处反射之后,经由透镜22和镜筒透镜24传递到显微镜物镜25,并由后者聚焦到样品s上以进入样品平面26中。中间像平面29,即相对于样品平面26光学共轭的平面,位于透镜22和镜筒透镜24之间。变焦光学单元20使得能够将成像比例从dmd矩阵16扩缩成照明光束路径10的中间像平面中的中间图像。照明光束路径10将来自dmd矩阵16的照明图案18整体成像到显微镜物镜25的焦平面26中。由样品s发出的荧光32被显微镜物镜25捕获并经由相同的在该方向上被称为检测光束路径30的光束路径返回到主分束器19。在主分束器19处,荧光32被透射并由透镜34成像到spad相机d的像素36上。dmd矩阵16可以有利地近似像素准确地或像素忠实地成像在spad相机上。然而,这不是严格的要求,因为dmd矩阵16和spad相机d中的像素数量可以彼此不同。如果读取了spad相机d的所有像素36,则也可以仅在测量记录之后才分配spad相机d的各个像素36的测量信号。用于优化填充因子的微透镜阵列可以有利地存在于spad相机d的上游。dmd矩阵16的激活图案,即照明图案18和spad相机d的激活图案,即读出图案彼此协调,并且优选地可以同步地切换。在这种情况下,可以通过控制和评估单元40来实现同步。
79.dmd矩阵16一方面相对于样品平面26光学共轭,另一方面相对于spad相机d的检测平面光学共轭,但被设置在纯照明光束路径10中,其也可以被称为激发光束路径。spad相机d既用作传感器又用作可切换的针孔矩阵,使得可以借助于有目标地激活传感器像素36并给定相应的成像尺寸来实现共焦。
80.如果将变焦光学单元20设定为可通过dmd矩阵16寻址整个视场,则取决于所使用的物镜的dmd矩阵16的部分反射镜对应于直径为1到2au(1au=1艾里单位)的照明点。因此,在这种情况下,成像不受衍射限制,而是适合于记录快速概览图像。
81.如果将变焦光学单元设定成使得dmd矩阵16仅照明整个视场的一部分,例如一半,
则检测点扩展函数的共焦检测或过采样变为可能。为此目的,例如,检测点扩展函数在尺寸上可以对应于3个像素的直径,因此可以在7个位置处被采样。如果假设例如sdm(sdm=旋转盘显微镜)中常见的关系,则在各个检测点扩展函数的最大值之间大约有5au,因此大约有15个像素。用具有512
×
512像素的传感器矩阵,因此可以同时并且在每种情况下以过采样的方式记录大约900个检测点扩展函数。该示例仅用于说明可能性。当然,在本发明的范围内,参数的其他组合也是可能的。
82.关于可切换的照明图案18,图1的设置非常灵活。由此导致许多其他应用可能性。除了传统的常规照明图案18之外,例如,还可以应用随机选择的图案。可以通过顺序切换照明图案18来在样本s上限定和扫描线分布。另外,网格状的照明图案18也是可能的,其产生具有相应计算的共焦图像数据。此外,该系统原则上可以从样品s强烈、微弱或根本未发出的测量数据学习,并且可以相应地在这些区域中修改曝光持续时间,也就是说,原则上针对spad相机的每个像素36单独地修改。
83.由于原则上可以用spad相机d对检测点扩展函数进行过采样,因此也可以通过使用所谓的“扩展景深”成像的波前编码方法,同时测量来自样品s的多个平面的荧光。通过示例,为此目的,可以将三次相位掩模,例如slm,定位在照明光束路径10和/或检测光束路径30中。然而,原则上,这仅在样品s的特定z区域上产生投影。
84.此外,还可以对不同的样品平面,也就是说样品s的具有不同z坐标的平面,执行真正编码,以使得它们可分离。为此目的,通过示例,在照明光束路径10和/或检测光束路径30中,可以产生螺旋点扩展函数,或者原则上可以产生任何其他合适的点扩展函数,并且可以相应地评估信号。
85.如图2所示的根据本发明的显微镜200的示例性实施例与图1的显微镜100的区别仅在于纯照明光束路径10的区域,也就是说,主分束器19的上游的照明光束路径10的区域。在图的显微镜200的情况下,具有四分之一波片14和dmd阵列16的偏振分束器13由在显微镜操作期间旋转的两个盘42、43代替。在照明束路径10中面向激光器l的盘42承载微透镜矩阵,该微透镜矩阵将激光通过与各个微透镜相关联的针孔聚焦到在照明束路径10下游的可旋转光阑盘43上。可旋转光阑盘43,也可以被称为针孔盘,位于相对于样品平面26光学共轭的平面15中,并且经由基本上对应于图1的设置的下游光学单元成像到样品平面26,即显微镜物镜25的焦平面中。
86.具有微透镜阵列的盘42和光阑盘43以相对于彼此的高旋转速度、固定频率和相位关系旋转,从而扫描样品s上的激发点的图案。
87.由样品s在以这种方式照明的激发点处产生和发出的荧光32再次如图1的示例性实施例一样,经由检测光束路径30被成像回到spad相机d。因此,发射点或发射光点中的图案与盘42、43的旋转同步地在spad相机d上移动。使根据本发明用于控制spad相机d的读出图案与照明图案的移动同步。同步由pc 40实现,该pc 40从盘42、43的已知瞬时位置确定要编程到spad相机d中的读出图案,该图案也可以被称为激活图案。在这种情况下,通过快速光电二极管47将触发信号提供给pc 40,该快速光电二极管47测量通过旋转光阑盘43的一个光阑开口或位于离旋转轴相同距离的多个光阑开口的透射。为此,照明光12的一部分经由部分透射的反射镜44耦合出,并且用微透镜的设置,经由光阑46和经由盘42被指引至旋转光阑盘43上。此外,也可能将光从其他激光二极管耦合到针孔盘,而与其余光束路径无
关。
88.与图1中的示例性实施例中的dmd矩阵16类似,实现图2中的示例性实施例中的操纵设备16的旋转光阑盘43位于相对于样品平面26和相对于spad相机d的平面两者光学共轭的平面15中。对于本发明重要的是,操纵设备16,即旋转光阑盘43,也被设置在显微镜200的纯照明光束路径或激发光束路径中,即主分束器19上游的照明光束路径10中。如在图1的示例中,spad相机d既用作传感器又用作可切换的针孔矩阵,使得如上所述,可以借助于有目的地激活像素36和成像的给定适当尺寸来实现检测点扩展函数的共焦或过采样。
89.除了提供具有针孔光阑的设置的旋转光阑盘43之外,还可以使用其他光阑几何形状,诸如例如旋转盘中的槽。
90.图1和图2中的设置的共同之处在于,与现有技术不同,从样品s辐射回来的荧光32不必经由物理的针孔光阑或针孔,诸如dmd矩阵16的微镜或旋转盘上的实际针孔,聚焦回到检测器d上。相反,根据本发明,将从样品s辐射回来的荧光32直接成像到spad相机d上,并且在与照明图案18的限定的时间关系中,根据各自的瞬时照明图案18激活spad相机d的读出图案。原则上,如果适当地对spad相机d上的成像比例定尺寸或适当地选择变焦设定,则可以得到电可编程的动态针孔矩阵,该矩阵能够实现数据采集的共焦。
91.如果选择spad相机d上的成像比例以使得检测点扩展函数覆盖spad相机的多个像素36,则可以对信号数据进行过采样评估以使得即使针孔范围有限,也可以实现共焦极限分辨率。在这种情况下,可以根据所谓的图像扫描来计算spad相机的测量数据。
92.由于spad相机d的固有的高重复率,因此与现有技术相比,该功能的帧速率可能显著增加。此外,同样与现有技术相反,不必频闪地操作照明,而是可以提高帧速率本身。最初,这导致单个图像中每个像素的光子数量非常小。然而,然后可以考虑旋转光阑盘43的相应旋转相位来积分各个图像。在此,对本发明重要的是,如在ccd和cmos阵列的情况下,在传感器芯片上不执行信号数据的积分,而是在布置在spad相机d下游的缓冲存储器中执行。通常,这是所测量的光子计数事件的数字积分。
93.spad相机的潜在非常短的死区时间(10ns

100ns)可以实现超短积分时间。因此,可以在盖革模式下操作spad像素36,其中,计数各个光子。
94.与spad相机d的非常短的读出时间相比,图2中的盘的移动或在根据图1的设置中的不同照明图案18之间的切换是准静态过程。因此,可以使用在皮秒范围内脉冲的激光来检测染料的flim信号。
95.同样可以使用图1和2的显微镜100和200来测量较慢的过程。如果这样的过程例如在与各个区域的曝光时间相当的时间尺度内进行,也就是说,在毫秒范围内,如磷光过程,例如也可以以有关照明图案的时间延迟的方式激活检测器d上的读出图案,并且可以以时间延迟的方式相应地读出检测器d。在这种情况下,可以测量样品s的余辉,还可以从测量的延迟中获得有关相关过程的时间曲线的说明。
96.参考图3说明根据本发明的显微镜的第三示例性实施例。如其中所示,根据本发明的显微镜300与图1的显微镜100具有很大的相似性。特别地,主分束器19上游的照明光束路径10的区域中的显微镜300的配置与图1的显微镜100的配置相同,也就是说,在图3中也使用了dmd矩阵16,其被设置在相对于中间像平面29和相对于样品平面26光学共轭的平面15中。
97.与图1的显微镜100相比,图3的显微镜300的本质区别在于,在图3中,扫描单元50现在被设置在图1的偏转镜21的位置处,并且图1中存在的变焦光学单元20由包括透镜27和透镜28的中继系统代替。扫描单元50可以特别包括扫描镜,例如检流计扫描镜。因此,在图3的示例性实施例中,照明图案18经由主分束器19、透镜27,28、扫描单元50、透镜22,24和显微镜物镜25到达样品s上。
98.如图1和2所示,由样品s发出的荧光32被显微镜物镜25收集并准直。之后,荧光32被扫描单元50偏转到去扫描光束路径上,并在主分束器19处透射并成像到spad相机d上。
99.同样受控制和评估单元40控制的扫描单元50被用于将dmd矩阵16的图像定位在样品平面26中。照明场的这种位移也被称为平移。为了显微镜300的整个光学系统不变得太复杂和详尽,能够在去扫描光束路径中透射的场尺寸被限制为例如2mm的场对角线。去扫描光束路径是扫描单元50下游的检测光束路径30的部分。
100.通过这样的定尺寸,可以通过完全照明dmd矩阵16,实现与于艾里斑的五倍过采样相对应的0.2au的针孔尺寸。
101.由于dmd矩阵16的各个微镜的尺寸低于光学分辨率极限,因此已经显著地减少了由dmd矩阵16的结构引起的伪影,也被称为图案伪影。如果稍微致动扫描单元,则可以进一步减少这种伪影,即模糊不清。在下文中,结合图4更详细地说明。
102.如在图1中,根据本发明,使dmd矩阵16的照明图案18和spad相机d的读出图案彼此协调,特别同步地切换。通过控制和评估单元40再次实现同步。
103.如在图1的示例性实施例中,荧光32由设置在专用检测路径中的spad相机d检测。spad相机d的特点是高图像刷新率,因此可以在盖革模式下操作以对各个光子进行计数。优选地,仅激活,也就是说偏置检测所需的spad相机d的像素36。结果,可以最小化数据量并且可以提高信噪比(snr)。优选地,根据由dmd矩阵16产生的照明图案18来激活spad相机d的像素36。因此,不记录到在激活的像素36外、撞击到spad相机d上的光。因此,spad相机d的作用类似于传感器矩阵和可切换针孔矩阵的组合。本发明的主要优点在于,荧光32因此在到达spad相机d的途中不经由操纵设备指引,也就是说不经由dmd矩阵16指引。因此,可以避免在dmd矩阵16处反射时的强度损失。
104.例如,可以相对于根据本发明的显微镜的整个可寻址视场来对照明场,也称为pam子场(pam=可编程阵列显微镜)定尺寸,使得由100个pam子字段组成整个可寻址视场。借助于扫描单元50适当地位移和定位pam子场。整个可寻址视场,也称为全视场,通常在扫描单元50和显微镜物镜25之间的中间成像平面29之间具有20mm数量级的对角线。
105.如果dmd矩阵16被成像为中间像平面29中的中间图像,使得可以寻址具有例如对角线为2mm的部分场,然后借助于扫描单元50将其放在整个可寻址视场中的期望位置,将需要100个局部图像来扫描整个可寻址视场。例如,如果旨在以10fps(fps=每秒帧数)扫描整个可寻址视场,则每个部分图像的采集持续时间为1ms。例如,如果每个部分场的10%都被激活的像素填充,则在像素停留时间为100μs的情况下仍可以达到10fps,而无需过采样。在双重过采样的情况下,即在每个检测点扩展函数4个像素的情况下,仍然获得25μs的像素停留持续时间。如果与激光扫描显微镜相比,通常以1khz的双线速率扫描相同尺寸的视场,则在帧速率仅为3fps的情况下,像素停留持续时间仅为0.65μs。由于可以根据需要设定高平行度,因此根据本发明的显微镜,也可以被称为混合显微镜可以对样品非常柔和,但是与传
统激光扫描显微镜相比,显著更快地实现重复。
106.此外,可以实现适合于样品的测量以使得其snr已经足够高的区域不再进一步被测量并且装满光。首先,为此目的,可以使用用户方面的规定以及合适的算法。
107.有利地,在根据本发明的显微镜中,实际上可以消除pam显微镜常见并且源自到样品平面和检测器平面中的dmd矩阵的成像的图案伪影。
108.首先,在根据本发明的显微镜的情况下,这些图案伪影不如在现有技术的pam显微镜的情况下那样明显,其中,dmd矩阵的尺寸被定尺寸为整个视场,因为在根据本发明的显微镜的情况下,dmd矩阵16的反射镜子结构,即各个微镜优选地小于dmd矩阵16的光学平面上的衍射盘的直径。
109.如果图案伪影仍然可以清楚地可视,则在检测器d的积分时间期间,通过致动扫描单元50,也就是说特别是通过扫描镜的移动,可以实际上完全消除它们。结合图4更详细地说明。在此,图4中的线网格60对应于dmd矩阵16,其中,窄条66表示dmd矩阵16的各个反射镜之间的间隙。所述间隙是图案伪影的真正原因。正方形61标记了激活的部分反射镜,因此具有大约对应于衍射盘直径的边缘长度。在子图b)至d)中,使dmd阵列16到样品平面26中的成像在每种情况下,借助于扫描单元50在x方向(图4b)上和/或y方向(图4c,4d)上位移艾里斑直径的1/10。然后对记录有相对于彼此位移的光点图案的图像进行平均。结果,激发点扩展函数仅扩大到微不足道的程度,并且在衍射盘的大部分区域上明显减少了导致图案伪影的子结构。
110.就像可以以有目的地方式激活dmd矩阵16的各个微镜一样,也可以激活spad相机d的各个像素36。在这种情况下,可以首先通过选择spad相机d的连续像素36的数量来限定共焦针孔的尺寸。然后,在激活像素36上积分的相关激发点的信号对应于共焦检测模式下的强度值。在该上下文中,在其上积分了信号的激活像素36也被称为电子针孔。
111.图5示出了相对于spad相机d平面中的检测点扩展函数的尺寸的电子针孔的各种尺寸。在图5的所有3个子图中,检测点扩展函数由圆盘74表示。在图5a中,由正方形71包围的像素36被激活。这意味着在这种情况下,针孔的直径对应于1au,即在大小上等于检测点扩展函数74的范围。在图5b的情况下,由正方形72限定的电子针孔的线性范围大约是检测点扩展函数74的大小的两倍。因此,电子针孔72大于1au。这意味着在这种情况下无法再实现共焦分辨率。但是,仍然可以有效地抑制来自除焦平面以外的其他平面的背景光。最后,在图5c中,由正方形73限定的电子针孔小于1au。
112.由于spad相机d的像素化和高帧速率,可以评估检测点扩展函数的子结构,并且借助于反卷积或将信号移回到点扩展函数的中心位置以达到共焦极限分辨率并提高灵敏度。
113.用pam

lsm,还可以设定与lsm常见的点激发完全不同的照明光结构。为此目的,可以在dmd矩阵上编程所需图案。然后,spad像素的激活类似地进行。通过示例,可以用线照明来扫描pam子场,而不必安装和对准复杂的变形光学单元。因此可以实现非常高的并行度。此外,实现准共焦检测模式的结构化网格照明也是可能的。此外,由于dmd矩阵的像素光栅小于衍射盘,因此甚至可以直接进行sim照明。
114.然后,只要dmd矩阵和检测器d发生耦合,例如通过控制单元,就可以随机选择照明图案的结构。
115.本发明的一个主要应用是活细胞显微镜检查,其中,经常实现所谓的时间推移记
录,即时间序列记录。光毒性作用特别在那种情况下是有问题的。然而,在此描述的设置特别适合于以时间序列优化稍后记录的曝光,使得不包含任何发光结构的区域在随后的记录中不再被照明。为此目的,借助于合适的算法,控制和评估单元可以自动识别不包含任何信息,而仅包含暗噪声的区域。在随后的记录中,仅照明具有图像信息的区域,或者可选地,也可以照亮它们周围的小区域。另外,系统还可以对预期未来图像的哪些区域包含信息进行估计。为此目的,例如,可以外推由样品或样品的一部分实现的移动。例如,此处的一种应用可能是囊泡的移动。在这种情况下,有必要调整dmd和spad阵列上的切换图案,以及扫描仪速度和可选的激光功率。
116.机器学习领域的传统方法或可替代地算法可以为这些计算找到应用。在此用户也可以想到的是,在开始这样的时间序列时帮助系统学习(借助于所谓的注释)。因此,结果不仅产生了实现开环控制的系统,而且实现了具有自学习反馈的闭环控制系统。
117.可以将spad相机设计为使得可以实现皮秒范围内的时间分辨率。这使得时间分辨记录成为可能,其使荧光衰减行为或所谓的荧光寿命能够以图形方式表示。该选项适用于上述所有图像记录变体。
118.凭借非常高的记录速率和非常短的曝光时间,spad相机还允许使用各种高分辨率显微镜检查的方法。在这方面,例如已知的是,用这种类型的传感器可以使得诸如palm和d

storm的方法以及基于标准荧光团的闪烁行为的sofi成为可能。现在,像上文描述的设置一样,精确的设置允许这些方法以对样品特别柔和的方式实施,因为在此恰好局部适应的照明是有利的。
119.然而,除了纯成像之外,根据本发明的显微镜还可以有利地用于将成像与样品的光学操作相结合的方法,诸如例如越来越多地用于光遗传学中。根据本发明的显微镜允许照明图案和读出图案的自由切换。
120.如上所述,照明图案18和读出图案原则上可以彼此同步地切换,使得样品s上由照明图案18照明的位置也被同时读出。
121.如果打算光学地操纵样品s,则希望不检测在操纵过程期间,在样品的特定区域,此时在这些区域中,用特定波长激活光敏感通道蛋白中的通道的区域。然而,希望观察到样品对该操纵的反应具有时间偏移,该时间偏移应尽可能不显著地超过一毫秒。dmd允许将速度切换到khz范围内。spad相机的切换速度甚至更快。由于spad相机很坚固,因此在饱和操作期间,代替关闭像素36,甚至随后也可以去除那些不用于成像而是由操作辐射产生的信号。除了光遗传学操纵之外,当然还可以实现其他操纵方法,诸如frap。
122.对于所描述的组合操纵/成像的应用,操纵设备16,特别是dmd矩阵,不被均匀的激光场照亮,而是被布置在上游的另一光整形单元照亮是有利的,该另一光整形单元使光在操纵设备16上预整形,使得打算用于操纵的操纵设备16的区域比仅用于观察的区域更强烈地被照明。因此,本发明提供了一种特别适合于样品的光学操纵/成像的应用的装置。
123.此外,如果实现样品s的多色照明,则可能是有利的,其中例如,借助于上游光束整形单元,将通常小于450nm波长的非常短波的激活激光会聚到像场中的几个点上,同时激发激光在大面积上照明操纵设备16,特别是dmd矩阵16。
124.参考符号列表
125.10 照明光束路径
126.11 衍射光学元件
127.12 照明灯
128.13 偏振分束器
129.14 四分之一波片
130.15 相对于样品平面光学共轭的平面
131.16 可控操纵设备
132.17 准直镜
133.18 照明图案
134.19 主分束器
135.20 变焦光学单元
136.21 偏转镜
137.22 透镜
138.24 镜筒透镜
139.25 显微镜物镜
140.26 样品平面
141.27 中继透镜
142.28 中继透镜
143.29 中间成像平面
144.30 检测光束路径
145.32 由样品s发出的荧光
146.34 透镜
147.36 检测器的像素
148.40 控制和评估单元
149.42 可旋转微透镜阵列
150.43 可旋转光阑盘
151.44 输出耦合镜
152.45 偏转镜
153.46 光阑
154.47 光电二极管
155.50 扫描单元
156.60 线网格
157.61 激活的部分反射镜
158.66 对应于微镜之间的间隙的条带
159.71 =1au检测针孔
160.72 大于1au的检测针孔
161.73 小于1au的检测针孔
162.100 根据本发明的显微镜
163.200 根据本发明的显微镜
164.300 根据本发明的显微镜
165.d 检测器
166.l 光源
167.s 样品
168.x,y 坐标方向

技术特征:
1.一种显微镜,包括用于提供照明光(12)的光源(l),可控的操纵设备(16),所述操纵设备(16)用于可变地产生所述照明光(12)的待选择的照明图案(18),照明光束路径(10),所述照明光束路径(10)具有用于将所述照明图案(18)指引至待检验的样品(s)上的显微镜物镜(25),检测器(d),所述检测器(d)具有用于检测由所述样品(s)发出的荧光(32)的多个像素(36),检测光束路径(30),所述检测光束路径(30)用于将由所述样品(s)发出的所述荧光(32)指引至所述检测器(d)上,主分束器(19),所述主分束器(19)用于使照明光(12)和所述荧光(32)分离,控制和评估单元(40),所述控制和评估单元(40)用于控制所述操纵设备(16)并且评估由所述检测器(d)测量的数据,其特征在于:所述操纵设备(16)在相对于样品平面(26)光学共轭的平面(15)附近被设置在所述主分束器(19)上游的所述照明光束路径(10)中,能够由所述控制和评估单元(40)个别地并且以待选择的读出图案激活所述检测器(d)的像素(36),以及所述控制和评估单元(40)被配置为个别地或以取决于所选择的照明图案(18)的所选择的读出图案来激活所述检测器(d)的像素(36)。2.根据权利要求1所述的显微镜,其特征在于:用于产生待选择的照明图案(18)的所述操纵设备(16)包括多个像素。3.根据权利要求1或2所述的显微镜,其特征在于,所述操纵设备(16)包括数字微镜阵列(dmd)。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的显微镜,其特征在于:所述操纵设备(16)包括空间光调制器(slm)。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的显微镜,其特征在于:用于可变地产生照明图案(18)的所述操纵设备(16)包括可旋转光阑盘(43)。6.根据权利要求5所述的显微镜,其特征在于,所述可旋转光阑盘(43)包括多个针孔光阑,所述多个针孔光阑被螺旋状,特别是以阿基米德螺旋的形式设置,所述多个针孔光阑特别是nipkow盘。7.根据权利要求5或6所述的显微镜,其特征在于,所述可旋转光阑盘(43)包括多个槽。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述可旋转光阑盘(43)的上游存在微透镜阵列(42),所述微透镜阵列(42)将照明光(12)聚焦到所述光阑盘(43)的光阑开口上,并在操作期间以与所述光阑盘(43)相同的速度旋转。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的显微镜,其特征在于,所述控制和评估单元被配置为使所述检测器(d)的读出图案与由所述可旋转光阑盘(43)产生的照明图案(18)同步。10.根据权利要求5至9中的任一项所述的显微镜,其特征在于,存在用于测量通过所述可旋转光阑盘(43)的间歇性光透射或来自所述可旋转光阑盘(43)的间歇性光反射的光电二极管,以用于使所述检测器(d)的控制与所述可旋转光阑盘(43)的移动同步。11.根据权利要求1至10中的任一项所述的显微镜,其特征在于,所述检测器(d)包括spad阵列或spad相机。12.根据权利要求1至11中的任一项所述的显微镜,其特征在于,微透镜阵列存在于所述检测器(d)的上游。13.根据权利要求1至12中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述主分色器(19)的下游的所述检测光束路径(30)中存在至少一个发射滤光器,特别是具有多个发射滤光器的转换器。14.根据权利要求1至13中的任一项所述的显微镜,其特征在于,将所述操纵设备(16)的特定像素组成像到所述检测器(d)的所限定的像素组上,或者将所述操纵设备(16)的每个像素成像到所述检测器(d)的所限定的像素组上,或者将所述操纵设备(16)的特定像素组成像到所述检测器(d)的特定像素上,或者将所述操纵设备(16)的每个像素成像到所述检测器(d)的恰好一个像素(36)上。15.根据权利要求1至14中的任一项所述的显微镜,其特征在于,所述控制和评估单元(40)被配置为控制所述检测器(d),特别是以与对应于所选择的照明图案(18)的读出图案同步地控制所述检测器(d)。16.根据权利要求1至15中的任一项所述的显微镜,其特征在于,所述控制和评估单元(40)被配置为以在时间上相对于被辐射到所述样品(s)上的照明图案(18)偏移的方式,用读出图案来控制所述检测器(d)。17.根据权利要求1至16中的任一项所述的显微镜,
其特征在于,所述控制和评估单元(40)被配置为控制所述操纵设备(16)以在所述样品(s)上扫描照明图案(18),特别是点图案、线图案或网格状图案。18.根据权利要求1至17中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述主分束器(19)与所述显微镜物镜(25)之间和/或在所述操纵设备(16)与所述主分束器(19)之间和/或在所述主分束器(19)与所述检测器(d)之间存在变焦光学单元(20)。19.根据权利要求1至18中的任一项所述的显微镜,其特征在于,存在扫描单元(50),特别是具有检流计扫描镜的扫描单元(50),以用于横向位移照明场。20.根据权利要求1至19中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述主分束器(19)上游的所述照明光束路径(10)中存在偏光分束器(13)和四分之一波片(14)。21.根据权利要求1至20中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述照明光束路径(10)中存在tir棱镜。22.根据权利要求1至21中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述主分色器(19)上游的所述照明光束路径(10)中存在至少一个激发滤光器,特别是具有各种激发滤光器的转换器。23.根据权利要求1至22中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述照明光束路径中,特别是正好在所述光源的下游,存在衍射光学元件(21),以用于使所述照明光的分布均匀化的衍射光学元件(21)。24.根据权利要求1至23中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述操纵设备(16)的上游存在另一光整形单元,特别是空间光调制器(slm)。25.根据权利要求1至24中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述另一光整形单元的上游,存在至少一个分色器,用于将所选择的波长指引至所述另一光整形单元。26.根据权利要求1至25中的任一项所述的显微镜,其特征在于,存在至少一个单独的光源,以用于光学地操纵所述样品(s)。27.根据权利要求1至26中的任一项所述的显微镜,其特征在于,在所述照明光束路径(10)中,特别是在相对于所述显微镜物镜(25)的后瞳光学共轭的
平面中存在用于波前调制的装置,特别是空间光调制器(slm)。28.一种用于显微镜检查的方法,其中由光源(l)提供照明光(12),由可控的操纵设备(16)产生照明图案(18),所述操纵设备(16)用于可变地产生所述照明光(12)的待选择的照明图案(18),所述照明图案(18)经由带有显微镜物镜(25)的照明光束路径(10)指引至待检验的样品(s)上,由所述样品(s)发出的荧光(32)经由检测光束路径(30)被指引至具有多个像素(36)的检测器(d)上,并由所述检测器(d)进行检测,照明光(12)和荧光(32)由主分束器(19)分离,其特征在于,所述操纵设备(16)在相对于样品平面(26)光学共轭的平面(15)附近被设置在所述主分束器(19)的上游,以及个别地或以取决于所选择的照明图案(18)的所选择的读出图案激活所述检测器(d)的像素(36)。29.根据权利要求28所述的方法,其特征在于,特别是与由所述操纵设备(16)产生的所述照明图案(18)相对应的读出图案同步地,控制所述检测器(d)。30.根据权利要求28或29所述的方法,其特征在于,以时间上相对于辐射到所述样品(s)上的所述照明图案(18)偏移的方式,用读出图案控制所述检测器(d)。31.根据权利要求28至30中的任一项所述的方法,其特征在于,所述检测器(d)包括光子计数传感器,特别是spad相机,所述光子计数传感器的像素以盖革模式操作,以及通过所述检测器读出与光子检测事件相对应的数字计数。32.根据权利要求28至31中的任一项所述的方法,其特征在于,具体地设定所述检测器(d)的各个像素(36)的曝光时间。33.根据权利要求28至32中的任一项所述的方法,其特征在于,取决于从所述样品(s)获得的测量数据来设定所述检测器(d)的各个像素(36)的所述曝光时间。34.根据权利要求28至33中的任一项所述的方法,其特征在于,所述检测器(d)上的检测点扩展功能照明多于一个像素,特别是多于五个像素。35.根据权利要求28至34中的任一项所述的方法,
其特征在于,选择所述变焦光学单元(20)的设定,对所述设定,将所述操纵设备(16),特别是dmd矩阵,成像到整个视场上。36.根据权利要求28至35中的任一项所述的方法,其特征在于,选择所述变焦光学单元(20)的设定,对所述设定,将所述操纵设备(16),特别是dmd矩阵,成像到一部分视场上。37.根据权利要求28至36中的任一项所述的方法,其特征在于,所述照明场被扫描单元(50)横向位移。38.根据权利要求28至37中的任一项所述的方法,其特征在于,借助于所述操纵设备(16),用点、线或网格照明执行扫描。39.根据权利要求28至38中的任一项所述的方法,其特征在于,在所述检测器(d)的积分时间期间,轻微地致动所述扫描单元(50)。40.根据权利要求39中的任一项所述的方法,其特征在于,按照艾里斑的一部分,特别是艾里斑的1%至50%,优选地3%至30%,特别优选地5%至15%,通过所述扫描单元(50)横向移动待求和的各个图像之间的照明场。41.根据权利要求39或40所述的方法,其特征在于,在两个独立的坐标方向(x,y)上移动在待求和的各个图像之间的照明场。42.根据权利要求28至41中的任一项所述的方法,其特征在于,在对所述样品(s)进行光学激发和/或操纵之后执行时间分辨测量。43.根据权利要求28至42中的任一项所述的方法,其特征在于,以脉冲方式操作激光器(l)。44.根据权利要求28至43中的任一项所述的方法,其特征在于,外推按所述样品(s)——特别是生物学样品(s)——的组分所执行的移动。45.根据权利要求28至44中的任一项所述的方法,其特征在于,执行所述样品(s)的sim照明。46.根据权利要求28至45中的任一项所述的方法,其特征在于,多色照明所述样品(s)。47.根据权利要求28至46中的任一项所述的方法,其特征在于,
执行palm、d

storm、sofi或frap方法。48.根据权利要求28至47中的任一项所述的方法,其特征在于,一旦在记录的图像中,样品(s)的区域中达到信噪比的特定值,这些区域就不再受到照明光的撞击。49.根据权利要求42至48中的任一项所述的方法,其特征在于,通过评估各个光子的检测时间来确定发射染料的荧光寿命。
技术总结
本发明涉及一种显微镜,包括用于提供照明光的光源、用于以可变方式产生待选择的照明光的照明图案的可控操纵设备、具有用于将照明图案引导至待检验样品的显微镜透镜的照明光束路径、具有用于检查由样品发出的荧光的多个像素的检测器、用于将由样品发出的荧光引导至检测器的检测光束路径、用于使照明光和荧光分离的主分束器、用于控制操纵设备并评估由检测器测量的数据的控制和评估单元。所要求保护的显微镜的特征在于,操纵设备在样品平面的光学共轭平面附近、被设置在主分束器上游的照明光束路径中,使得使用控制和评估单元并且以待选择的读出图案个别地激活检测器的像素,并且控制和评估单元被设计为个别地或以取决于所选择的照明图案的所选择的读出图案激活检测器的像素。本发明进一步涉及一种用于显微镜检查的方法。方法。方法。


技术研发人员:丹尼尔
受保护的技术使用者:卡尔蔡司显微镜有限责任公司
技术研发日:2019.10.23
技术公布日:2021/6/29

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