用于在疾病的预防和或治疗中使用的疫苗的制作方法

专利2022-05-09  101


retrovirus k and cancer:innocent bystander or tumorigenic accomplice int j cancer,2015. 137(6):第1249

57页,以及gimenez,j.等人,customhumanendogenousretrovirusesdedicatedmicroarrayidentifiesself

inducedherv

wfamilyelementsreactivatedintesticularcanceruponmethylationcontrol. nucleic acids res,2010. 38(7):第2229

46页。内源因子也可以促进erv表达。例如,观察到由于病毒感染的人erv的激活。在流感和单纯疱疹病毒感染后检测到herv

w表达(nellaker,c.等人,transactivationofelementsinthehumanendogenousretroviruswfamilybyviralinfection. retrovirology,2006. 3:第44页),而在eb病毒感染后存在herv

k(sutkowski,n.等人,epstein

barr virus transactivates the human endogenous retrovirus herv

k18 that encodes a superantigen. immunity,2001. 15(4):第579

89页)。无论导致erv表达的机制如何,癌细胞都通过选择压力维持这些蛋白质的激活,表明erv在肿瘤中的有益效应(leong,s.p.等人,expressionandmodulationofaretrovirus

associatedantigenbymurinemelanomacells. cancer res,1988. 48(17):第4954

8页。)。
8.不仅人肿瘤与erv蛋白有关,而且鼠癌细胞也表达erv。这提供了研究erv对肿瘤进展的作用,并且测试靶向erv的治疗方法的完美模型生物。一种erv模型是黑素瘤相关逆转录病毒(melarv),其源于小鼠基因组中存在的鼠白血病病毒(mulv)的前病毒。大多数近交小鼠品系含有一个或两个失活的mulv拷贝(li,m.等人,sequenceandinsertionsitesofmurinemelanoma

associatedretrovirus. j virol,1999. 73(11):第9178

86页。)。然而,akr小鼠品系在基因组中具有三个插入片段,并且特征在于生命早期mulv的大量产生,导致自发性淋巴瘤的频繁发生。其它小鼠品系,如c57bl/6,只在生命的晚期自发地产生mulv颗粒。与人erv相似,其它几种鼠癌症模型同样表达mulv/melarv。
9.由于病毒宿主的免疫系统是抵抗感染的天然防御机制,因此许多病毒,且尤其是逆转录病毒已发展出逃避这种监视的策略。在不同病毒家族各处可以看到的一种机制[duch等人,wo2013/050048]是在包膜蛋白(env)中的免疫抑制结构域的发展,导致免疫系统在不同水平上的抑制。免疫细胞包括天然杀伤(nk)、cd8 t或调节性t(treg)细胞可以受到含有isd的病毒的影响[schlecht

louf等人(2010)]。
[0010]
许多erv含有具有免疫抑制结构域(isd)的蛋白质,并且在melarv env蛋白中也可以找到此类结构域(schlecht

louf,g.等人,retroviralinfectioninvivorequiresanimmuneescapevirulencefactorencryptedintheenvelopeproteinofoncoretroviruses. proc natl acad sci u s a,2010. 107(8):第3782

7页,以及mangeney,m.和t. heidmann,tumor cells expressing a retroviral envelope escape immune rejection in vivo. proc natl acad sci u s a,1998. 95(25):第14920

5页。)。通过将鼠白血病病毒env蛋白引入通常被免疫细胞排斥的肿瘤细胞内,已显示了isd在mulv或melarv中的重要性(mangeney,m.和t. heidmann,tumor cells expressing a retroviral envelope escape immune rejection in vivo. proc natl acad sci u s a,1998. 95(25):第14920

5页)。尽管是另外的外源性抗原,env转导的肿瘤细胞仍较快速地生长。这个观察通过由env蛋白介导的局部免疫抑制效应加以解释。isd影响着先天免疫系统和适应性免疫系统两者,如通过巨噬细胞、nk细胞和t细胞的抑制显示的(lang,m.s.等
人,immunotherapywithmonoclonalantibodiesdirectedagainsttheimmunosuppressivedomainofp15einhibitstumourgrowth. clin exp immunol,1995. 102(3):第468

75页)。此外,已提出了对调节性t细胞亚群的作用,其依次又抑制了其它免疫细胞(mangeney,m.等人,endogenousretrovirusexpressionisrequiredformurinemelanomatumorgrowthinvivo. cancer res,2005. 65(7):第2588

91页)。通过isd的免疫抑制的详细机制尚未完全理解,但该效应似乎主要由isd内的cks

17肽介导。cks

17对免疫系统具有不同作用,主要是通过改变细胞因子表达(haraguchi,s.,r.a. good和n.k. day

good,apotentimmunosuppressiveretroviralpeptide:cytokinepatternsandsignalingpathways. immunol res,2008. 41(1):第46

55页。)。
[0011]
靶向表达erv的肿瘤细胞的首批治疗方法之一包括施用单克隆抗体。因此,靶向herv

k env的抗体能够减少乳腺癌细胞系的肿瘤生长。wang

johanning等人显示,观察到的抗herv

k env单克隆抗体的效应通过癌细胞周期的改变和增加的细胞凋亡来介导。未由wang

johanning等人(wang

johanning,f.等人,immunotherapeuticpotentialofanti

humanendogenousretrovirus

kenvelopeproteinantibodiesintargetingbreasttumors. j natl cancer inst,2012. 104(3):第189

210页)测试的此类抗体的另一种可能效应可以是免疫抑制的预防。如同melarv env,herv

k env蛋白也含有isd,并且具有免疫调节功能(morozov,v.a.,v.l. dao thi和j. denner,thetransmembraneproteinofthehumanendogenousretrovirus
‑‑
k(herv

k)modulatescytokinereleaseandgeneexpression. plos one,2013. 8(8):第e70399页)。通过wang

johanning等人测试的方法包括免疫缺陷性无胸腺小鼠中的异种移植肿瘤。因此,herv

k的效应只能影响先天性免疫细胞,例如nk细胞。
[0012]
可以通过靶向erv来帮助根除肿瘤的适应性免疫应答的另一部分包括t细胞。例如,针对mulv env表位的过继性转移的t细胞与il

2组合能够根除肺转移黑素瘤细胞的肺转移(yang,j.c.和d. perry

lalley,theenvelopeproteinofanendogenousmurineretrovirusisatumor

associatedt

cellantigenformultiplemurinetumors. j immunother,2000. 23(2):第177

83页)。在关于herv

k的人源化小鼠模型中执行类似的实验。对t细胞进行遗传修饰,以在其表面上表达识别癌细胞上的herv

k env的嵌合抗原受体(car)。细胞毒性的car
t细胞能够裂解肿瘤细胞,并且预防转移以及肿瘤生长。
[0013]
除抗体或t细胞的直接注射之外,更实际、更便宜和有效的策略是通过疫苗接种的免疫应答诱导。简单的方法是用病毒编码的抗原的疫苗接种。然而,这种方法相当麻烦,因为首先必须分离并培养dc,然后用确定的hla限制性肽脉冲其,并且再注射到小鼠或患者内。
[0014]
更精巧的疫苗接种策略是将抗原(例如病毒包膜蛋白)在病毒样颗粒(vlp)上呈递给免疫系统,所述vlp由重组腺病毒编码(图1)。这些颗粒不含病毒核酸,且因此是非传染性的。尽管如此,vlp仍是高度免疫原性的,并且展示的蛋白质是自然环境中存在的。例如,在vlp中整合的病毒env蛋白呈现于病毒样表面上,所述表面促进正确的折叠和构象。除强免疫原性的优点之外,用vlp的疫苗接种策略还包括实践益处。因此,vlp相对易于生产,因为它们仅由单一或少数蛋白质构建,并且生产可以在细胞培养中执行。
[0015]
为了针对病毒或病毒相关疾病(例如表达erv的癌症)进行疫苗接种,整个env蛋白
应该理想地展示给免疫系统,以确保针对完整蛋白靶的免疫应答。然而,由于env蛋白含有isd,因此疫苗本身具有对于免疫方法不希望有的免疫抑制能力。为了克服这个缺点,将突变引入isd内以维持靶蛋白的天然构象,同时预防免疫抑制。
[0016]
测试病毒蛋白的isd中的失活突变的首批之一是schlecht

louf等人[schlecht

louf等人(2010)]。基于免疫抑制性合胞素2和非免疫抑制性合胞素1之间的比较研究[mangeney等人(2007)],schlecht

louf等人鉴定了使isd的活性无能,而不消除env蛋白的一般结构和功能性的突变。这个突变策略应用于其它病毒起源的蛋白质(例如htlv和xmrv),并且对于弗里德鼠白血病病毒(f

mlv)更广泛地进行测试。这项研究不仅揭示了nk细胞和t细胞两者通过isd的抑制,而且还显示了包含env蛋白中的突变isd的活减毒f

mlv病毒充当针对具有wt isd序列的相同病毒的疫苗。该保护是由于针对f

mlv表位的增加的抗体水平以及t细胞应答。他们的发现最终体现在专利申请wo 2011/092199中,其中重点在于已与人前列腺癌和慢性疲劳综合症有关的异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(xmrv)。因此,wo 2011/092199特异性地涉及xmrv中的isd突变,以及此类isd突变病毒用于疫苗接种策略的效用。
[0017]
isd突变的另一种应用在专利申请wo 2014/195510中进行描述。在这种情况下,在猫免疫缺陷病毒(fiv)中引入isd的突变,以便降低通过病毒的免疫抑制,同时仍维持其天然构象。wo 2014/195510描述了当在疫苗接种方法中施用、与mbp结合或在植入的肿瘤细胞中转导时,特定突变增加了针对fiv env蛋白的抗体应答。因此,wo 2014/195510涉及fiv env的isd中的突变,以及此类突变蛋白在针对由fiv或其它慢病毒的感染的疫苗接种方法中的用途。
[0018]
在专利申请wo 2013/050048中描述了解决病毒env蛋白中的更广谱的isd突变的另一种方法。特别地,wo 2013/050048涉及通过以下的抗原生成:首先鉴定有包膜的rna病毒中的isd,并且随后使这些结构域突变,以降低在疫苗接种期间的免疫抑制。isd鉴定策略基于以下4个参数:1)肽定位于有包膜的rna病毒的融合蛋白中,2)肽能够与膜相互作用,3)肽的一级结构(序列)中的高度同源性存在于病毒的目、科、亚科、属或种内,4)在给定构象下在融合蛋白的表面处的位置是由3d结构或抗体染色揭示的免疫抑制结构域的特征。在目标病毒env中的潜在isd的鉴定后,验证免疫抑制功能,并且随后将突变引入isd中,并且确认至少25%的免疫抑制减少。总之,wo 2013/050048描述了有包膜的rna病毒中的isd鉴定、isd突变肽的生成、以及所述肽作为疫苗的效用和抗体的生成。
[0019]
通过bayer等人[bayer等人(2010)]显示了在腺病毒载体中以及在病毒衣壳的表面上编码的同时抗原呈递的重要性。先前已知以帮助使b细胞受体交联的有序结构呈现抗原的益处。然而,通过编码不同的f

mlv蛋白,例如gag和env亚基gp70和p15e,同时在腺病毒衣壳蛋白pix上展示此类抗原,bayer等人显示了仅编码的和衣壳呈递的抗原的组合才能够增加功能性抗体的水平。这个观察归于以下事实:尽管在腺病毒衣壳上的呈递帮助使b细胞受体交联,但编码的抗原是促进b细胞的亲和力成熟的基本cd4
t细胞应答所需的。使用这种疫苗接种策略,bayer等人能够减少攻击后的f

mlv的病毒载量。然而,无法观察到针对靶抗原增加的cd8
t细胞应答的指示。
[0020]
shoji等人主要集中于基于腺病毒的hiv疫苗的优化。尽管密码子优化策略和不同启动子的使用,但他们还是经由可切割弗林蛋白酶位点(f2a)在腺病毒中共编码了gag和
env蛋白。这允许两种蛋白的同时表达,并且因此基于gag的vlp的原位形成。在他们的研究中,与不促进vlp的原位形成的其它展示策略相比,这种设置显示最高的免疫应答[shoji等人,2012]。
[0021]
duch等人2011(us20110305749a1)生产了基于vlp的逆转录病毒hiv疫苗,并且证实了isd突变的hiv包膜蛋白的免疫原性增加。vlp免疫原离体产生且纯化。
[0022]
us2012189647涉及由野生型包膜蛋白的跨膜亚基的免疫抑制结构域的突变产生的突变型包膜蛋白。us2009324553涉及适用于病毒颗粒与其它细胞膜的定向靶向和受控融合的嵌合多向性病毒包膜多肽。
[0023]
另外,通过hohn等人[hohn等人,2014]的出版物描述了当在cmv启动子下表达密码子优化版本的herv

k113时,病毒组装类型和形态改变。特别地,vlp保留在细胞表面处并且缺乏env。
[0024]
尽管有使病毒env蛋白中的isd突变并且使用腺病毒编码且展示病毒抗原的先前策略,但采用isd突变的过去疫苗接种策略专一地旨在预防病毒感染[schlecht

louf等人2010;wo 2011/092199;wo 2014/195510;us20110305749;wo 2014/195510]。因此,仍需要打破对自身抗原的耐受性。此外,在[luo等人(2003);sohji等人(2011);andersson等人(2016);andersson & holst(2016);andersson等人(2017)]之前已使用了病毒样颗粒的原位合成系统,用于hiv env和疟疾抗原,但不用于在原位合成的vlp上显示isd突变的erv env。此外,鉴于通过hohn等人的发现。还需要允许生产vlp,特别是herv

k vlp的有效系统。
[0025]
本发明旨在生产用于预防和/或治疗由内源性逆转录病毒引起的疾病的有效疫苗。本发明的疫苗显示来自由cd4t细胞或cd8t细胞起始的两种应答途径中任一者的改善的免疫应答。
[0026]
发明概述本发明涉及用于在疾病的预防和/或治疗中使用的疫苗,其包含能够编码病毒样颗粒(vlp)的腺病毒载体,所述vlp展示无活性的免疫抑制结构域(isd)。
[0027]
用于产生vlp的许多病毒载体用于疫苗的开发中,包括hiv、杆状病毒、慢病毒和腺病毒。本发明人显示,编码具有灭活的isd的erv的腺病毒载体出乎意料地表现出比例如与灭活的isd组合的hiv载体更佳。因此,本发明提供了出乎意料的高免疫应答,导致肿瘤中免疫抑制的促进。
[0028]
尽管预期任何腺病毒载体在本发明中都表现得令人满意,但目前的观点是当腺病毒载体衍生自哺乳动物腺病毒类型、人腺病毒类型、黑猩猩腺病毒类型或大猩猩腺病毒类型时,将获得最佳结果。人腺病毒载体以至少52种不同的血清型存在,例如1、2、5、19、28、35和40型。当选择人腺病毒时,人腺病毒载体衍生自d组载体、人腺病毒血清型ad5、人腺病毒血清型ad19a、人腺病毒血清型ad26或黑猩猩腺病毒血清型。由于良好的临床前免疫结果,本发明人已使用5型腺病毒(ad5)作为用于本疫苗载体的起点。ad5为何诱导针对靶蛋白的足够强的免疫应答的原因不仅是由于有效转运到抗原呈递细胞(apc)内,还在于载体本身刺激先天性免疫的佐剂特性。另外,诱导了免疫刺激性细胞因子如ifn、il

6、il

12、il

15和tnf

α的转录和释放。这些细胞因子在免疫系统中具有重要作用,并且充当关于适应性免疫应答的细胞的激活剂。ad5的特别优点是针对载体的免疫应答不太强,因为这阻止转基因表达。ad5使先天性免疫平衡到允许转基因表达的水平,同时仍激活适应性免疫应答。考虑
到通过matthew j. johnson等人(j immunol 2012;188:6109

6118)的出版物,其显示与重组腺病毒血清型5相比,重组腺病毒血清型28和重组腺病毒血清型35更有效地感染且导致人和小鼠树突状细胞两者的体外成熟和活化,出乎意料的是ad5在本文报道的实验中显示所需应答。另外,在通过matthew j. johnson等人(vaccine 32(2014)717

724)的另一篇论文中显示,相对于rad5和模拟感染的对照,重组腺病毒血清型28和重组腺病毒血清型35增加抗原呈递细胞(apc)例如单核细胞的凋亡。
[0029]
免疫抑制结构域(isd)可以被视为肿瘤平衡抗肿瘤免疫应答的机制,同时保留了由erv激活诱导的肿瘤促进炎症环境,类似于自然感染。由于巨噬细胞、nk细胞和t细胞的抑制,isd影响先天性和适应性免疫系统两者。然而,通过isd的免疫抑制的详细机制尚未完全了解。如通过本发明证实的,isd的失活相当大地增加了应答。
[0030]
isd区段可以通过一个或多个氨基酸的突变或缺失而失活。在通过突变执行失活的情况下,一个或多个氨基酸与不同的氨基酸交换,所述氨基酸通常选自其它19种天然存在的氨基酸。在缺失的情况下,isd区域中的任何一个或多个氨基酸可以缺失。本领域技术人员具有足够的知识和经验,任选地通过初步试验的评估来交换哪些氨基酸,以使他或她获得令人满意的免疫应答。
[0031]
在本发明的某些实施方案中,isd具有肽序列lanqindlrqtviw(seq id no. 1)、lasqindlrqtviw(seq id no. 2)、lqnrrgldlltaekggl(seq id no. 3)、lqnrraldlltaerggt(seq id no. 4)、lqnrrgldmltaaqggi(seq id no. 5)、或yqnrlaldyllaaeggv(seq id no. 6),其具有至少一个氨基酸缺失或与不同的氨基酸交换。优选与原始不同的氨基酸选自天然存在的氨基酸中。在本申请的实施例中使用的ad5中编码的erv的isd区段具有下述氨基酸序列:lqnrrgldllflkeggl(seq id no. 7)。可以通过在氨基酸序列中执行一个或多个突变来使isd失活。尽管本领域技术人员能够通过执行任何数目或形式的突变或缺失来修饰氨基酸序列,但目前适合交换单个氨基酸,即,本发明中优选使用的isd具有下述序列:lqnrrgldllflkrggl(seq id no. 8)。
[0032]
在isd区段上游或下游的区域中交换一个或多个氨基酸可能是优选的。突变是补偿性突变,预期保存结构域的结构,使得它仍可以对于感染性病毒起作用。因此,在某个实施方案中,在isd上游或下游的10个氨基酸的区域中的至少一个氨基酸与不同的氨基酸交换。在图3中所示的具体实施方案中,将isd区域侧翼的第3个氨基酸交换为a

>f突变。
[0033]
为了使isd根据本发明失活,与通过原始isd执行的免疫抑制相比,免疫抑制能力需要减少70%或更多。在本发明的一个优选实施方案中,与通过原始isd执行的免疫抑制相比,isd被失活80%或更多,例如90%或更多,例如95%或更多,例如99%或更多。
[0034]
本发明提供了用于展示针对机体的免疫系统的抗原的通用平台。因此,原则上可以将希望产生针对其的免疫应答的任何类型的蛋白质的编码掺入腺病毒载体中。在本发明的一个优选方面,抗原是内源性逆转录病毒包膜蛋白(erv env)或衍生自此类蛋白的免疫原性蛋白。一般认为病毒编码的病毒样颗粒的疫苗将erv env导向树突状细胞(dc),所述树突状细胞将抗原呈递给适应性免疫系统的细胞。在mhc i类上的呈递诱导cd8 t细胞的活化和增殖。对于erv env的抗原特异性的这些细胞毒性t淋巴细胞(ctl)浸润肿瘤,并且杀死展示相应抗原的细胞。通过专门抗原呈递细胞(apc)在mhc ii类上的抗原呈递激活cd4 t细胞,其随后共激活b细胞。在循环中遇到erv env靶蛋白或vlp上展示的抗原的活化b细胞
释放对于erv env特异性的抗体。这些抗体能够结合其在癌细胞上的靶,诱导恶性细胞的破坏和吞噬作用。以这种方式,erv特异性抗体能够(bale)预防肿瘤生长和转移。肿瘤细胞的恢复的免疫原性使得能够引发识别不同的肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原的一组多样性肿瘤特异性t细胞。新近引发和扩展的ctl浸润肿瘤并杀死恶性细胞。
[0035]
尽管本疫苗原则上可以用于免疫许多哺乳动物物种,并且实际上已使用小鼠模型进行开发,但在本发明的一个优选方面,erv蛋白是人内源性逆转录病毒(herv)蛋白或其免疫原性部分。据估计,每一个人基因组由约8%的内源性逆转录病毒dna组成。然而,大多数内源性逆转录病毒dna仅是以前逆转录病毒的遗留物。erv是在古代祖先中由逆转录病毒的远古感染的证据。感染后,病毒rna被逆转录成前病毒dna,其整合到宿主基因组内。最终,前病毒被整合到种系的细胞内并且变成可遗传的,产生了内源性逆转录病毒。经过数百万年,病毒dna世代相传并且在人群中变得被固定。结果是人基因组的很大一部分潜在地可以被用作腺病毒载体的抗原编码部分。当前,herv优选地选自herv

k、herv

h、herv

w、herv

frd和herv

e。更具体地,herv

k可以选自herv

k108(=ervk

6)、ervk

19、herv

k115(=ervk

8)、ervk

9、herv

k113、ervk

21、ervk

25、herv

k102(=ervk

7)、herv

k101(=ervk

24)、herv

k110(=ervk

18);herv

h可以选自herv

h19(=herv

h_2q24.3)、herv

h_2q24.1中;herv

w可以选择为ervw

1(=合胞素

1);并且herv

frd可以选择为ervfrd

1(=合胞素

2)。
[0036]
这样构建腺病毒载体,以便允许将编码的erv蛋白呈递给免疫系统,以建立合适的免疫应答。在本发明的一个合适方面,erv蛋白表位或其免疫原性部分置于跨膜结构域和isd之间。
[0037]
本文报道的实验显示,腺病毒编码的isd突变的herv

k vlp不仅在ad5中而且在另一种腺病毒血清型即ad19中的应用(参见实施例15至17)。以前,herv

k已与癌症表达相关,并且显示为含有功能性包膜isd结构域,其体外活性类似于hiv(morozov等人2013)。在小鼠中,herv

k是外源抗原,并且具有类似的isd结构域活性,isd突变无法先验地预期增强免疫应答。然而,惊讶地发现,isd突变增加了针对herv

k env p15e和su结构域蛋白的抗体应答、t细胞应答和抗癌保护。herv

k中的突变与本文对于melarv公开的突变不同,因为病毒家族在isd序列方面不同。然而,基于本文提供的信息和一般常识,技术人员可以在其它病毒家族中也鉴定出使isd失活的合适突变。本文使用的herv

k突变受hiv中的isd突变启发,所述isd突变显示保存病毒的感染性以及herv

k和hiv

1之间的位点特异性保守性(morozov等人2012)。在分析载体转染的细胞后,发现herv

k突变的细胞内和细胞表面表达增加(参见实施例15和图24),其可以有助于解释增加的免疫原性,并且提供了使用可能形成或可能不形成vlp的任何基因表达平台和构建体,用于在herv

k家族env蛋白中制备isd突变的另外的机制原理。
[0038]
因此,本发明还涉及编码erv包膜蛋白或其免疫原性部分的核酸分子,其中所述蛋白的isd含有致使isd失活的突变。优选地,erv是人内源性逆转录病毒(herv),更优选地,herv是herv

k。进一步优选isd中的突变用丙氨酸替换q525,使得突变的isd的序列变为nsqssidqklanaindlrqt(seq id no.50)(代替nsqssidqklanqindlrqt;seq id no. 49)。应理解,还设想了isd中具有不同序列的相应突变。在一个进一步优选的实施方案中,核酸分子包含在腺病毒载体中。更优选地,腺病毒载体是腺病毒载体19型(ad19)。进一步优选包含核酸的腺病毒载体编码vlp。本发明进一步涉及由所述核酸分子或所述载体编码的蛋白质。
核酸分子、载体或编码的蛋白质待用于疾病的治疗或预防中,该疾病优选为癌症。待治疗的癌症是表达相应erv的癌症。优选地,所述治疗包括“引发

加强方案”,其中首先施用具有腺病毒或核酸分子的引发,随后为mva、腺病毒或dna加强的以后施用。优选地,加强是mva加强。设想了关于引发和加强的不同时机。特别是在具有最小残留疾病的癌症患者中,引发和加强之间的长间隔是可能的。在一个优选方案中,在引发后4至8周施用加强。
[0039]
在根据本发明的疫苗的一个优选方面,腺病毒载体的蛋白质产物包括gag蛋白、2a肽和包膜蛋白(env)。此外,env蛋白可以包含表面单元(gp70)、切割位点和跨膜单元(p15e)。另外,跨膜单元(p15e)可以包含融合肽、免疫抑制结构域(isd)、跨膜锚和细胞质尾部。
[0040]
为了改善疫苗的免疫抑制,将p15e或其免疫原性部分与腺病毒衣壳蛋白pix偶联可能是合适的。为了实现这点,将p15e n末端融合到pix的c末端。pix的高度有序结构及其在腺病毒表面上的结合抗原帮助交联b细胞受体。作为另一个优点,pix通常作为三聚体展示,并且也可以帮助呈递以天然三聚体形式的结合p15e抗原。这种修饰显示为增加cd1小鼠中的特异性抗体的诱导。
[0041]
在本发明的某个方面,由腺病毒载体编码的信号肽与来自高斯(gaussia)萤光素酶的信号肽(lucsp)交换。这种信号肽增加了蛋白质向细胞外膜的转运,而不改变糖基化状态。因此,包括这种信号肽而不是天然序列已将合成的蛋白质导向膜,在其中它们被整合到vlp内。
[0042]
在本发明的另一个方面,由腺病毒载体编码的跨膜锚和细胞质尾部与来自甲型流感病毒血凝素的跨膜结构域和细胞质尾部交换。插入增加了重组蛋白质在细胞表面和vlp上的表达,其导致强且广泛的抗体应答。在一个优选实施方案中,由腺病毒载体编码的跨膜锚和细胞质尾部与来自甲型流感病毒血凝素h3n2(ha

tmct)的跨膜结构域和细胞质尾部交换。
[0043]
在本发明的另一个方面,三聚化序列在信号肽附近提供。三聚化序列可以加入蛋白质中,以促进天然呈递。在一个优选方面,三聚化序列是gcn4。
[0044]
腺病毒载体的蛋白质产物通常包含gag蛋白,其中所述gag蛋白是外源性逆转录病毒gag蛋白或内源性逆转录病毒gag蛋白。
[0045]
腺病毒载体通常需要细胞用于产生病毒样颗粒。因此,腺病毒载体感染细胞并产生用于vlp的组分。在本发明的某个方面,vlp在分离的细胞系中产生。合适的例子包括sf9细胞、vero细胞、hela细胞等。然而,目前期望在已被腺病毒载体感染的患者体内的细胞中产生vlp。这种产生也称为病毒编码的病毒样颗粒(ve

vlp),并且具有避免产生vlp的中间宿主的优点。
[0046]
本发明还涉及编码能够形成病毒样颗粒(vlp)的靶蛋白的核酸构建体,其中所述靶蛋白包含免疫抑制结构域(isd),所述isd是无活性的。
[0047]
本发明特别适合于癌症的预防和/或治疗。通过本发明治疗的癌症的类型并无特别限制,并且包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、黑素瘤、白血病、肉瘤、结肠直肠癌、睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌和肝癌。
[0048]
在某些条件下,使用引发

加强方案治疗患者可能是有利的。因此,在本发明的实施方案之一中,疫苗在癌症的预防和/或治疗中的使用包括在用上文公开的疫苗加强之前
至少5天,用核酸构建体引发患者的步骤。
[0049]
本发明还涉及用于在癌症的预防和/或治疗中使用的疫苗,其包括在患者暴露上文公开的疫苗5天或更长时间后,用与衍生自腺病毒载体的vlp不同的病毒编码的vlp后处理患者的步骤。在某个实施方案中,与衍生自腺病毒载体的vlp不同的病毒编码的vlp是衍生自改良的痘苗安卡拉(modified vaccina ankara)(mva)的vlp。
[0050]
进一步地,惊讶地发现
ꢀ–ꢀ
与通过hohn等人2014关于在cmv启动子下的密码子优化的herv

k113报道的那种相反
ꢀ–ꢀ
使用的表达盒,即gag

p2a

env,其中再次在强启动子下env以1:1的比率与eng一起表达,并未导致在细胞膜处的保留。相反,表达了vlp,其(再次与hohn等人报道的结果相反也含有env。这显示了与不含p2a(或相应的可操作的接头)的构建体相比,具有gag

p2a

env的遗传平台表现得更好。
[0051]
因此,本发明进一步涉及编码gag蛋白和erv包膜蛋白(env)或其免疫原性部分的核酸分子,其中连接gag和env的天然基因组结构已替换为可操作的接头。优选地,所述可操作的接头是p2a。换言之,本发明还涉及包含gag可操作的接头

env表达盒,优选为gag

p2a

env盒的核酸分子。优选地,erv是herv

k。更优选地,erv是herv

k113。进一步优选herv

k序列是herv

k共有序列,更优选密码子优化的共有序列。再更优选地,herv

k密码子优化的共有序列是下述氨基酸序列(seq id no. 55):
[0052]
进一步优选herv

k在其isd中含有突变(其在上文序列中是加下划线和以粗体印刷的)。含有此类突变的特别优选的序列显示于seq id no. 48中。
[0053]
进一步优选核酸分子是腺病毒载体。设想了核酸特别在疾病优选癌症的预防和/或治疗中可以用作基因疫苗。可替代地,核酸分子也可以用于在体外产生vlp,特别是herv

k vlp。然后,所得到的vlp可以用于免疫疗法中,特别是疾病优选癌症的预防和/或治疗中。
应理解,同样在这个上下文中,待治疗的癌症是表达erv的癌症。
[0054]
另外,本发明还涉及由编码gag蛋白和erv包膜蛋白(env)或其免疫原性部分的核酸分子编码的vlp,其中连接gag和env的天然基因组结构已替换为可操作的接头。优选地,所述可操作的接头是p2a。进一步优选erv是herv

k。更优选地,erv是herv

k113。优选地,与根据由hohn等人描述的方法产生的herv

k113 vlp相比,所述vlp含有更高量的env。如上文提及的,设想了此类vlp在免疫疗法中的用途。此外,本发明涉及用于在疾病的预防和/或治疗中使用的核酸分子或vlp。优选该疾病是癌症。应理解,癌症是表达相应erv的癌症。
[0055]
附图简述在本公开内容的下述详细部分中,参考附图中所示的示例实施方案更详细地解释方面、实施方案和实现,其中:图1公开了病毒载体编码的病毒样颗粒的机制。该疫苗包含编码病毒gag和env蛋白的重组腺病毒(ad5)。注射后,ad5感染细胞并诱导编码蛋白的表达。gag和env经由可自切割的肽(p2a)偶联,所述肽确保两种蛋白质的等摩尔表达,以及在翻译时的分开。单独的结构蛋白gag足以诱导细胞膜的出芽和病毒样颗粒(vlp)的形成。在vlp形成过程中,env与gag结合并且整合到释放的vlp内。因此,用ad5载体的疫苗接种诱导了vlp的产生,所述vlp在其表面上向免疫系统展示靶蛋白env。
[0056]
图2显示了mulv/melarv包膜蛋白的示意性结构。包膜蛋白(env)由两个亚基组成。(左)跨膜亚基p15e(tm)锚定在细胞膜中,并且含有免疫抑制结构域(isd)和融合肽。p15e经由二硫桥与表面亚基gp70(su)共价偶联。p15e且尤其是isd被gp70屏蔽,以防止抗体结合。(右)蛋白质亚基表达为在加工过程中切割并转运至膜的前体蛋白质。该图由mangeney等人2007修改。
[0057]
图3显示了在疫苗编码的melarv env(p15e)的isd中的突变。p15e的isd中的两个氨基酸被突变,以使免疫抑制机制失活。因此,执行下述氨基酸改变:e
14

r
14
和a
20

f
20

[0058]
图4显示了768tet和capture

pbgh的载体图。具有相关基因的dna载体768tet(a)和capture

pbgh(b)。质粒图中并未显示质粒中存在的另外基因。首先将靶蛋白克隆到表达载体768tet(a)内。随后通过同源重组,将包括靶蛋白的表达盒克隆到人ad5(had5)基因组载体capture

pbgh(b)内,以在生产细胞系中产生重组病毒。
[0059]
图5公开了用于重组ad5产生的步骤。该方案显示了将靶蛋白克隆到capture

pbgh内,随后为病毒产生的过程。重组ad5的产生包括生成含有重组病毒的“病毒裂解产物”、“3天裂解产物”和“大规模裂解产物”的连续步骤。
[0060]
图6:用于p15e特异性抗体应答的elisa分析的肽。指向为tm(p15e)的melarv env的区域作为肽合成,并且用于来自疫苗接种小鼠的血清样品的elisa分析。
[0061]
图7:在cd1小鼠中由ad5

melarv

isd诱导的抗体应答。(a)疫苗接种的cd1小鼠的血清中的p15e特异性抗体(疫苗接种时间线iv)。小鼠首先用编码melarv、melarv

isd或gfp的dna(在图下描绘)进行疫苗接种,随后为不同的ad5加强(图例)。用于加强的疫苗是ad5

melarv(深灰色)、ad5

melarv

isd(浅灰色)或ad5

gfp(白色)。通过elisa分析与p15e的抗体结合。条形图显示了相对于lev76对照血清的平均吸光度与sem。样本大小为每个组中n = 5。(b)b16f10

gp特异性抗体。使b16f10

gp细胞和与(a)相同的小鼠的血清一起温育。使用流式细胞术,用apc偶联的针对小鼠igg的二抗检测结合抗体。每个疫苗组的平均荧光强度
展示为平均值与sem。星号指示了组间的显著差异,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0062]
图8:在接种ad

melarv

isd疫苗的c57bl/6小鼠中的抗体应答和转移计数。根据疫苗接种时间线iii,在引发

加强方案中,用dna

melarv和ad5

melarv(dna ad5

melarv)或dna

melarv

isd和ad5

melarv

isd(dna ad5

melarv

isd)给小鼠接种疫苗。(a)癌症特异性抗体与b16f10

gp细胞的结合。使用apc偶联的针对小鼠igg的二抗,通过流式细胞术分析了对于肿瘤细胞特异性的疫苗接种小鼠的血清中的抗体。条形图显示了每个组中的结合抗体的平均荧光强度。(b)通过elisa分析与p15e结合的抗体。值显示了每个组的平均值与sem。(c)疫苗接种小鼠用b16f10

gp细胞进行i.v.攻击,并且在14天后分析肺转移。水平线指示每个组中的转移的平均数目。组包括n=7(dna ad5

melarv)或n=8(dna ad5

melarv

isd)只小鼠。
[0063]
图9:在balb/c小鼠中由ad5

melarv

isd诱导的t细胞应答的elispot分析。用ad5(ad5

melarv或ad5

melarv

isd)的单次疫苗接种后21天,分离balb/c小鼠的脾脏。用ah1刺激脾细胞,并且在elispot测定中,通过ifnγ产生来检测活化的免疫细胞。结果计算为每106个脾细胞的斑点数目(产生ifnγ的细胞)。条形图指示了每个组(n=5)中的平均斑点数目与sem。星号指示与pbs对照的显著差异,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0064]
图10:在balb/c小鼠中由ad5

melarv

isd诱导的t细胞应答的ics分析。通过用ah1刺激后的细胞内染色(ics),就t细胞中的细胞因子ifnγ和tnfα的产生分析了与图9中相同的脾细胞。该图显示了整个脾脏中的活化(cd44 )、产生ifnγ或tnfα的cd8 t细胞的总数目。(a)ifnγ阳性cd8 t细胞。(b)tnfα阳性cd8 t细胞。(c)通过将ifnγ cd8 t细胞的数目乘以ifnγ 细胞的平均荧光强度,来计算每只小鼠中产生ifnγ的cd8 t细胞的积分几何平均值。(d)双阳性cd8 t细胞。水平线指示每个组的平均值。星号显示了组间的显著差异,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0065]
图11:ad5

melarv相对于ad5

melarv

isd接种疫苗的cd1小鼠中的ad5

特异性抗体的滴度。根据疫苗接种时间线iv,用ad5

melarv或ad5

melarv

isd给cd1小鼠接种疫苗。通过用ad5颗粒包被elisa板,通过elisa分析血清的ad5特异性抗体。来自每只小鼠的血清以1:2系列稀释进行测试,以获得抗体滴度。关于阳性结果的截断值是背景od450的4倍。条形图显示了每个组的平均滴度与sem。组包含n=5只小鼠。星号指示了组间的显著差异,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0066]
图12:来自在腺病毒pix蛋白上展示的p15e的氨基酸序列的节选。完全序列在序列表中表示:pix

p15e(seq id no:51;pix

p15e

isd(seq id no:52),pix

p15e

truc

wc(seq id no:53);pix

p15e

trunc

w/oc(seq id no:54)。
[0067]
图13:展示重组pix的腺病毒载体的表征。(a)将编码重组pix的pcdna3

pix

taglinker

xxx质粒转染到hek293细胞内,以验证正确的表达。通过使用抗pix抗体的蛋白质印迹分析转染细胞的细胞裂解产物。第1行)pix

p15e,第2行)pix

p15e

isd,第3行)pix

p15e_trunc

wc,第4行)pix

p15e_trunc

w/oc,gfp行pix

gfp。(b)通过使用抗

pix抗体的蛋白质印迹,就重组pix的整合分析产生且纯化的病毒。行号表示与ad5载体上显示的(a)中相同的pix修改,而行
ø
表示不含pix修改的天然ad5。
[0068]
图14:接种ad5

pix疫苗的cd1小鼠中的抗体应答。(a)pix修饰的ad5疫苗(条纹条)在cd1小鼠中进行测试(接种时间线iv),并且与其未修饰的配对物(纯色条)进行比较。腺病毒(展示天然或重组pix的ad5

melarv或ad5

melarv

isd)在dna引发疫苗接种的基础上进行测试,用dna

melarv或dna

melarv

isd。gfp疫苗接种的小鼠充当阴性对照。在450nm处评价了抗体与melarv env跨膜亚基p15e的肽的结合,并且针对标准lev76对照血清的吸光度进行标准化。(b)与(a)相同的血清样品就与b16f10

gp癌细胞的结合进行分析。使用流式细胞术,用apc偶联的针对小鼠igg的二抗检测结合抗体,并且通过平均荧光强度进行定量。lev76对照血清和仅二抗(仅2.ab)分别充当阳性对照和阴性对照。条形图显示了每个组(n=5)的平均值与sem。星号指示了组间的显著差异,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0069]
图15:在接种ad5

melarv_pix

p15e疫苗的c57bl/6小鼠中的抗体应答和转移计数。根据疫苗接种时间线v,用ad5

melarv_pix

p15e或这种病毒的天然形式(ad5

melarv)给小鼠接种疫苗。疫苗接种gfp的小鼠充当阴性对照。(a)通过流式细胞术分析针对疫苗接种小鼠的血清中的b16f10

gp肿瘤细胞的抗体应答。包括lev76对照血清作为阳性对照。仅与二抗(仅2.ab)一起温育的肿瘤细胞充当阴性对照。(b)通过elisa分析p15e特异性抗体应答。在450nm处测量的吸光度针对lev76对照血清进行标准化。(a)和(b)中的每个组含有n=5只小鼠。显示的值是每个组的平均值与sem。(c)用b16f10

gp细胞攻击后,疫苗接种小鼠中的肿瘤转移的数目。水平线指示了每个组的平均值。(d)b16f10

gp特异性抗体与转移计数之间的相关性。(e)p15e特异性抗体与转移计数的相关性。相关性的计算中不包括阴性对照(gfp对照)。
[0070]
图16:疫苗改善策略:嵌合melarv env蛋白具有功能结构域以改善在vlp上的展示。用全长melarv env(ad5

lucsp_melarv_ha

tmct)或单独的p15e(ad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct)生产两种修饰的疫苗。在ad5

lucsp_melarv_ha

tmct中,melarv env的天然信号肽被交换成萤光素酶信号肽(lucsp)。此外,天然的跨膜结构域和细胞质尾部(tmct)改变成甲型流感病毒血凝素h3n2(ha

tmct)的相应序列。在ad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct中,仅编码了p15e,而不是全长env蛋白。p15e同样地含有ha

tmct,并且在n末端处添加lucsp。另外,还包括三聚化序列(gcn4)。
[0071]
图17:用编码嵌合melarv env蛋白的重组ad5感染后,melarv env在细胞上的表达。测试了具有修饰的melarv env序列(ad5

lucsp_melarv_ha

tmct和ad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct)的疫苗病毒在受感染的vero细胞上的靶蛋白表达。为了比较结果,还包括ad5

melarv和ad5

melarv

isd。用修饰的病毒感染vero细胞,并且用针对melarv env的不同抗体分析了在细胞上的靶蛋白表达:(a)19f8(抗p15e,靶向isd),(b)4f5(抗p15e),(c)mm2
ꢀ‑
9b6(抗gp70),(d)mm2

3c6(抗gp70),(e)mm2

9a3(抗gp70)。通过流式细胞术,用分别的荧光偶联的二抗检测抗体与受感染细胞的结合。条(其中n=1)代表由荧光缀合的抗体引发的平均荧光强度。
[0072]
图18:用编码嵌合melarv env的ad5感染的细胞中的靶蛋白表达和vlp释放的分析(蛋白质印迹):用修饰的病毒感染vero细胞。通过用不同抗体的蛋白质印迹,就靶蛋白表达分析了细胞裂解产物和释放的vlp:(a)抗p2a(melarv gag),(b)4f5(抗p15e),(c)mm2

9b6(抗gp70)。另外,通过蛋白质印迹,就p15e(4f5)(d)和gp70(mm2

9b6)(e)的分泌分析了受感
染细胞的上清液。第1行)ad5

melarv,第2行)ad5

melarv

isd,第3行)ad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct,第4行)ad5

lucsp_melarv_ha

tmct,第
ø
行阴性对照病毒。表6中列出了预期的条带大小。
[0073]
图19:用编码嵌合melarv env的ad5感染的细胞中的靶蛋白表达和vlp释放的分析(elisa):vero细胞用原型病毒和修饰的病毒进行感染:第1行)ad5

melarv,第2行)ad5

melarv

isd,第3行)ad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct,第4行)ad5

lucsp_melarv_ha

tmct,第
ø
行阴性对照病毒。elisa板用细胞裂解产物、上清液(sn)或来自受感染的vero细胞的纯化vlp进行包被。通过一抗(抗p2a、mm2

9b6、4f5和19f8)的结合,检测melarv env蛋白和gag蛋白的存在。(a)抗p2a抗体显示了gag表达。(b)mm2

9b6结合显现了melarv env表面亚基gp70的表达。(c)(d)4f5和19f8(isd结合)与跨膜亚基p15e结合。
[0074]
图20:显示了与hiv isd抗体的比较。
[0075]
图21:显示了关于hiv isd

t细胞的比较,其中
[0076]
图22:改善疫苗设计所遵循的策略:在疫苗中编码的herv

k env蛋白的isd结构域(p15e)处的点突变。将谷氨酰胺(q)(参见“ad19_herv

k”;seq id no.43中所示的编码序列)突变为丙氨酸(a)(“herv

k

isd;seq id no.44中所示的编码序列”),以便使介导免疫抑制效应的isd结构域失活。该图由(mangeney等人2007)修改。
[0077]
图23:来自病毒转染细胞的sn和细胞裂解产物的herv

k env和gag蛋白(vlp)的检测。通过方形框突出显示了ad19_herv

k wt/isdmut转染的a549和vero细胞的sn和细胞裂解产物中的功能性gag(a)和env(b)蛋白的存在。大约90、80和40 kda的分子量等价于分别如下表中所示的herv

k gag、herv

k env全长未加工前体(含和不含信号肽)、以及herv

k p15e(tm,env)报告的80、90、80和42 kda的值(opstelten dj,等人, j virol. 1998 8月;72(8):6537

45):

[0078]
此外,在两个细胞系(a1和a2)的细胞裂解产物和sn中也检测到ad5_melarv_gag蛋白(65 kda),意味着herv

k和melarv gag蛋白两者均可以被相同的兔多克隆抗p2a抗体识别。
[0079]
图24:ad19_herv

k_wt/isdmut转染后,herv

k env在细胞内部和表面上的表达。herm

1811抗体用于显示herv

k env蛋白在a549感染的细胞的细胞内和细胞表面上两者的产生和存在。ad19_herv

k env wt(中灰色透明)/isdmut(深灰色透明)感染的细胞表达大量herv

k env,而用编码herv

k env的ad5载体感染的细胞(极浅灰色透明)显示了靶蛋白的较低表达,提示ad19转染率可能比ad5的那种更有效。用由ad19载体编码的无关抗原感染的细胞(浅灰色)与未感染的细胞(深灰色)一致,并且因此并未显示任何信号。
[0080]
图25:在balb/c小鼠中由ad19

herv

k引发的cd8 t细胞应答的ics分析。该图显示了每个小鼠脾脏中包含的分泌tnfα的活化(cd44 )cd8 t细胞的总体数目。(a)来自用不
同adv疫苗(引发

加强),随后为非加强(
ø
)和mva_env加强方案的免疫小鼠的ifnγ阳性cd8 t细胞的数目。(b)ifnγ和tnfα双阳性cd8 t细胞的百分比。(c)ifnγ阳性cd8 t细胞的平均荧光强度(mfi)。每组小鼠的平均值由水平线指示。星号(*)指示了显著差异,其中(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0081]
图26:接受治疗性疫苗接种的肿瘤攻击小鼠的存活曲线。我们的ad19_herv

k wt/isdmut疫苗(中灰色和深灰色)减少或预防肿瘤生长和转移的功效,在用表达herv

k env靶蛋白的renca细胞攻击的balb/c小鼠中进行测试。我们的疫苗与不表达herv

k的无关疫苗(黑色)、以及的确表达靶蛋白的mva疫苗(浅灰色)进行比较。在第40天(最终终点)时实施安乐死的小鼠的肺关于肺转移的进展进行盲蔽评级。kaplan

meier估计量用于分析不同组的疫苗接种小鼠的存活。存活曲线使用不同的统计检验(时序、威尔科克森和tarone

ware)进行比较,并且当p值< 0.05时,视为显著的(*)。
[0082]
图27. 门控策略。具有箭头的黑色门示出了哪些群体用于门控下述图。这个图片由来自balb/c小鼠的阳性结果制备,所述balb/c小鼠用基于adv的疫苗(引发) mva env(加强)进行免疫。
[0083]
图28. 人乳腺癌组织(h841)的herv

k染色。组织样品得自人乳腺肿瘤。它们以4 μm进行切片,并且用1:1000稀释的一抗进行染色,所述一抗得自(a)未免疫的小鼠(出血前血清)、以及(b)用ad19_herv

k_isd(8 w后)和mva_env(2 m后)疫苗接种方案加强的ad5_herv

k_env引发小鼠。随后使用1:500稀释的生物素标记的抗小鼠二抗,并且最后用苏木精/曙红染色癌细胞。herv

k特异性染色(深灰色)在右侧组织学切片中清晰显现,确证了来自疫苗接种小鼠的高滴度herv

k抗体能够染色表达herv

k靶蛋白的癌组织。
[0084]
图29:由转染细胞分泌的vlp的形态。用编码gag_p2a_env蛋白的ad19a

herv

k isdmut转染a549细胞。细胞在24小时后进行固定,并且使用透射电子显微镜检查观察释放的vlp(大约100 nm的圆)。
[0085]
发明详述下文显示了天然序列,其中序列的各个元素如下指示:信号肽表面亚基跨膜亚基免疫抑制结构域(isu/isd)*跨膜结构域细胞质尾部本发明涵盖了下述序列,其中免疫抑制结构域中的一个、两个或更多个氨基酸与另一种天然存在的氨基酸交换。
[0086]
1. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 9)的herv

k108(=ervk

6):
以及具有氨基酸序列(seq id no. 10)的gag蛋白:2. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 11)的ervk

19:以及具有氨基酸序列(seq id no. 12)的gag蛋白:3. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 13)的herv

k115(=ervk

8):
并且gag蛋白具有氨基酸序列(seq id no. 14):4. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 15)的ervk

9:以及gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 16):5. ,具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 17)的herv

k113:
以及gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 18):6. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 19)的ervk

21:具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 20):7.具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 21)的ervk

25:
8. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 22)的herv

k102 = ervk

7:并且具有gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 23):9. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 24)的herv

k101 = ervk

24:并且具有gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 25):
10. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 26)的herv

k110 = ervk

18:11. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 27)的herv

h19 = herv

h_2q24.3:12. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 28)的herv

h_2q24.1:并且具有gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 29):13. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 30)的herv

w = ervw

1 = 合胞素

1:
14. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 31)的herv

frd = ervfrd

1 = 合胞素

2:15. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 32和33)的herv

e:并且具有gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 34至38):16. 具有env蛋白的氨基酸序列(seq id no. 339)的herv

e:并且具有gag蛋白的氨基酸序列(seq id no. 40):
[0087]
herv

k的靶癌症是前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、黑素瘤、白血病和肉瘤。herv

h的靶癌症是结肠直肠癌。herv

w的靶癌症是睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和白血病,并且herv

e的靶癌症是肺癌和肝癌。
实施例
[0088]
下文所示的材料和方法对于随后的实施例是通用的。
[0089]
原型疫苗(dna

melarv和ad5

melarv)由dna质粒(768tet)或腺病毒5型(ad5)组成,其在强人巨细胞病毒立即早期启动子(cmv启动子)下编码基因melarvgag_p2a_env。这种基因同时表达了经由可自切割的肽p2a连接的melarv蛋白gag和env。当gag诱导病毒样颗粒(vlp)的形成时,靶蛋白env整合到形成的vlp内。
[0090]
进一步地,疫苗设计为靶向在肿瘤细胞中表达的人内源性逆转录病毒k型(herv

k或hml

2)的包膜(env)蛋白,并且它们对于细胞和体液免疫应答的诱导以及抗癌功效进行测试。
[0091]
设计的疫苗包含dna质粒(768tet)、腺病毒5型(ad5)或腺病毒19型(ad19a),其各自在强人巨细胞病毒立即早期启动子(cmv启动子)下编码组特异性抗原(gag)和env基因(herv

kgag_p2a_env)。这两种蛋白质与作为接头的可自切割的肽p2a同时表达,其保持与涉及病毒样颗粒(vlp)形成的gag蛋白结合。env蛋白被掺入形成的vlp中,并且它充当生成特异性免疫应答的靶。
[0092]
为了关于免疫应答的诱导改善疫苗,制备了疫苗编码的melarv env中isd的失活突变,以防止通过疫苗本身的免疫抑制效应。在env跨膜亚基p15e的序列中诱导了两个点突变。在isd的位置14处的谷氨酸被精氨酸取代,并且在位置20处的丙氨酸改变为苯丙氨酸(图3)。
[0093]
在herv

k疫苗中,通过在herv

k env蛋白的跨膜(tm)亚基的免疫抑制结构域(isd)中引入点突变,即p15e,来增强通过疫苗诱导的免疫应答。这种修饰涉及用丙氨酸替换在isd的位置52处的谷氨酰胺(schlecht

louf g, 等人, proc natl acad sci u s a. 2010年2月23日;107(8):3782

7)(参见图22)。这种改变触发了结构域的失活,以便防止疫苗本身产生免疫抑制效应。
[0094]
细胞培养在不同的实验中使用了各种细胞系。所有细胞系都维持在加湿大气中,在37℃与5% co2下。
[0095]
hek293:hek293源自人胚肾培养物,并且通过用剪切的腺病毒5型(ad5)dna转化而生成[atcc. 293[hek

293]。[2017年6月8日引用];可得自:https://www.lgcstandards

atcc.org/products/all/crl

1573.aspxgeo_country=de.]。这种细胞系的优点包括易于
for implantation survival and growth of b16 melanoma variant tumor lines. j natl cancer inst,1976. 57(5):第1199

202页。]。实验中使用的细胞系b16f10

gp另外表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白(gp33

41)的免疫优势表位[pr
é
vost

blondel,a.等人,tumor

infiltratinglymphocytesexhibitinghighexvivocytolyticactivityfailtopreventmurinemelanomatumorgrowthinvivo. the journal of immunology,1998. 161(5):第2187

2194页。]。细胞维持在补充有10%热灭活的fbs、l

谷氨酰胺(2mm)、丙酮酸钠(1mm)和pen/strep的dmem中。
[0099]
ct26:ct26是小鼠结肠癌细胞系,衍生自balb/c小鼠品系,并且得自dr. anders elm pedersen。这种细胞系用于测试小鼠中的原发性肿瘤生长[atcc. ct26.wt. [2017年6月8日引用];可得自:https://www.lgcstandards

atcc.org/products/all/crl

2638.aspxgeo_country=de#generalinformation]。细胞维持在roswell park memorial institute培养基(rpmi)中,所述rpmi补充有10%热灭活的fbs、l

谷氨酰胺(2mm)、丙酮酸钠(1mm)和pen/strep。
[0100]
4t1

luc:4t1是源自balb/c小鼠品系的鼠乳腺癌细胞系。当注射到小鼠的乳房脂肪垫内时,细胞形成转移至肺、肝、淋巴结和脑的原发性肿瘤[atcc. 4t1. [2017年8月4日引用];可得自:https://www.lgcstandards

atcc.org/products/all/crl

2539.aspxgeo_country=de#characteristics]。用萤光素酶报道蛋白(luc)稳定转染细胞系。细胞维持在补充有10%热灭活的fbs、l

谷氨酰胺(2mm)、丙酮酸钠(1mm)和pen/strep的rpmi中。
[0101]
vero细胞:vero细胞是来自非洲绿猴(黑长尾猴(cercopithecusaethiops))的灵长类动物肾细胞系[atcc. vero. [2017年6月8日引用];可得自:https://www.lgcstandards

atcc.org/products/all/ccl

81.aspxgeo_country=de#characteristics]。这种细胞系可通过人ad5感染高度转导,而无需新病毒粒子的支持性生产,并且因此用于分析通过ad5

疫苗的蛋白质表达和vlp释放。细胞维持在补充有10%热灭活的fbs、l

谷氨酰胺(2mm)、丙酮酸钠(1mm)和pen/strep的dmem中。
[0102]
a549细胞是适合于宿主病毒转染的人肺上皮细胞。因此,a549细胞用于含有用于vlp产生的目标序列的腺病毒转染。通过蛋白质印迹(wb)技术分析vlp的分泌,并且使用荧光激活细胞分选(facs)检测其在细胞表面处的存在,并且使用电子显微镜检查(em)进行显现。这些细胞维持在kaighn's modification of ham's f

12 medium(ham's f

12k培养基)中,所述培养基补充有10%热灭活的fbs、pen/strep和丙酮酸钠(1 mm)。
[0103]
表达gag和env蛋白的renca细胞。renca细胞是小鼠(小家鼠(mus musculus))肾上皮细胞。它们衍生自balb/c小鼠中的肾腺癌。肿瘤生长和进展精确地类似在人肾细胞癌中观察到的那种,尤其是模仿了对肝和肺的自发转移。下述实施例中使用的细胞由prof. dr. barbara schnierle(langen,德国)友情提供。在下述实施例的一些中,这样修饰细胞,以便表达人内源性逆转录病毒k型(herv

k)env或gag蛋白。这允许在小鼠中诱导表达herv

k蛋白的肿瘤,产生适当的小鼠模型用于测试我们针对表达erv蛋白的人癌症的新型疫苗接种策略。这些细胞维持在以ph 7.2的roswell park memorial institute培养基(rpmi

1640)中,所述培养基补充有10%热灭活的fbs、20x106 iu/l pen和5 g/l strep、2.9 g/l l

谷氨酰胺(2 mm)和3.7 g/l丙酮酸钠(1 mm)。
[0104]
鸡胚成纤维细胞(cef)的原代培养物被广泛用于病毒培养。根据来自(staib等人
2004)的方案,来自jens toft,lohmann(丹麦)的11天大的鸡蛋用于制备cef培养物。在这种情况下,cef细胞用于生产编码herv

k env和gag外源抗原的改良的痘苗安卡拉(mva)。使用这种特定类型的细胞的原因是mva复制仅限于禽类细胞,这意味着mva在大多数哺乳动物细胞中不复制,并且使得其不适合于这个目的(altenburg等人2014)。cef细胞在cef培养基中进行培养,所述cef培养基由补充有3.7 g/l丙酮酸钠、10%热灭活的fbs和1%(v/v)抗生素

抗真菌剂的rpmi(gibcotm,15240062)组成。
[0105]
幼仓鼠肾成纤维细胞(bhk

21细胞)最初衍生自幼叙利亚金仓鼠肾细胞(金仓鼠(mesocricetus auratus))。下述实施例中使用的特定细胞系由prof. allan randrup thomsen(university of copenhagen,丹麦)友情提供。bhk

12细胞用于mva env和gag滴定,因为它们已知是允许mva复制的少数细胞系之一。它们维持在cef培养基中,所述cef培养基由补充有3.7 g/l丙酮酸钠、10%热灭活的fbs和1%(v/v)抗生素

抗真菌剂的rpmi(gibcotm,15240062)组成。
[0106]
质粒构建体为了产生重组腺病毒,将靶蛋白克隆到修饰的腺病毒载体capture

pbgh内。这种载体含有在e1和e3基因中具有缺失的ad5基因组。此外,它含有与载体768tet同源的区域,所述区域需要cmv启动子和3'聚腺苷酸化(polya)尾部,并且在tet操纵子下表达重组蛋白质(图4)[becker,t.c.等人,use of recombinant adenovirus for metabolic engineering of mammalian cells. methods cell biol,1994. 43 pt a:第161

89。]。因此,靶蛋白首先通过亚克隆、pcr克隆或吉布森组装插入768tet内,然后经由同源重组(图5)克隆到capture

pbgh(图4)内。
[0107]
对于腺病毒的pix修饰,将靶蛋白克隆到共同表达载体pcdna3内,所述pcdna3另外编码pix和接头序列(含有flag标签),随后为插入目标基因的限制性位点(pcdna3_pix_taglinker_xxx,其中xxx =靶抗原)。将表达载体转染到生产者细胞内,以诱导重组pix在这些细胞中的表达。
[0108]
表1中列出了使用的不同质粒构建体。
[0109]
表1:用于克隆、病毒产生和疫苗接种的质粒构建体列表。列出了在项目过程中使用的dna质粒,包括在这项工作中利用的缩写。另外,解释了载体编码的基因(“描述”)以及dna质粒的应用(“目的”)。
[0110]
克隆不同的克隆策略用于构建新的dna构建体,用于腺病毒疫苗的生产和测试。
[0111]
亚克隆对于亚克隆,将靶dna序列从一个质粒(供体载体)转移至另一个质粒(靶载体)。经由限制性消化在连接位点处切割供体和靶载体。为了预防重新连接,用小牛肠碱性磷酸酶(cip)处理靶载体,所述酶催化在dna的5'和3'末端处的去磷酸化。在含有gelgreen染料(#41004,biotium)的1%琼脂糖凝胶上分开消化的dna。切出所需的dna条带,并且使用e.z.n.a. gel extraction kit(d2500;omega bio

tek)提取dna成分。简言之,将凝胶溶解在一个体积的结合缓冲液(xp2)中,并且加载到hibind
®ꢀ
dna mini柱上。在洗涤两次后,使柱干燥,并且使dna在洗脱缓冲液中进行双重洗脱。
[0112]
纯化后,将载体和插入片段以1:3的化学计量比混合。使用instant sticky

end ligase master mix(m0370;new england biolabs),催化两个dna片段的连接。将连接的产
物转化到xl1

blue 感受态细胞(#200249,agilent technologies)内。对于转化,将dna加入细菌悬浮液中,并且在冰上温育10分钟。随后,通过在42℃下热休克45秒使细胞渗透化。在冰上的2分钟温育后,加入super optimal broth培养基(soc培养基),并且使细菌在37℃下振荡温育1小时。细菌悬浮液在含有分别抗生素的lysogeny肉汤培养基(lb培养基)琼脂板上进行划线培养,并且在37℃下温育过夜。
[0113]
为了筛选正确的构建体,扩增了几个细菌菌落用于微质粒制备(参见下文的
“ꢀ
0 dna制备”)。通过限制性消化切割分离的质粒dna,并且通过凝胶电泳进行分析。
[0114]
对于herv

k构建体(和相应的对照),执行亚克隆,以便将含有目标序列(dna_isdmut_coherv

k

p2ts和dna_coherv

k

p2ts)的dna构建体插入受体质粒768(teto)

sp

alb

cidr内。为了实现这点,首先分别使用pir1和xl1

blue细胞、以及kan和amp选择标记物扩增插入片段和受体。由于当使用nebuffer 3.1时xbai酶的活性仅为75%,所有构建物都使用xbai(new england biolabs,r0145)和swai(new england biolabs,r0604)连同nebuffer
™ꢀ
3.1(new england biolabs,b7203)一起在37℃下消化1小时30分钟。通过使用1%琼脂糖凝胶加上gelgreen染料的电泳分开dna(100 v,200 a,1小时)。遵循制造商的指导,使用e.z.n.a.
®ꢀ
gel extraction kit(omega bio

tek,d2500)切割并纯化含有插入片段的条带以及含有768(teto)的条带,并且在20
ꢀµ
l超纯水(upw)中洗脱。
[0115]
为了连接构建体,使40 ng受体载体和120 ng每种插入片段在37℃下与1:2稀释的即时粘性末端连接酶主混合物(2x)在15至30分钟过程中温育。使用xl1

blue细胞执行转化,并且使用mini制备(如下所述)获得dna。然后,执行测试切割,以确证目标序列是否正确插入受体载体内。如果是这样,则执行新的转化和midi制备(如下所述),以获得更高的dna浓度。
[0116]
pcr克隆与亚克隆形成对比,pcr克隆的特征在于聚合酶链反应(pcr)中的插入片段的生成。使用特异性延伸引物,经由pcr从供体载体扩增靶序列,以插入酶促限制性位点。引物从tag copenhagen订购,并且与模板和pfuultra ii hotstarter pcr master mix(#600850,agilent genomics)混合。通过在95℃下温育2分钟来启动pcr,以激活taq聚合酶并促进dna模板的完全变性。初始步骤随后为在95℃下的变性,在60℃下的退火和在72℃下的dna延伸的30个循环。pcr用在72℃下3分钟的最后一步完成,以结束dna延伸。
[0117]
使用e.z.n.a. gel extraction kit(d2500;omega bio

tek)方案“从酶促反应纯化”,从反应混合物中分离dna。为了去除残留的基因组dna,用dpni(r0176,new england biolabs)处理纯化的pcr产物,所述dpni是切割甲基化dna的酶。dna经受在特定的限制性位点处的酶促消化,并且使用e.z.n.a. gel extraction kit进行纯化。根据先前描述的亚克隆方案执行靶载体的消化和连接。
[0118]
在herv

k构建体(和相应的对照)的背景下,为了继续同源重组,必须去除herv

k wt/isdmut序列内部包含的noti位点,使得noti随后可以用于正确地线性化质粒,允许正确重组。为了实现这点,得自上述亚克隆程序的两个序列(768(teto)

sp

alb

csp

herv

k wt/isdmut)用xbai(new england biolabs,r0145)和bspei(new england biolabs,r0540)连同nebuffer
™ꢀ
3.1(new england biolabs,b7203)在37℃下切割1.5小时,并且通过在含有gelgreen染料的1%琼脂糖凝胶上的电泳来分开。使用e.z.n.a.
® gel extraction kit消
化并洗脱含有待去除的noti位点的dna条带。
[0119]
用于pcr反应的正向引物在herv

k env序列的3'末端处,特别是在bspei限制性位点(5
´‑
cccgtgtccggacctgag
‑3´
;seq id no.45)处退火,而反向引物在herv

k env序列的5'末端处,在xbai限制性位点(5
´‑
gttctagacttgtcctgaattttctggtta
ꢀ‑3´
;(seq id no.46)处退火。反向引物含有在noti位点处的修饰,以便消除它。引物得自tag copenhagen a/s(copenhagen,丹麦)。
[0120]
10 ng模板dna(1 ng/
µ
l)、10
ꢀµ
m每种引物和pfuultra ii hotstart pcr master mix(agilent technologies,600850)的1:2稀释物用于制备用于每种dna构建体的反应混合物。pcr反应包括初始变性步骤(95℃,5分钟),随后为35个循环的环,其包括变性步骤(95℃,30秒)、退火步骤(58℃,25秒)和最后的延伸步骤(72℃,45秒)。最后,执行最后的延伸步骤(72℃,10分钟),并且将样品贮存于4℃下。
[0121]
通过凝胶电泳分开pcr产物连同受体质粒,并且如本文上文的节段“亚克隆”中所述收集并加工所需的条带。因此获得了768(teto)

herv

k

gag

p2a

env wt和isdmut构建体,其目前在其序列中不包含noti酶的限制性位点。
[0122]
吉布森组装吉布森组装用于将几个dna片段组合到一个构建体内。通过延伸pcr扩增片段,以添加与靶载体同源的突出端。如对于pcr克隆所述处理且纯化pcr产物。经由在插入位点处的限制性消化打开靶载体。为了组装片段,将打开的靶载体和纯化的插入片段以1:3的化学计量比混合,并且在50℃下与gibson assembly master mix(e2611;new england biolabs)一起温育1小时。master mix中的三种关键酶促进了组装。核酸外切酶从片段的5'末端去除dna,并且产生单链3'突出端,其与其它片段一起在同源区域中退火。通过dna聚合酶将核苷酸插入剩余的间隙内。最后,dna连接酶连接组装的dna中的缺口。如同先前描述的克隆技术,将组装的dna转化到细菌内,随后筛选正确的构建体。
[0123]
同源重组以生成重组腺病毒基因组通过在大肠杆菌中的同源重组执行将靶基因插入腺病毒基因组(ad5)内。经由限制性消化从768tet中切出与靶载体具有同源区域的插入片段(靶基因),并且通过凝胶电泳纯化。受体载体capture

pbgh(ad5基因组)同样地通过限制性消化进行线性化。为了预防重新连接,使切割的载体经受cip处理(参见亚克隆)。随后,通过乙醇沉淀来纯化载体

dna。简言之,将dna沉淀在0.3m乙酸钠和70%乙醇中,在

80℃下冷冻20分钟,并且在16.000g下离心15分钟(4℃)。将团块在70%乙醇中洗涤,并且再离心5分钟。在室温(rt)下干燥后,将dna重悬浮于水中。为了预防进一步的重新连接,使用tempase热启动dna聚合酶(#230306;ampliqon)生成腺苷突出端。随后,经由苯酚氯仿提取来纯化dna。为此,将苯酚氯仿加入反应混合物中,随后以16.000g离心10分钟。将上部水相转移至新的反应管,并且如上所述,通过乙醇沉淀来提取dna。
[0124]
为了通过同源重组组合载体和插入片段,将两种组分以1:3的化学计量比混合,并且加入电穿孔感受态bj5183细胞中。将细菌转移到电穿孔比色杯(#1652086;bio

rad)中,并且用25
ꢀµ
fd、2.5 kv和200
ꢀω
在基因脉冲发生器(bio

rad)中通过电穿孔进行渗透化。在电穿孔后,将细胞转移到soc培养基内,并且进一步如热休克方案(参见“亚克隆”)中所述进行处理。
[0125]
下述质粒由sirion biotech提供:cdna_herv

k(gag_p2a_env)cdna_herv

k(gag_p2a_env

(q6a)isd

mut)。
[0126]
通过sirion还提供了相同的构建体,但由ad19a载体编码。
[0127]
cdna构建体被扩增并用作dna疫苗以及用于克隆策略的插入载体,其最终目的是获得编码上述序列的ad5载体,所述ad5载体可以用作疫苗。具体地,对于在had5s(和相应的对照)中编码的herv

k构建体,将目标基因克隆到编码在e1和e3基因中具有缺失的人ad5基因组的pbgh质粒内。通过与编码目标基因的768tet质粒同源重组,将转基因插入e1的位置中。选择这种策略是因为伴随限制性消化和连接的常规克隆是非常低效的,而pbgh载体是超过38 kbp的极大质粒。
[0128]
在大肠杆菌中执行768tet和pbgh捕获质粒之间的同源重组。捕获载体含有绿色荧光蛋白(gfp)作为插入片段,所述插入片段将被替换为目标基因。
[0129]
由于编码人ad5基因组的pbgh质粒太大(< 38 kbp)而无法经历通用克隆策略,所述策略使用限制性酶消化以插入所需的构建体,因此使用同源重组将其插入e1的位置处。
[0130]
首先,使用swai酶(new england biolabs,r0604)在37℃下在2小时过程中将pbgh受体载体线性化。同时,在1小时过程中用noti酶(new england biolabs,r3189)消化768(teto)

herv

k

gag

p2a

env wt和isdmut。通过在含有gelgreen的1%琼脂糖凝胶中电泳分开反应的产物。从凝胶中收集侧翼为重组所需的同源区域的herv

k序列,并且遵循制造商的指导,使用e.z.n.a.
®ꢀ
gel extraction kit(omega bio

tek,d2500)分离dna,并且在upw中洗脱。
[0131]
在pbgh消化后,使用小牛肠碱性磷酸酶(30分钟,37℃;m0290)将3'和5'末端两者磷酸化,以预防重新连接。然后,在

80℃下在20分钟过程中,使载体经历在0.3 m乙酸钠和70%(v/v)乙醇中的乙醇沉淀。紧接着将样品离心(15分钟,4℃,16,000 g),并且用70%(v/v)乙醇洗涤团块。使载体经历另一次离心(5分钟,4℃,16,000g),并且使所得到的团块在rt下静置干燥,并且最后重悬浮于upw中。
[0132]
为了预防pbgh载体的进一步重新连接,它在72℃下在30分钟过程中用tempase hot start dna聚合酶(ampliqon,a230306)进行处理,其增加腺苷突出端。加入苯酚/氯仿,离心(10分钟,4℃,16,000 g)来纯化dna,然后将含有dna的上层水相转移到微量离心管中。dna像以前一样经历乙醇沉淀,以便进一步纯化其,然后将其稀释到upw内。
[0133]
所有质粒都贮存于水中,而不是洗脱缓冲液中,因为盐含量干扰电穿孔效率。将pbgh载体和herv

k wt/isdmut插入片段连同电穿孔感受态bj5183细胞(agilent,200154)一起以1:3摩尔比组合。然后,将混合物转移到电穿孔比色杯(bio

rad,1652086)内,所述电穿孔比色杯用于用基因脉冲发生器(bio

rad)以25
ꢀµ
fd、2.5 kv和200 ω使细胞渗透化。随后,添加soc培养基,以在转化后回收大肠杆菌感受态细胞。然后使它们在振荡培养箱中在37℃下温育1小时。最后,将混合物铺平板在含有kan的lb琼脂板上,并且在37℃ o/n下温育。
[0134]
为了确定同源重组是否正确执行,使用如本文下文所述的mini

制备分离dna。然后,它使用限制性酶将其消化,并且在含有gelgreen染料的1%琼脂糖凝胶中分开。切割对应于pbgh和插入片段的正确大小的条带,并且转化到大肠杆菌内,并且最后通过如下所述的
8.0)中或用100 μl来自e.z.n.a.
® plasmid dna mini kit的洗脱缓冲液重构dna,并且在nanodrop
tm 2000上测定浓度。
[0139]
2.6 病毒生产在实验中产生并测试了不同的病毒(表2)。除通常的重组腺病毒之外,还测试了在其表面上展示重组pix的ad5载体(ad5

pix),并且必须以不同的程序进行生产。
[0140]
表2:用于小鼠免疫的病毒构建体列表:列出了在项目过程中使用的不同重组腺病毒,包括在本工作中的缩写以及由病毒编码的基因。病毒缩写描述ad5_melarvgag_p2a_envstopad5

melarv编码melarvgag和melarvenv的ad5ad5_melarvgag_p2a_envisdmutstopad5

melarv

isd编码melarvgag和isd

突变的melarvenv的ad5ad5_melarvgag_p2a_envstop_pix

p15ead5

melarv_pix

p15e在病毒pix蛋白上展示p15e的编码melarvgag和melarvenv的ad5ad5_melarvgag_p2a_envisdmutstop_pix

p15e

isdad5

melarv

isd_pix

p15e

isd在病毒pix蛋白上展示isd突变的p15e的编码melarvgag和isd突变的melarvenv的ad5ad5_melarvgag_p2a_envstop_pix

p15e

trunc

wcad5

melarv_pix

p15e

trunc

wc在病毒pix蛋白上展示具有另外半胱氨酸的截短p15e的编码melarvgag和melarvenv的ad5ad5_melarvgag_p2a_envstop_pix

p15e

trunc

w/ocad5

melarv_pix

p15e

trunc

w/oc在病毒pix蛋白上展示不含另外半胱氨酸的截短p15e的编码melarvgag和melarvenv的ad5ad5_sivgag_p2a_lucsp_melarv_ha

tmctad5

lucsp_melarv_ha

tmct编码含有萤光素酶信号肽和流感血凝素跨膜结构域 细胞质尾部的sivgag和修饰的melarvenv的ad5ad5_sivgag_p2a_lucsp_gcn4_p15e_ha

tmctad5

lucsp_gcn4_p15e_ha

tmct编码含有萤光素酶信号肽、三聚化序列和流感血凝素跨膜结构域 细胞质尾部的sivgag和修饰的melarvenv的ad5ad5_egfpad5

gfp编码gfp的ad5
[0141]
具有修饰的isd的melarv env蛋白的序列env蛋白具有下述序列(seq id no:41):
通过将isd序列中灰色背景字母处的原始e交换为r,并且将isd外部第三个氨基酸处的a交换为f(也用灰色标记),已对序列进行修饰。
[0142]
重组ad5生产ad5产生的起点是腺病毒基因组质粒capture

pbgh。该质粒含有感染性ad5颗粒形成所需的所有基因,但在基因e1和e3中缺失。e1是病毒复制所需的,并且由生产者细胞系hek293/avtoxic(kovesdi,i.和s.j. hedley,adenoviralproducercells. viruses,2010. 2(8):第1681

703页)提供。e3是病毒生产的非必需基因,并且在基因组中缺失,以产生用于重组靶基因的空间。在捕获克隆的过程中(参见“0同源重组以生成重组腺病毒基因组”),这些靶基因经由同源重组插入载体内。图5中概括了将靶蛋白克隆到capture

pbgh内以及随后病毒生产的过程。
[0143]
用重组capture

pbgh载体转染avtoxic细胞。为此,将细胞接种到t75培养瓶内并生长至50

70%汇合。通过在37℃下在pi

scei缓冲液中用pi

scei(#r0696s;new england biolabs)限制性消化1小时,使载体dna线性化。随后,如“捕获克隆”中所述执行苯酚氯仿纯化,并且将dna溶解于optimem(#11058

021;invitrogen)中。将一部分dna溶液加载到1%琼脂糖凝胶上,以确认质粒的正确切割。将残留的dna与聚乙烯亚胺(pei)以1:3的dna:pei比率混合。在室温下温育15分钟后,将混合物逐滴加入avtoxic细胞的培养基中。使转染的细胞在正常细胞培养条件下温育(参见becker, tc.,等人, methods cell biol. 1994; 43 pt a:161

89.),同时在16小时后和随后每2

3天更换培养基。当如通过使细胞脱离(2

3周后)使得可见细胞裂解时,收获含有裂解细胞的细胞培养基(称为“病毒裂解产物”)并贮存于

80℃下。
[0144]
在下一步中,用“病毒裂解产物”再次感染细胞,以获得“3天裂解产物”。为此,使avtoxic细胞在6孔板中生长直至70%汇合,然后以1:10系列稀释的“病毒裂解产物”逐孔感染。感染三天后,收获稀释度最高、完全裂解的孔的上清液,并且在

80℃下冷冻。这种病毒样品称为“3天裂解产物”为了大规模生产病毒(“大规模裂解产物”),将avtoxic细胞接种到四个nunc
™ꢀ
cell culture treated tripleflasks

(500cm2)(#132913;thermo fisher)内。当细胞达到70%融合时,用150 μl的“3天裂解产物”感染烧瓶。在细胞完全裂解后(大约三天),收获上清液并且冷冻于

80℃下。
[0145]
重组ad5纯化在病毒纯化的第一步中,将0.5%的igepal ca

630(#56741;sigma

aldrich)加入
收获的大规模裂解产物中。在rt下的10分钟温育期间,去污剂引起剩余细胞的破坏和病毒内容物释放到培养基内。为了去除细胞残渣,将裂解产物在4℃下以12186g离心20分钟。回收上清液,并且将一半的体积加入20%聚乙二醇(peg) 2.5 m nacl溶液中,随后为在4℃下的温和振荡过夜。在这个步骤过程中,沉淀出上清液中的病毒,其允许在下一步中的病毒浓缩。通过在12186g下离心20分钟,使沉淀的病毒形成团块。将病毒团块重悬浮于5 ml冷磷酸盐缓冲盐水(pbs)中,并且转移至15 ml falcon管中。将样品在784g下离心5分钟,以去除剩余的细胞残渣。将上清液转移至新的15 ml falcon管中,并且重复先前的离心步骤数次,直到管中仅存在少量的细胞残余物团块,其无法完全去除。将几乎饱和的cscl溶液加入含有病毒的上清液中,以达到1.34 g/ml的最终密度。将所得到的溶液转移到超速离心管(#342413;beckman coulter)中,随后将所述超速离心管密封,并且在beckman coulter ti 70.1转子中以257,300g离心过夜。用针和注射器提取清晰可见的病毒条带,并且加载到平衡的pd

10脱盐柱(#17

0851

01;ge healthcare)上。将流通级分收集在70%甘油中,其中最终甘油浓度为10%。合并具有最高病毒浓度(最高浊度)的级分,等分并贮存于

80℃下。病毒等分试样不解冻并冷冻多于两次。
[0146]
在pix上展示抗原的重组ad5载体的生产和纯化使用与正常重组ad5病毒不同的策略来执行ad5

pix病毒的生产。生产者细胞系是较早描述的hek293(ccs)

shmir

pix_221

puro细胞系(pix细胞)。将pix细胞接种到175 cm2烧瓶内(四个烧瓶/病毒),并且生长至70%汇合。为了产生重组pix蛋白,用pcdna3_pix质粒转染细胞,其中pix通过遗传融合与重组蛋白质偶联。在转染前将多西环素加入培养基(0.5 μg/ml)中,所述多西环素诱导抑制天然pix翻译的pix特异性shrna的转录。转染后18小时更换细胞培养基,并且再次加入多西环素。随后,用5 moi(感染复数)的分别的基础腺病毒(编码目标重组蛋白质的腺病毒)感染细胞。在正常培养条件下允许病毒复制48小时,直到可见病毒的致细胞病变。收获细胞,并且通过在750g下离心10分钟形成团块。将团块重悬浮于具有0.5%脱氧胆酸钠的pbs中,并且在rt下温育30分钟以降解细胞并释放病毒。为了从生产细胞系中消化基因组dna,添加0.2 m mgcl2和0.05 mg/ml dna酶i(a3778,applichem),并且在37℃下温育1小时。通过在3000g下离心15分钟去除细胞碎片,并且将cscl加入含有病毒的上清液中至1.34 g/ml的最终浓度。如先前对于ad5纯化所述,将病毒在cscl梯度中超速离心。将提取的病毒条带转移至透析膜(spectra/por
®ꢀ
dialysis membrane,300kda,#131450,biotech ce tubing),并且在4℃下在pbs中透析过夜。最后,将病毒在10%甘油中等分,且贮存于

80℃下。
[0147]
病毒滴定为了实验的重现性,对纯化的病毒进行滴定,以获得感染单位数目/ml(ifu/ml)。将平底的δ处理表面的96孔板用聚赖氨酸包被15分钟,并且用pbs洗涤3次。将hek293细胞以100 μl培养基中5x104个细胞的浓度接种到孔内。以1:50的稀释度开始,将病毒在培养基中以10倍的系列稀释进行稀释。将50 μl稀释因子5x104至5x107一式两份加入96孔板中的细胞悬浮液中。使受感染的细胞在正常细胞培养条件下温育48小时。去除培养基后,使孔在rt下干燥,并且将细胞在冷甲醇中在

20℃下固定10分钟。随后,将孔用含有1%牛血清白蛋白(bsa)的pbs洗涤3次。为了检测病毒感染的细胞,加入在pbs bsa中以1:1000稀释度的抗ad5六邻体抗体(1e11;#sc

51746;santa cruz biotechnologies),并且在37℃下温育1小
时。用pbs bsa洗涤3次后,使在pbs bsa中1:500稀释的、与辣根过氧化物酶(hrp)(#p0447;dako)偶联的针对小鼠免疫球蛋白的二抗在孔中在37℃下温育1小时。将残留的抗体洗掉,并且用3,3'

二氨基联苯胺(dab)底物在rt下10分钟显现病毒空斑。
[0148]
为了确定病毒的滴度,在显微镜下以20x放大率计数在适当稀释度下的噬菌斑。在每个孔中计数几个视野,直到检测到大约100个噬菌斑。使用下式计算ifu的最终数目/ml:直到检测到大约100个噬菌斑。使用下式计算ifu的最终数目/ml:=每个视野的平均噬菌斑数目(计数的噬菌斑总数目/计数的视野);vf=20x放大率下每孔的视野数目(52.7个视野/孔);df=计数孔中病毒的稀释因子(例如500,000x);w=受感染孔的数目/ml病毒稀释物(1000μl/ml/50μl/孔=20孔/ml);p=噬菌斑数目。
[0149]
作为另外的质量控制,将测量的感染单位浓度/ml(ifu/ml)与病毒颗粒(vp)计数进行比较。通过测量在260nm处的吸光度,使用nanodrop
tm 2000来测定vp/ml。1单位的吸光度对应于10
12 vp/ml的浓度。ifu/ml与vp/ml的比率指示病毒的活力,其中理想/典型比率为1:30

1:100。
[0150]
来自重组ad5的基因组dna纯化执行来自重组腺病毒的dna分离,以便确保重组基因正确插入腺病毒基因组内。使用修改的方案,用genelute

mammalian genomic dna miniprep kit(g1n70;sigma

aldrich)提取dna。为此,将100 μl纯化的病毒样品与100 μl重悬浮溶液混合。加入蛋白酶k和裂解溶液c,随后为在70℃下的10分钟温育。加入96%乙醇后,将溶液加载到制备的genelute miniprep binding柱上。后续步骤遵循原始方案,具有两个洗涤步骤和随后的柱干燥。在洗脱溶液中洗脱病毒dna。关于病毒的质量保证,将dna送去测序(genewiz uk ltd.),以排除同源重组的区域中的突变。另外,用限制性酶切割病毒dna,以通过凝胶电泳确认正确的条带大小。
[0151]
vlp的生产和纯化主要执行病毒样颗粒(vlp)的生产和纯化,以测试编码vlp的疫苗的功能。在vero细胞中测试vlp的产生,所述vero细胞以1x107个细胞的密度接种到175 cm2培养瓶内,并且温育2小时以允许附着。随后,用50moi的ad5(5x10
8 ifu/烧瓶)感染细胞5小时。去除培养基后,将细胞用pbs洗涤两次,并且在无血清培养基中温育48小时。将上清液(sn)以282g离心10分钟,然后通过0.45 μm膜过滤,以去除细胞污染物。通过使用开放式32ml厚壁管(#355631;beckman coulter),在beckman coulter ti 70转子中,以82.700g通过20%蔗糖垫形成团块,来纯化vlp。去除sn,并且将团块重悬浮于100 μl pbs(原始浓度的160x)中。
[0152]
将编码herv

k

gag

p2a

env野生型(wt)/isdmut的adv疫苗翻译成能够生成vlp的功能蛋白,从受感染细胞产生细胞裂解产物,并且从细胞培养上清液(sn)中纯化vlp:vero、a549和hek293细胞系用于生产且纯化vlp。在第1天,将10x10
6 vero、10x10
6 a549或10x10
5 hek293细胞接种到含有相应培养基的t175(175 cm2)烧瓶或t25(25 cm2)烧
瓶(在hek细胞的情况下)。2小时后,使用50或20(hek293)的感染复数(moi),用编码我们的目标序列的不同病毒载体(参见表2b)感染细胞,所述moi指示对于给定感染的病毒粒子/细胞数目。5小时后,将细胞用以ph 7.4的含有8 g/l nacl、0.2 g/l kcl、1.15 g/l na2hpo4·
2h2o、0.2 g/l kh2po4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次。然后,将培养基更换为相应的细胞培养基,但不含fbs。在48小时或16小时(当使用hek293细胞时)过程中,在最佳维持条件内温育细胞。
[0153]
此后,为了从细胞培养物中获得vlp,遵循两种不同的程序。一方面,保留sn用于纯化和分析细胞分泌的vlp。另一方面,裂解细胞以分析细胞内包含的vlp。
[0154]
对于第一程序,将细胞在4℃下以12000 rpm离心10分钟,然后将上清液通过0.45
ꢀµ
m膜(sartorius,16555)过滤,以去除细胞杂质。在开放式32 ml厚壁超速离心管(beckman coulter,355631)中,将13.5 ml sn逐滴加入3 ml 20%(w/v)溶解于pbs的蔗糖中。将管称重用于相等体积,然后置于ti 70转子(beckman coulter,337922)内,所述转子被引入设置为82.700 g、4℃的超速离心机内共2.5小时。当完成时,小心地去除sn,并且将剩余的团块重悬浮于100
ꢀµ
l pbs,且贮存于

20℃下。
[0155]
第二程序包括冷pbs洗涤的第一步。然后,将10 ml冷pbs加入烧瓶中,并且机械刮去细胞。将4 ml转移到15 ml锥形管内,并且在4℃下以12000 rpm离心5分钟。弃去sn,并且将1300
ꢀµ
l含有np40细胞裂解缓冲液(invitrogen,fnn0021)与7
ꢀµ
l/ml蛋白酶抑制剂混合物(sigma

aldrich,p8340)的混合物加入每个管中。然后,将管在冰上放置30分钟,同时使用shaker vortex 3(ika)每10分钟涡旋。最后,将管在4℃下以13.000 rpm离心10分钟以去除细胞碎片,然后将sn转移到新管内并贮存于

20℃下。
[0156]
表2b. 编码用于分析和比较vlp产生和表达的不同构建体的腺病毒列表。
[0157]
mva生产和滴定用于mva生产、纯化和滴定的程序使用由staib等人2004描述的指南执行。用于执行这个实验的表达herv

k gag或env蛋白种子裂解产物的初始mva由prof. dr. barbara schnierle(langen,德国)提供。在使用175 cm2烧瓶以大规模生成mva前,还使用175 cm2烧瓶以小规模增加病毒的量,在两种情况下均用cef细胞接种。
[0158]
在这种情况下,在bhk

21细胞中执行mva滴定。1:1000稀释的初级多克隆兔抗牛痘病毒(biorad,9503

2057)和1:500稀释的次级hrp缀合的多克隆山羊抗兔ig抗体(dako,
p0448),用于检测受感染的细胞。为了测定滴度(ifu/ml),在具有大约20

100个病毒病灶/孔的稀释样品中计数染色病灶的数目,以便使精确度达到最大。
[0159]
动物实验6

8周龄的雌性c57bl/6、balb/c和cd1小鼠得自taconic(c57bl/6)或envigo(balb/c和cd1)。在实验开始之前,允许小鼠适应环境一周。所有实验都根据由国家动物实验检查局(丹麦的dyrefors
ø
gstilsynet)批准的国家指南和实验方案执行。
[0160]
分离血清样品为了获得血清样品,通过用goldenrod刺血针穿刺面部静脉,从小鼠获取总血容量的大约10%。
[0161]
可替代地,对于小鼠的最终放血(完全放血),以每10 g小鼠100 μl的剂量,用腹膜内(i.p.)注射的pbs中的1 mg/ml赛拉嗪和10 mg/ml氯胺酮麻醉动物。通过穿刺面部静脉获取最大血容量,随后通过颈脱位对小鼠实施安乐死。
[0162]
在herv

k实验中,对于完全放血心脏穿刺,使小鼠经历全异氟醚麻醉。紧随其后,将小鼠具有连续提供异氟醚的面膜向上放置,并且使用连接到1 ml注射器的g27针执行心脏穿刺。收集了大约800

1000
ꢀµ
l,随后通过颈脱位对小鼠实施安乐死。
[0163]
可替代地,使小鼠经历用异氟醚的完全麻醉。它们然后进行非随意性反射测试,并且仅在确保它们不存在任何非随意性反射后,才特别通过眼窦从眼中收集最大血容量。然后,立即通过轻度颈脱位对小鼠实施安乐死。
[0164]
将血样在4℃下贮存过夜,以允许凝固,并且通过以800g 10分钟的两次离心从血清中去除血细胞。然后将血清贮存于

20℃下。
[0165]
注射:i.v.、s.c.、i.m.、i.p.执行不同的注射程序。对于静脉内(i.v.)注射,将小鼠在加热室中加热,以增加浅静脉血流量。将最多200 μl注射到尾静脉内。在herv

k相关的实验中,将含有10
6 rlz gag和env细胞(来自b. schnierle)的100
ꢀµ
l体积i.v.注射给小鼠,以便诱导肺转移。
[0166]
通过在足垫的皮肤下注射30 μl,在异氟醚麻醉下,执行皮下(s.c.)注射到足垫(f.p.)内。对于herv

k实验,这种类型的注射用于注射10
6 rlz gag和env细胞(来自b. schnierle)(在100
ꢀµ
l中),以便在小鼠中生长皮下肿瘤,并且建立表达herv

k env的鼠肿瘤模型。
[0167]
对于肌内(i.m.)注射,将60 μl的最大体积注射到大腿肌肉内。
[0168]
在herv

k实验的背景下,这种类型的注射主要用于用目标疫苗免疫(引发)和加强小鼠(参见下表2c)。50
ꢀµ
l/小鼠分别用于腺病毒或mva疫苗接种/加强。注射在异氟醚麻醉下在大腿肌肉处执行,所述异氟醚麻醉赋予镇痛和肌肉松弛两者。
[0169]
表2c. 用于i.m.小鼠免疫的基于病毒的疫苗。
病毒ifu/小鼠疫苗接种类型来自sirion的ad19a(ii)

(teto)

hiso

mfpv3

p2ts(ip1321_a2953_v_7b)1x108引发ad5

(teto)

cmv

sivgag_p2a_herv

k108env_p2ts1x108引发来自sirion的ad19a(ii)

(teto)

cmv

coherv

k

p2ts1x108引发来自sirion的ad19a(ii)

(teto)

cmv

isdmut_coherv

k

p2ts1x108引发/加强表达mva的herv

kenv蛋白1x107引发/加强dna

(teto)

cmv

isdmut_coherv

k

p2ts1
µ
g/
µ
l引发/加强
[0170]
腹膜内(i.p.)注射通过将至多500 μl施用到腹腔内来执行。
[0171]
疫苗接种在小鼠中执行了5种不同的疫苗接种试验:疫苗接种时间线i。balb/c小鼠在两次dna疫苗接种的引发

加强方案中接种疫苗,随后为一次ad5疫苗接种,或者单独的dna或ad5。作为对照,用pbs来注射小鼠。在接种ad5疫苗后四周,收集血样并且从一些小鼠中分离脾脏。随后,在右胁腹中用ct26肿瘤细胞s.c.攻击小鼠,并且测量肿瘤生长。
[0172]
疫苗接种时间线ii。用ct26肿瘤细胞s.c.攻击balb/c小鼠。在攻击后第2天(d.2 p.c.)或d.5 p.c.时(先前用dna引发),用ad5

melarv给小鼠接种疫苗。另外一组在d.2 p.c.时接种疫苗,并且随后在肿瘤刚可触知时(d.8 p.c.)便接受抗pd1抗体的四次注射。作为对照组,仅用pbs或抗pd1注射小鼠。
[0173]
疫苗接种时间线iii。在引发

加强方案中,用两次dna

melarv注射给c57bl/6小鼠接种疫苗,随后为ad5疫苗接种。在最后一次疫苗接种后3周获取血样,并且用2x105 b16f10

gp细胞进行i.v.攻击。在攻击后两周测定肺中的转移数目。
[0174]
疫苗接种时间线iv。首先用编码melarvgag_p2a_env(dna

melarv)或isd突变形式melarvgag_p2a_env_isd(dna

melarv

isd)的dna质粒,给cd1小鼠接种疫苗。dna引发随后为用ad5

melarv或ad5

melarv

isd的腺病毒疫苗接种。疫苗接种四周后获取血样,并且分析血清抗体。
[0175]
疫苗接种时间线v:c57bl/6小鼠用腺病毒(ad5

melarv_pix

p15e或ad5

melarv)接种疫苗两次。ad5

gfp用作对照。随后,获取血样,并且用2x105 b16f10

gp细胞i.v.攻击小鼠。在攻击后两周分离肺,并且分析转移。
[0176]
对于dna疫苗接种,i.m注射在50 μl tris/pbs(142mm)中的50 μg dna。将腺病毒与30 μl pbs中的2x10
8 ifu一起注射到足垫内。在包括pix修饰的病毒的实验中(疫苗时间线iv和v),i.m注射在60 μl pbs中的10
10
个病毒颗粒。由于pix病毒的浓度较低,将小体积注射到足垫内是不可能的。
[0177]
另一个实验包括在肿瘤攻击的小鼠(参见“0肿瘤攻击”)中施用抗pd1抗体(rmp1

14;#be0146;bioxcell)。用i.p.注射的在200 μl pbs中的200 μg抗体施用抗pd1。当皮下生长的肿瘤可触知时,治疗在肿瘤攻击后第8天开始。每第四天(在肿瘤攻击后第8、12、16和20天)对小鼠进行四次注射(kim,k.等人,eradicationofmetastaticmousecancersresistanttoimmunecheckpointblockadebysuppressionofmyeloid

derivedcells. proc natl acad sci u s a,2014. 111(32):第11774

9页,以及shindo,y.等人,combinationimmunotherapywith4

1bbactivationandpd

1blockadeenhancesantitumorefficacyinamousemodelofsubcutaneoustumor. anticancer res,2015. 35(1):第129

36页。
[0178]
在herv

k实验中,在用adv或dna疫苗的引发(第0天)后大约4或8周执行adv和/或mva加强。在引发疫苗接种之前和之后(第14天)均获取血样。在mva/adv/dna加强后第14和28天使小鼠放血。血样用于分析疫苗接种小鼠的体液应答(针对herv

k env的抗体的产生)。此外,在mva加强后10天对小鼠实施安乐死,以测试其细胞免疫应答(cd8 t herv

k env特异性t细胞的生成)。
[0179]
为了测试新型疫苗接种策略的疗效,在肿瘤攻击后10天仅给予一个剂量的疫苗。
[0180]
肿瘤攻击为了评价b16f10

gp细胞在体内的转移,培养的细胞用pbs洗涤3次,并且通过在37℃下在versene中温育15分钟进行脱离。随后将细胞以282g离心,用pbs洗涤并且在pbs中稀释至2x10^6个细胞/ml的浓度。将在100 μl pbs中的2x10^5个细胞i.v.注射到小鼠的尾静脉内,其导致肺中的肿瘤转移。14天后,对受攻击的小鼠实施安乐死。将肺分离并且在pbs中的2%多聚甲醛(pfa)溶液中固定过夜,随后为在4℃下在pbs中的贮存。在解剖显微镜下,转移计数为肺的表面上的黑色结节。样品是盲蔽的,并且转移通过至少两个个体进行计数。
[0181]
为了分析ct26肿瘤的原发性生长,ct26细胞如对于b16f10

gp细胞所述进行制备,并且在pbs中稀释至5x10^6个细胞/ml的浓度。在100μl pbs中的5x10^5个细胞在右大腿中的s.c.注射导致在注射部位处的肿瘤形成。每周以长度和宽度测量肿瘤大小三次。肿瘤体积确定为:长度*宽度2*0,5236(janik,p.等人,theeffectofestrone

progesteronetreatmentoncellproliferationkineticsofhormone

dependentgrmousemammarytumors. cancer research,1975. 35(12):第3698

3704页)。当肿瘤在任一侧上超过16 mm、出现坏死性伤口或小鼠的活动性明显减少时,对小鼠实施安乐死。在肿瘤测量过程中,不同的疫苗接种组是盲蔽的,以防止偏差评价。
[0182]
除ct26攻击外,balb/c小鼠用在100 μl pbs中的2.5x10^4 4t1

luc个细胞注射到胸部乳房脂肪垫内。为了在6周后显现肿瘤形成,小鼠用萤光素(每10 g小鼠1.5 mg)进行i.p.注射,并且在注射后12分钟使用ivis spectrum体内成像系统进行成像。ivis成像通过andreea

cornelia udrea和melanie schwerdtfeger来执行。
[0183]
为了分析rlz gag和env细胞在体内的肿瘤生长和转移,将细胞培养直至60

80%汇合。一旦达到所需的汇合,就将rlz细胞用pbs洗涤3次,然后在37℃加入versene共15分钟,以便使细胞脱离。其后,将细胞以282 g向下旋转,使用pbs洗涤,且最后在pbs内稀释至107个细胞/ml。每一只小鼠对于肺转移用106个细胞/100 μl进行i.v.注射,并且对于皮下肿瘤进行s.c.注射。为了评价肺转移,在第0、7和14天以及其后每2天给小鼠称重。如果小鼠在几天内丧失了约15

20%的重量,则对它们实施安乐死。关于终止的终点设定为肿瘤攻击后第40天。荷有s.c.肿瘤的小鼠在与i.v.

攻击的小鼠相同的时间点进行检查,并且当它们的肿瘤直径超过16 mm时实施安乐死。
[0184]
分离出s.c.肿瘤和肺两者,并且浸入4%多聚甲醛(pfa)和以ph = 7.2的磷酸盐缓冲液0.01 mol/l(rigshospitalet,copenhagen,丹麦)中,并且贮存于4
º
c下。使用来自疫苗接种小鼠的高滴度血清处理样品,并且分析组织的herv

k env特异性染色。
[0185]
蛋白质印迹对于pix蛋白的检测,将细胞裂解产物(~10 μg)或纯化的病毒(10
10
个病毒颗粒)与6x含有ddt的sds上样缓冲液混合,并且在95℃下加热5分钟。为了显示melarv蛋白的表达,将细胞裂解产物(5 μg)、细胞上清液(15 μg)和纯化的vlp(~2 μg)同样地与含有ddt的上样缓冲液混合,但不加热样品。将混合物加载到nupage
tm 4

12% bis

tris protein gel(#np0322,thermo fisher)上,并且在mops缓冲液中在150 v下运行1小时。在湿转移系统中,将凝胶中的蛋白质含量在30 v下印迹到硝酸纤维素膜共1小时。
[0186]
在转移后,膜用tris缓冲盐水 tween 20(tbs

t)中的5%脱脂乳封闭1小时。随
后,将膜在振荡器上用tbs

t洗涤3次,每次10分钟,并且与稀释的一抗(表3)(在tbs

t 3%脱脂乳中)一起在4℃下温育过夜。在另外的三个洗涤步骤后,添加在tbs

t中的hrp缀合的二抗,并且使膜在rt下温育1小时。洗去未结合的二抗,并且使用imagequant las 4000中的lumiglo reserve chemiluminescent substrate(54

61

00或54

71

02)显现靶蛋白。
[0187]
表3:用于蛋白质印迹和elisa的一抗和二抗列表。该表列出了用于蛋白质印迹的不同一抗及其起源。进一步显示的是所使用的稀释物以及选择哪种二抗用于检测。一些抗体也以稍后描述的稀释度用于elisa分析。一抗产品编号/起源稀释度二抗抗p2a#abs31;millipore1:1000抗兔ig

hrp(#p0448,dako)mm2

9b6来自杂交瘤的20x细胞培养上清液(由tsuyoshitakami,universityofarizonahealthsciencescenter提供)1:200抗小鼠ig

hrp(#p0447,dako)4f5来自杂交瘤的浓缩细胞培养上清液(由georgecianciolo,dukeuniversitymedicalcenter提供)1:200抗小鼠ig

hrp(#p0447,dako)19f8来自杂交瘤的浓缩细胞培养上清液(由georgecianciolo,dukeuniversitymedicalcenter提供)1:200抗小鼠ig

hrp(#p0447,dako)抗pix在兔中产生的抗体(由davidt.curiel,washingtonuniversityinst.louis提供)1:1000抗兔ig

hrp(#p0448,dako)
[0188]
在herv

k相关的实验中,通过wb技术分析了在蛋白质水平下的vlp表达。为了保证样品的相等加载,根据制造商的指南,使用pierce

二辛可宁酸(bca)protein assay kit(thermo fisher scientific,23225),测量vlp(sn)和细胞裂解产物两者的蛋白质浓度。将含有二硫苏糖醇(dtt)的6x十二烷基硫酸钠(sds)上样缓冲液加入不同的样品内,所述样品置于在95℃下的块加热器sbh130dc(stuart)内5分钟。随后,将5
ꢀµ
g蛋白质以及7
ꢀµ
l runblue
tm prestained marker(expedeon,nxa05160),连同nupage
™ꢀ
mops sds running buffer(thermo fisher scientific,np0001)一起,加载到nupage
™ꢀ4‑
12% bis

tris protein gels(thermo fisher scientific,np0322)内。通过在180 v下45分钟的sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds

page)分开样品。
[0189]
此后,将样品在30 v下转移至0.45
ꢀµ
m硝酸纤维素印迹膜(bio

rad,1620115)共45分钟。对于这个步骤,使用具有20%乙醇的转移缓冲液(以ph 8.5的3.75 g/l trizma
®
碱,18.1 g/l对羟苯甘氨酸)。
[0190]
为了预防非特异性结合,使用在具有tween的tris缓冲盐水(tbs

t)(以ph 7.6的6.06 g/l trizma
®
碱、8.76 g/l nacl、0.25%(v/v)tween

20)中的5%(w/v)脱脂奶粉,将膜
1% bsa 0.1% nan3)中,所述培养基含有以1:50稀释度的小鼠血清。在4℃下的20分钟温育后,使板在784g下离心3分钟(4℃),并且去除培养基。细胞用200 μl洗涤培养基(pbs 0.1% nan3)洗涤两次,并且重悬浮于50 μl facs培养基中,所述培养基含有1:100稀释的荧光标记的针对小鼠免疫球蛋白g(igg)的二抗(山羊抗小鼠igg_apc;#405308,biolegend)。使细胞在4℃下温育20分钟,用洗涤培养基洗涤两次,并且在4℃下在200 μl pfa溶液(在pbs中的1%)中固定15分钟。将细胞重悬浮于facs培养基中两次,并且在bd lsr ii流式细胞仪中分析荧光。
[0203]
在相同的方案后,使用针对不同表位的单克隆抗体(表5),执行受感染的vero细胞的表面上的melarv env检测。二抗是抗小鼠igg_apc(1:100)或山羊抗小鼠igm重链_rpe(1:100;a10689,invitrogen)。
[0204]
进一步地,基于编码herv

k wt和herv

k isd mut转基因(sirion)的ad19载体,执行这项技术来表征新的疫苗策略,以及比较不同腺病毒载体的使用(ad19相对于ad5)。表面染色用于通过流式细胞术检测受感染的a549细胞的表面上herv

k env蛋白的存在。
[0205]
将3x106个a549细胞接种到75 cm2烧瓶内的15 ml ham's f

12k培养基中,并且在37℃下温育2小时。每个烧瓶感染有50 moi的下述病毒(1.5x108 ifu/烧瓶):ad5

(teto)

cmv

sivgag_p2a_herv

k108env_p2tsad19a(ii)

(teto)

cmv

isdmut_melarv

p2ts来自sirion的ad19a(ii)

(teto)

cmv

coherv

k

p2ts来自sirion的ad19a(ii)

(teto)

cmv

isdmut_coherv

k

p2ts然后使它们在37℃下温育5小时,这之后将培养基更换为ham's f

12k不含fbs的培养基。然后,使细胞在37℃下温育48小时。
[0206]
将细胞放置在laf工作台内部的冰上。抽吸出培养基,并且将细胞用冷pbs小心地洗涤,并且在冷pbs中刮下,然后通过离心(3分钟,4℃,784 g)分开细胞。将细胞重悬浮于pbs中,并且分配到圆底96孔板(thermo fisher scientific,163320)内。使板离心(3分钟,4℃,784 g),并且通过轻弹板去除sn。将细胞在4℃下重悬浮于50
ꢀµ
l含有2
ꢀµ
g/ml小鼠单克隆(igg)一抗的facs缓冲液中20分钟,所述一抗针对herv

k env蛋白(austral biologicals,herm

1811

5)的p15e(tm)结构域。其后,将细胞用facs洗涤缓冲液(首先使用150
ꢀµ
l的体积,并且其后为200
ꢀµ
l)洗涤,并且离心(3分钟,4℃,784 g)3次。使板与100
ꢀµ
l facs缓冲液一起温育,所述缓冲液内先前加入以1:100稀释的山羊抗小鼠igg apc二抗(biolegend,405308)。它们经历在4℃下避光的20分钟温育。使细胞离心(3分钟,4℃,784 g),并且用200
ꢀµ
l facs洗涤缓冲液洗涤3次。随后,使它们在200
ꢀµ
l 1%(w/v)多聚甲醛(pfa;rigshospitalet,copenhagen,丹麦)中在4℃下避光在15分钟期间进行温育。这之后,使它们离心(3分钟,4℃,784 g),并且重悬浮于100
ꢀµ
l facs缓冲液中,且再次离心(3分钟,4℃,784 g)。最后将它们重悬浮于200
ꢀµ
l,并在黑暗中在4℃下保存o/n。第二天,使用流式细胞仪bd lsr ii分析细胞的荧光,并且使用flowjo 10(flowjo llc)处理且分析数据。
[0207]
受刺激脾细胞的细胞内染色(ics)在疫苗接种后3

4周,对小鼠实施安乐死并分离脾脏。将提取的脾脏转移到hanks b.s.s.内,并且通过无菌网捣碎以获得单细胞悬浮液。在离心和重悬浮于完全rpmi中后,测定脾细胞的浓度,并且将细胞稀释至所需浓度。
[0208]
将脾细胞以2.5x106个细胞/孔加入圆底96孔板内。使细胞以784g离心3分钟,然后重悬浮于含有3μm莫能菌素(通路抑制剂)和1μg/ml肽(ah1)的完全rpmi( 50 μm 2

巯基乙醇)中,而阴性对照则不接受该肽。随后,使细胞在37℃下温育5小时。在facs培养基(pbs 1% bsa 0.1% nan
3 3 μm莫能菌素)中洗涤细胞后,使细胞与在facs培养基中1:100稀释的荧光标记的表面抗体(抗cd4、抗cd8、抗cd44、抗b220)一起在4℃下温育20分钟。细胞用pbs 3 μm莫能菌素洗涤两次,并且在1% pfa中在4℃下固定15分钟。在facs培养基中洗涤后,细胞在rt下用pbs中的0.5%皂苷渗透化处理10分钟。细胞内抗体(抗ifnγ、抗tnfα)以在pbs 0.5%皂苷中1:100的稀释度加入,并且在4℃下温育20分钟。将细胞洗涤两次,并且最终重悬浮于pbs 1% bsa 0.1% nan3中。在bd lsr ii流式细胞仪中分析细胞的荧光。流式细胞术数据的分析显示于补充图5。
[0209]
表5:用于流式细胞术的一抗列表。该表列出了用于流式细胞术的一抗,其起源,工作稀释度和分别的荧光缀合的二抗。一些一抗直接与荧光缀合,并且无需用二抗进行标记。一抗产品编号/起源稀释度二抗小鼠血清从疫苗接种小鼠中分离1:50山羊抗小鼠igg_apc19f8(抗melarvenv;p15e)来自杂交瘤的浓缩细胞培养上清液(由georgecianciolo,dukeuniversitymedicalcenter提供)1:50山羊抗小鼠igg_apc4f5(抗melarvenv;p15e)来自杂交瘤的浓缩细胞培养上清液(由georgecianciolo,dukeuniversitymedicalcenter提供)1:50山羊抗小鼠igg_apcmm2

9b6(抗melarvenv;gp70)来自杂交瘤的20x细胞培养上清液(由tsuyoshitakami,universityofarizonahealthsciencescenter提供)1:50山羊抗小鼠igg_apcmm2

3c6(抗melarvenv;gp70)来自杂交瘤的20x细胞培养上清液(由tsuyoshitakami,universityofarizonahealthsciencescenter提供)1:50山羊抗小鼠igm_pemm2

9a3(抗melarvenv;gp70)来自杂交瘤的细胞培养上清液(由tsuyoshitakami,universityofarizonahealthsciencescenter提供)未稀释的山羊抗小鼠igg_apcpercp/cy5.5

cd8#100734,biolegend1:100fitc

cd4#317407,biolegend1:100
pacificblue

b220#rm2628,invitrogen1:100apc/cy7

cd44#103028,biolegend1:100apc

ifn#505810,biolegend1:100pe/cy7

tnfα#506324,biolegend1:100pe/cy7

cd8#100721,biolegend1:100pacificblue

cd8#100728,biolegend1:100apc

cd8#100711,biolegend1:100apc/cy7

cd8#100713,biolegend1:100
[0210]
在herv

k相关的实验中,执行脾细胞ics,以评价衍生自疫苗接种小鼠的特定细胞应答。为了能够执行这个实验,先前就其刺激herv

k疫苗接种的小鼠cd8 t细胞的能力,测试了由c57bl/6和balb/c小鼠品系两者的8

10个氨基酸构成的不同强结合(sb)herv

k肽。在herv

k env序列的位置192处仅一个balb/c 10聚体肽(tyhmvsgmsl;seq id no.47)给出应答。因此,命名为p

hke的这种肽用于刺激balb/c小鼠的脾细胞,所述balb/c小鼠用编码herv

k env的ad5和ad19载体,连同含有在env isd处的突变的改善ad19疫苗一起进行免疫。
[0211]
表5a. 用于从疫苗接种小鼠获得的脾细胞的细胞外和细胞内染色的抗体,以测试其衍生的细胞应答。抗体来源单克隆大鼠抗小鼠tnfα,pe/cy7缀合的biolegend,506324单克隆大鼠抗小鼠干扰素γ(ifnγ),apc缀合的biolegend,505810单克隆大鼠抗小鼠b220,pacificblue
tm
缀合的invitrogen,rm2628单克隆大鼠抗小鼠/人cd44,apc/cy7缀合的biolegend,103028单克隆大鼠抗小鼠cd8a,percp/cy5.5缀合的biolegend,100734单克隆大鼠抗小鼠cd4,fitc缀合的biolegend,100406单克隆大鼠抗小鼠cd8a,apc/cy7缀合的biolegend,100713单克隆大鼠抗小鼠cd8a,apc缀合的biolegend,100711单克隆大鼠抗小鼠cd8a,pacificblue
tm
缀合的biolegend,10072单克隆大鼠抗小鼠cd8a,pe/cy7缀合的biolegend,100721
[0212]
ad5和ad19 herv

k/isdmut疫苗接种(引发)小鼠用于这个实验,目的是比较含有不同载体的不同疫苗的功效和插入改善策略。用mva载体的加强免疫后10天,对小鼠实施安乐死,并且将其脾脏收集在5 ml hank's bss培养基中。将脾脏通过无菌网corning
®ꢀ
70
ꢀµ
m细胞滤器(sigma

aldrich,cls431751)捣碎,目的是获得单细胞的悬浮液。随后,计数细胞的数目,以便接种所需量的细胞/孔,以及提供细胞/脾脏的总数目,以稍后计算每个脾脏的ifnγ cd8 和cd4 t细胞的绝对数目。
[0213]
将大约3x106个细胞/孔接种到圆底96孔板内,将其离心(3分钟,4℃,784 g)并重悬浮于rpmi培养基中。将tyhmvsgmsl(seq id no:47)之前提到的命名为p

hke的herv

k env的10聚体肽溶解于二甲基亚砜(dmso)中,至400 ng/
µ
l的浓度。然后将它再次溶解于pbs中至100 ng/
µ
l的浓度,并且最后将rpmi加入先前的稀释物中,以获得6.67 ng/
µ
l的浓度。在添加p

hke肽之前,为了防止细胞因子从细胞中排出,将50
ꢀµ
l的蛋白转运抑制剂莫能菌素(3
ꢀµ
m)加入孔中。另外,将30 μl/孔的上述p

hke肽加入受刺激的孔中,以诱导t细胞细胞因子的产生。剩余的孔不接受任何肽,而是仅接受与受刺激样品相同浓度的dmso,并且用作阴性对照。使细胞在37℃下温育5小时。
[0214]
在温育时间后,将细胞离心(3分钟,4℃,784 g),并且用100
ꢀµ
l含有莫能菌素(3
ꢀµ
m)的facs缓冲液洗涤两次。表面抗体(percp/cy5.5

cd8,fitc

cd4,pacific blue
tm

b220,apc/cy7

cd44)在含有莫能菌素(3
ꢀµ
m)的facs缓冲液内进行1:100稀释。用50
ꢀµ
l先前溶液重悬浮脾细胞,并且含有1:100稀释的下述抗体的50
ꢀµ
l facs/莫能菌素(3
ꢀµ
m)用于进行补偿:percp/cy5.5

cd8、fitc

cd4、pacific blue
tm

cd8、apc/cy7

cd8、apc

cd8、pe/cy7

cd8。使板在4℃下,在黑暗中温育20分钟。孔用100
ꢀµ
l具有3
ꢀµ
m莫能菌素的pbs洗涤两次。然后,将100
ꢀµ
l pbs/莫能菌素(3
ꢀµ
m)连同100
ꢀµ
l pfa(2%)一起加入,以便在黑暗中在4℃过程中固定细胞。细胞使用facs/莫能菌素(3
ꢀµ
m)再次洗涤两次,并且用150
ꢀµ
l在pbs中的0.5%皂苷在20℃下(在黑暗中)重悬浮10分钟。一旦细胞进行渗透化处理,细胞内抗体(apc

ifnγ、pe/cy7

tnfα)就在0.5%皂苷/pbs中进行1:100稀释,并且向孔中加入50
ꢀµ
l,并且使板在4℃下在黑暗中温育10分钟。用含有1% bsa和0.1 % nan3的pbs洗涤细胞,并且最终重悬浮于200
ꢀµ
l的相同缓冲液中。将板保持o/n在4℃下。
[0215]
另外,执行a549转染的细胞的细胞内染色,以确证在细胞内部的herv

k env蛋白的存在。在这种情况下,评价了生产(而不是分泌到细胞膜)。后面一种方案随后为添加在4℃下、在黑暗中的10分钟温育步骤,所述温育步骤用150
ꢀµ
l在pbs中稀释的0.5%(w/v)皂苷(sigma aldrich,47036)。需要这个额外的步骤,以便使细胞膜渗透化。抗体也稀释到0.5%皂苷内。
[0216]
门控策略flowjo 10(flowjo llc)用于分析来自细胞外和ic facs染色两者的数据(参见图27)。最初,细胞在前向散射(fsc)

h和fsc

a中绘制,并进行门控。这个门用于在侧向散射(ssc)

a和fsc

a图中分离淋巴细胞群体。后面一个群体对于cd8 cd4

细胞,并且其后对于cd8 b220

细胞进行门控,以获得cd8 t细胞群体,从分析中去除cd4 t细胞和b细胞(b220标记物)(coffman&weissman 1981)。然后,细胞对于cd8 cd44 t细胞进行门控,以仅获得活化的cd8 t细胞。这些进一步对于ifnγ cd44 细胞进行门控,其为t细胞活化之后表达的两种标记物。此外,当与tnfα细胞因子相比较时(badovinac & harty 2000),(kristensen等人2004),已知ifnγ是关于活化cd8 t细胞的更高灵敏度标记物。另外,cd8 cd44 t细胞对于ifnγ tnfα 细胞进行门控,因为已知产生多重细胞因子的cd4 t细胞具有更高水平的活性、激活和转变成记忆细胞(kannanganat等人2007)。
[0217]
为了估计ifnγ cd44 b220
‑ꢀ
cd8 t细胞的绝对数目,将淋巴细胞的ifnγ cd44 b220
‑ꢀ
cd8 t细胞的%乘以每个脾脏的淋巴细胞数目。另外,将ifnγ tnfα 细胞除以ifnγ tnfα 和ifnγ tnfα

细胞的总和,计算ifnγ cd8 的双阳性(ifnγ tnfα )细胞的%。
[0218]
酶联免疫斑点(elispot)执行elispot测定,以检测抗原特异性t细胞。这个实验中使用的肽是ah1(spsyvyhqf),其为balb/c小鼠中已知的h2

ld限制性t细胞表位,其位于melarv env亚基gp70中(huang,a.y.等人,theimmunodominantmajorhistocompatibilitycomplexclassi

restrictedantigenofamurinecolontumorderivesfromanendogenousretroviralgeneproduct. proc natl acad sci u s a,1996. 93(18):第9730

5页)。
[0219]
如对于ics所述制备疫苗接种小鼠的脾细胞。
[0220]
使用小鼠ifn

γt细胞elispot试剂盒(ct317

pr5,u

cytech)执行测定。简言之,将聚偏二氟乙烯(pvdf)96孔板(msip s4510,millipore)的膜用70%乙醇激活,然后用抗鼠ifn

γ抗体包被过夜。在去除包被抗体并封闭膜后,将脾细胞以2x10^5个细胞/孔接种在含有1 μg/ml ah1的完全rpmi培养基中。作为对照,脾细胞不受刺激、或用有效的t细胞激活物伴刀豆球蛋白a(cona)(2 μg/ml)进行刺激。在正常细胞培养条件下的48小时温育后,去除细胞,洗涤孔,随后与靶向ifn

γ的生物素化检测抗体一起温育。加入链霉抗生物素蛋白

hrp缀合物,并且使用aec底物溶液显现ifn

γ斑点。使用ctl immunospot分析仪计数斑点。
[0221]
阳性对照(对照血清lev76)阳性对照血清lev76用作小鼠血清样品的流式细胞术和elisa分析的标准。lev76血清源自较早的初步研究,其中c57bl/6小鼠针对melarv env进行疫苗接种,并且显示免于b16f10

gp肺转移的保护。因此,这种血清中的抗体应答对应于潜在地能够保护免于肿瘤攻击的水平,并且因此充当关于成功的抗体应答的参考值。另外,使用lev76对照血清作为标准品允许在不同实验之间的比较。
[0222]
统计分析所有统计分析都使用graphpad prism软件(v5.03)执行。各组使用两尾非配对的曼怀二氏检验进行比较。显著性通过星号指示:*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。当比较不同组的疫苗接种小鼠时,结果显示为每个组的平均值与平均值的标准误(sem)。
[0223]
卡普兰

梅尔估计量用于比较小鼠的存活曲线。这个检验测量在给定治疗后的一段时间内的存活受试者的部分。显著结果用星号(*)显示,其中*(p ≤ 0.05);**(p ≤ 0.01);***(p ≤ 0.001)。
[0224]
为了评价应答之间的相关性,使用了斯皮尔曼相关系数,随后为通过holm

sidak方法的p值调整。
[0225]
实施例1疫苗编码的免疫抑制结构域(isd)中的突变作为改善的第一策略,在melarv env的序列中引入两个点突变,以使免疫抑制结构域(isd)失活(图3)。这些特定的突变在之前通过schlecht

louf等人对于鼠白血病病毒进行测试且分析(schlecht

louf,g.等人,retroviralinfectioninvivorequiresan
immuneescapevirulencefactorencryptedintheenvelopeproteinofoncoretroviruses. proc natl acad sci u s a,2010. 107(8):第3782

7页)。编码这种修饰形式的melarv env的病毒称为ad5

melarv

isd。
[0226]
ad5

melarv

isd对cd1小鼠中的抗体应答的作用远交cd1小鼠用dna

melarv或dna

melarv

isd进行引发,并且随后根据疫苗接种时间线iv,用ad5

melarv或ad5

melarv

isd进行加强。在腺病毒疫苗接种后四周,收集血样并通过elisa进行分析。
[0227]
如图7a中所示,p15e特异性抗体在接种ad5

melarv

isd疫苗的小鼠中是增加的。尤其是dna

melarv

isd和ad5

melarv

isd的组合(条d)产生与lev76对照血清相当的高抗体应答。
[0228]
另外,与gfp对照(条e)相比,用ad5

melarv(条a和c)和ad5

melarv

isd(条b和d)的疫苗接种增加了肿瘤细胞特异性抗体的水平(图7b)。然而,ad5

melarv

isd诱导的肿瘤结合抗体水平明显低于ad5

melarv(条a相对于b;以及条c相对于d,但并非显著地)。
[0229]
p15e和b16f10

gp结合抗体水平均提示,与dna

melarv引发的小鼠相比,用dna

melarv

isd引发一般增加抗体应答,尽管这些结果并不显著。
[0230]
实施例2ad5

melarv

isd对c57bl/6小鼠中的抗体应答和转移的作用根据疫苗接种时间线iii,对c57bl/6小鼠进行疫苗接种和攻击。小鼠接受dna

melarv或dna

melarv

isd,随后为相应的腺病毒。抗体应答的分析揭示,melarv

isd略微增加b16f10

gp细胞特异性抗体的水平(图8a)。然而,这种增加并不显著,并且仅略高于接种pbs疫苗的小鼠的本底。如图8b中所示,未观察到对于p15e特异性的抗体的作用。与肿瘤细胞结合抗体相对应,转移在接种melarv

isd疫苗的小鼠中略微减少,但无显著差异(图8c)。
[0231]
实施例3ad5

melarv

isd对balb/c小鼠中的t细胞应答的作用除抗体应答之外,还分析了ad5

melarv

isd对t细胞引发和激活的作用。elispot(图9)和ics(图10)两者均显示,与ad5

melarv相比,接种ad5

melarv

isd疫苗的小鼠中的ah1特异性t细胞的水平增加。如通过ics观察到的,与天然形式相比,双阳性ifnγ
tnfα
cd8
t细胞在接种ad5

melarv

isd疫苗的小鼠中显著增加。ifnγ

细胞的积分几何平均值(igm)也显示与天然ad5

melarv的显著差异。igm将阳性细胞的数目与平均荧光强度组合,并且因此也考虑了活化免疫细胞的质量。tnfα的igm仍是不显著的(数据未显示)。
[0232]
实施例4ad5

melarv/ad5

melarv

isd对免疫抑制的作用为了分析ad5

melarv

isd的免疫应答增加背后的机制,分析了通过疫苗的免疫抑制。通过elisa就针对病毒载体ad5的免疫应答,分析了与接种ad5

melarv或ad5

melarv

isd疫苗的小鼠的图7中相同的小鼠血清。与天然形式的melarv env(具有功能性isd的ad5

melarv)相比,isd失活的melarv env疫苗(ad5

melarv

isd)显示ad5结合抗体的滴度显著增加。
[0233]
实施例5在腺病毒载体的衣壳蛋白pix上展示抗原
伴随增加保护性抗体应答的尝试,将p15e与先前测试的腺病毒疫苗上的腺病毒衣壳蛋白pix偶联。图12中显示了测试的不同构建体。将天然p15e(排除跨膜亚基和细胞质尾部)加入pix(1)或可替代地isd突变形式(2)中。另外,测试了截短至isd的p15e的变体,其展示了另外的半胱氨酸(3)或未展示(4)。病毒载体的核心与展示的p15e相匹配:对于pix

p15e、pix

p15e

trunc

wc和pix

p15e

trunc

w/oc的ad5

melarv,以及对于pix

p15e

isd的ad5

melarv

isd。
[0234]
在衣壳蛋白pix上展示p15e的ad5载体的表征通过转染hek293细胞,就重组pix的正确表达,测试了新的pix质粒构建体(pcdna3

pix

taglinker

xxx,其中xxx = p15e抗原)。通过使用抗pix抗体的蛋白质印迹,分析了转染细胞的裂解产物(图13a)。所有四个构建体都显示了重组pix的表达,具有截短的p15e形式(第3行和第4行)的预期较低条带。与pix偶联的gfp用作阳性对照,具有约50 kda的较高条带。为了验证重组pix整合到病毒载体内,通过使用抗pix抗体的蛋白质印迹分析纯化的病毒(图13b)。紧靠天然pix条带(约10 kda),所有构建体都显示了重组pix的表达。未修饰的ad5(
ø
)的阴性对照仅显示出天然pix条带。使用imagej软件(版本1.51n)来定量条带强度,并且重组pix的百分比显示在表8。
[0235]
表8:重组pix进入ad5载体内的整合效率。就重组pix进入病毒载体内的整合效率,分析了在病毒pix上展示蛋白质的重组ad5病毒。通过蛋白质印迹分析病毒(图13),并且定量条带强度。该表显示了病毒颗粒中的总pix的重组pix的百分比。病毒总pix的%重组pix
ø
0
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