寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法
1.相关申请
2.本申请要求于2018年8月21日提交的题为“寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法”的美国临时申请62/720,924；2018年11月3日提交的题为“寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法”的美国临时申请62/755,461；2018年11月8日提交的题为“寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法”的美国临时申请62/757,723；2019年5月8日提交的题为“寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法”的美国临时申请62/845,295的申请日的权益，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及寡糖组合物及其用途。
背景技术：
4.肠道微生物组是肠道中约一百万亿(1x10
14
)微生物细胞的生态系统，其可以看作是人体的重要器官，负责人类细胞无法独立执行的功能。肠道微生物群(gut microbiota)通过影响营养物质的利用、定植抗力、免疫系统的发育、宿主代谢的调节以及宿主生理的其他各个方面，在人类健康和疾病中发挥关键作用。肠道微生物群对宿主代谢能力的贡献的一个实例是氮的利用。结肠富含氮源，其包括粘蛋白、尿素和逃脱宿主消化的日常摄入氨基酸。一些肠道微生物可以从这些分子中释放出氨，并将该氨掺入细菌性生物分子中，例如蛋白质和核酸。然而，释放出的氨的量通常超过这些肠道细菌的代谢需求，其导致氨在肠道中积聚。在非酸性条件下，该氨会通过肠道上皮扩散进入门脉循环，这可能是高氨血症患者的氨水平升高的重要原因。
技术实现要素：
5.根据一些方面，本文提供了利用寡糖组合物的微生物组代谢疗法，其可用于驱动肠道微生物组器官的功能输出，例如以治疗疾病和改善整体健康。在一些实施方案中，这种寡糖组合物对于在受试者中降低氨水平特别有效。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡糖组合物可用于治疗患有与高氨血症有关的障碍(例如尿素循环代谢障碍和肝性脑病)的受试者。
6.一方面，提供了包含多种寡糖的寡糖组合物，该寡糖包括式(i)：
[0007][0008]
其中r独立地选自氢以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：
[0009][0010]
其中r独立地定义如上。
[0011]
在一些实施方案中，提供了包含多种寡糖的寡糖组合物，该寡糖包括式(i)：
[0012][0013]
其中r选自基本上由以下组成的组：氢、式(ia)、式(ib)、式(ic)和式(id)：
[0014][0015]
其中r独立地定义如上。
[0016]
在某些方面，本文提供了包含多种寡糖的寡糖组合物，所述组合物的特征在于，包含信号1、3和4的多重编辑梯度增强的(multiplicity
‑
edited gradient
‑
enhanced)1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)nmr谱图，各信号具有如下中心位置和面积：
[0017][0018]
在一些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0019]
[0020]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的nmr谱图还包含1
‑
2个选自信号8和9的信号，各信号具有如下中心位置和面积：
[0021][0022]
在一些实施方案中，信号8和9定义如下：
[0023][0024]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的nmr谱图还包括选自信号6、7、11、12、13和14的1
‑
6个信号，各信号具有如下中心位置和面积：
[0025][0026][0027]
在一些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0028][0029]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的nmr谱图还包括选自信号2、5和10的1
‑
3个信号：
[0030][0031]
在一些实施方案中，信号2、5和10定义如下：
[0032][0033]
在一些实施方案中，寡糖组合物的nmr谱图的信号1
‑
14进一步通过1h积分区和
13
c积分区表征，其定义如下：
[0034][0035]
在一些实施方案中，寡糖组合物的nmr谱图是通过对组合物样品进行多重编辑梯度增强的1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)实验而得到的，该实验使用回波
‑
反回波方案(echo
‑
antiecho scheme)通过以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干选择：
[0036]
脉冲序列图
[0037][0038]
采集参数
[0039]1h载波频率＝4ppm
[0040]
13
c载波频率＝65ppm
[0041]
采集维度(acquisition dimension)中的点数＝596
[0042]
采集维度中的频谱范围(spectral range in acquisition dimension)＝6.00ppm至2.03ppm
[0043]
间接维度(indirect dimension)中的点数＝300个复杂点(complex points)
[0044]
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
[0045]
循环延迟(recycle delay)＝1秒
[0046]
单键1h
‑
13
c耦合常数＝j
ch
＝146hz
[0047]
扫描次数＝8
[0048]
温度＝298k
[0049]
溶剂＝d2o
[0050]
处理参数
[0051]
直接维度的窗函数＝高斯展宽(gaussian broadening)，7.66hz
[0052]
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48hz
[0053]
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点
[0054]
在一些实施方案中，通过对组合物的样品进行hsqc nmr获得寡糖组合物的nmr光谱，其中该样品是在d2o中的溶液。
[0055]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp11。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp4至约dp8。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp6。
[0056]
在一些实施方案中，所述组合物包含16％至24％的右旋糖当量(干基)。在一些实施方案中，所述组合物包含13％至27％的右旋糖当量(干基)。在一些实施方案中，该组合物包含50％至95％的总膳食纤维(干基)。在一些实施方案中，所述组合物包含至少60％、70％、80％或90％的总膳食纤维(干基)。
[0057]
在某些方面，本文提供了包含多种寡糖的寡糖组合物，每种寡糖包含多种单体基团；
[0058]
所述多种寡糖，其包含选自基团(1)
‑
(7)中的两种或更多种类型的单体基团，其中所选择的基团以限定的摩尔百分比(mol％)范围存在于所述多种寡糖中：
[0059]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；
[0060]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中18.94
‑
24.61mol％的单体基团；
[0061]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.64mol％的单体基团；
[0062]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；
[0063]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中至少1.41mol％的单体基团；
[0064]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.11
‑
1.00mol％的单体基团；以及
[0065]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团；
[0066]
其中所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是(4)、(5)或(7)。
[0067]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0068]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团。
[0069]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0070]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.22mol％的单体基团。
[0071]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0072]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中至少1.41mol％的单体基团。
[0073]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0074]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中至少1.54mol％的单体基团。
[0075]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0076]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团。
[0077]
在一些实施方案中，所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：
[0078]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.64mol％的单体基团。
[0079]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含三种、四种、五种、六种或七种类型的选自基团(1)
‑
(7)的单体基团。
[0080]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含两种或三种选自基团(4)、(5)或(7)的单体基团。
[0081]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物进一步包含一种或多种选自基团(8)
‑
(12)的单体基团：
[0082]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中26.87
‑
46.98mol％的单体基团；
[0083]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.94
‑
9.25mol％的单体基团；
[0084]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.64
‑
1.43mol％的单体基团；
[0085]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中5.09
‑
9.66mol％的单体基团；和
[0086]
(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.08
‑
0.85mol％的单体基团。
[0087]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含一种、两种、三种、四种或五种类型的选自基团(8)
‑
(12)的单体基团。
[0088]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物进一步包含一种或多种选自基团(13)
‑
(15)的单体基团：
[0089]
(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中2.35
‑
6.01mol％的单体基团；
[0090]
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.06
‑
0.86mol％的单体基团；和
[0091]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团。
[0092]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含一种、两种或三种选自基团(13)
‑
(15)的单体基团。
[0093]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含基团(1)
‑
(15)：
[0094]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；
[0095]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中18.94
‑
24.61mol％的单体基团；
[0096]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.64mol％的单体基团；
[0097]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；
[0098]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.64
‑
1.43mol％的单体基团；
[0099]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基
团；
[0100]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团；
[0101]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中26.87
‑
46.98mol％的单体基团；
[0102]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.94
‑
9.25mol％的单体基团；
[0103]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.64
‑
1.43mol％的单体基团；
[0104]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中5.09
‑
9.66mol％的单体基团；
[0105]
(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.08
‑
0.85mol％的单体基团；
[0106]
(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中2.35
‑
6.01mol％的单体基团；
[0107]
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.06
‑
0.86mol％的单体基团；和
[0108]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团。
[0109]
在一些实施方案中，所述多种寡糖包含：
[0110]
25
‑
45mol％吡喃葡萄糖单基；
[0111]
35
‑
55mol％吡喃葡萄糖二基；
[0112]
10
‑
25mol％吡喃葡萄糖三基；和
[0113]
0.5
‑
5mol％吡喃葡萄糖四基。
[0114]
在一些实施方案中，所述多种寡糖包含：
[0115]
30
‑
43mol％吡喃葡萄糖单基；
[0116]
41
‑
50mol％吡喃葡萄糖二基；
[0117]
12
‑
19mol％吡喃葡萄糖三基；和
[0118]
0.8
‑
3mol％吡喃葡萄糖四基。
[0119]
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种寡糖，每种寡糖包含多种单体基团；
[0120]
所述多种寡糖，其包含选自基团(1)
‑
(7)中的两种或更多种类型的单体基团，其中所选择的基团以限定的摩尔百分比(mol％)范围存在于所述多种寡糖中：
[0121]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；
[0122]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少18.94mol％的单体基团；
[0123]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.74mol％的单体基团；
[0124]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；
[0125]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.01
‑
2.59mol％的单体基团；
[0126]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于1.00mol％的单体基团；和
[0127]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团；
[0128]
其中所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是(4)或(7)。
[0129]
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种寡糖，每种寡糖包含多种单体基团；所述多种寡糖，其包含两种或更多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种)选自基团(1)
‑
(15)的单体基团，其中所选择的基团以限定的摩尔百分比(mol％)范围存在于所述多种寡糖中：
[0130]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；
[0131]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少18.94mol％的单体基团；
[0132]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.74mol％的单体基团；
[0133]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；
[0134]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.01
‑
2.59mol％的单体基团；
[0135]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于1.00mol％的单体基团；
[0136]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团；
[0137]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中26.87
‑
46.98mol％的单体基团；
[0138]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少6.94mol％的单体基团；
[0139]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.43mol％的单体基团；
[0140]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于9.66mol％的单体基团；
[0141]
(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.07
‑
0.85mol％的单体基团；
[0142]
(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中2.35
‑
6.01mol％的单体基团；
[0143]
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.06
‑
0.86mol％的单体基团；和/或
[0144]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团。
[0145]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0146]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于0.70mol％的单体基团。
[0147]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0148]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.50mol％的单体基团。
[0149]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0150]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.40mol％的单体基团。
[0151]
40.权利要求36
‑
39中任一项的组合物。其中所述寡糖组合物包含：
[0152]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中30.00
‑
40.00mol％的单体基团。
[0153]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0154]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.94
‑
9.25mol％的单体基团。
[0155]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0156]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少9.10mol％的单体基团。
[0157]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0158]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.10mol％的单体基团。
[0159]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0160]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于6.00mol％的单体基团；
[0161]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含：
[0162]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.10mol％的单体基团。
[0163]
在一些实施方案中，单体基团的摩尔百分比是使用全甲基化测定法确定的，其中该全甲基化测定法包括使用气相色谱
‑
质谱(gc
‑
ms)分析，任选地，其中包含组合物的样品通过gc
‑
ms进行分析，同时在20.0分钟内以4℃/min的速度从170℃加热到240℃。
[0164]
在某些方面，本文提供了包含多种寡糖的寡糖组合物，所述寡糖包括式(i)：
[0165][0166]
其中r独立地选自氢以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：
[0167][0168]
其中式(ia)、(ib)、(ic)和(id)中的r独立地如上式(i)中所定义；
[0169]
其中所述组合物通过包括以下的方法制成：
[0170]
(a)形成包含右旋糖制剂与催化剂的反应混合物，所述催化剂包含酸性质子；和
[0171]
(b)通过向所述反应混合物传递足够的热量以将该反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物产生的净水冷凝物相对于在(a)中负载前的右旋糖制剂中总右旋糖的摩尔比在0.35
‑
1.0的范围内，来促进该反应混合物中酸催化的寡糖的形成，其中所述反应混合物保持在0.5
‑
1.5atm范围的压力。
[0172]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：
[0173]
(c)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低。
[0174]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：
[0175]
(d)从所述酸催化剂中分离出至少一部分寡糖。
[0176]
在一些实施方案中，所述酸催化剂是包含酸性质子的固体基质。酸催化剂可以是具有根据表1的一种或多种物理和化学性质的强酸阳离子交换树脂和/或其中催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。在一些实施方案中，所述催化剂具有45
‑
50
重量百分比的标称含水量(nominal moisture content)。
[0177]
在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.001
‑
0.25的量存在。在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.0016
‑
0.022的量存在。
[0178]
在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述右旋糖制剂包含右旋糖单体。在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述右旋糖制剂包含右旋糖一水合物或70ds玉米糖浆。
[0179]
在一些实施方案中，所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少95％。在一些实施方案中，所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少98％。在一些实施方案中，所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的100％。
[0180]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物中不超过1％、2％、3％、5％、7％或10％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。
[0181]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物中不超过1％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。在一些实施方案中，所述寡糖组合物中不超过5％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。在一些实施方案中，与式(i)或式ia、ib、ic和id不同的寡糖组合物的单体包含衍生的或化学改变的(例如降解的)糖单元(例如无水形式)。
[0182]
在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物产生的净水冷凝物相对于在(a)中负载前的右旋糖制剂中总右旋糖的摩尔比在0.40
‑
0.90的范围内。
[0183]
在一些实施方案中，在步骤(b)之前，在合适的条件下将所述反应混合物的温度从室温逐渐升高至该反应混合物的沸点以实现均质性和均匀的热传递。
[0184]
在一些实施方案中，所述反应混合物包含少于1％的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.1％的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含至少90％、95％或99％的右旋糖。
[0185]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp4至约dp8。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp6。
[0186]
在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括通过蒸发从所述反应混合物中除去水。在一些实施方案中，在步骤(c)中，所述水是去离子水(温度约为60
‑
100℃)。在一些实施方案中，在步骤(c)中，在足以避免所述混合物固化的条件下将所述水加入所述反应混合物中。在一些实施方案中，在步骤(d)中，所述分离包括通过过滤除去催化剂。在一些实施方案中，步骤(d)包括在过滤之前将所述反应混合物冷却至低于约85℃。
[0187]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用去离子水将(d)的寡糖组合物稀释至约5
‑
65重量百分比的浓度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(e)至(g)中的一个或多个(例如，两个或多个，或三个)：
[0188]
(e)使稀释的组合物通过阳离子交换树脂；
[0189]
(f)使稀释的组合物通过阴离子交换树脂；和
[0190]
(g)使稀释的组合物通过脱色聚合物树脂；
[0191]
其中(e)、(f)和(g)中的每一个可以以任何顺序进行一次或多次。
[0192]
在一些实施方案中，所述组合物包含的总水含量低于室温储存时微生物生长所必需的水平。在一些实施方案中，所述组合物包含的总水含量在24
‑
33重量百分比范围内。
[0193]
在一些实施方案中，所述组合物中的寡糖具有在852
‑
1475范围内的mww(g/mol)。在一些实施方案中，所述组合物中的寡糖具有在855
‑
1100范围内的mww(g/mol)。在一些实施方案中，所述组合物中的寡糖具有在612
‑
912范围内的mww(g/mol)。在一些实施方案中，所述组合物中的寡糖具有在612
‑
710范围内的mww(g/mol)。
[0194]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有在2.5
‑
7.5的范围内的ph。在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有在2.5
‑
5.0的范围内的ph。
[0195]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约75至约95重量百分比(干基)的具有两个或更多个单体(dp2 )的寡聚物。在一些实施方案中，所述组合物包含约80至约90重量百分比(干基)的具有两个或更多个单体(dp2 )的聚合度的寡聚物。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于25％、少于15％或少于3％或少于1％的单体。
[0196]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于3％w/w的杂质。在一些实施方案中，所述寡糖组合物在人体中基本上是不可吸收的。在一些实施方案中，人体对所述寡糖组合物的消化作用很小。
[0197]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含16％至24％的右旋糖当量(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含13％至27％的右旋糖当量(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含至少70％、至少80％、至少90％的总膳食纤维(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含65％至95％的总膳食纤维(干基)。
[0198]
在一些实施方案中，所述组合物不含可检测量的可溶性膳食纤维沉淀物(sdfp)、不溶性膳食纤维(idf)和/或高分子量膳食纤维(hmwdf)。
[0199]
在某些方面，本文提供了在人类受试者中降低氨水平的方法。在一些实施方案中，在人类受试者中降低氨水平的方法包括向所述人类受试者施用有效量的本文所述的寡糖组合物。
[0200]
在一些实施方案中，所述氨水平是人体中的全身氨水平。在一些实施方案中，与治疗前的氨水平相比，氨水平降低了至少20％。
[0201]
在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有尿素循环障碍。在一些实施方案中，所述受试者是儿童人群。
[0202]
在某些方面，本文提供了在人类受试者中治疗尿素循环障碍(ucd)的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的寡糖组合物。
[0203]
在一些实施方案中，所述受试者是儿童人群。在一些实施方案中，所述人类受试者至少2岁。在一些实施方案中，所述人类受试者至少2个月大。
[0204]
在一些实施方案中，所述人类受试者患有肝性脑病(he)。
[0205]
在某些方面，文提供了治疗患有或已经诊断为患有肝硬化的人类受试者的方法，其包括向所述人类受试者施用本文所述的寡糖组合物。
[0206]
在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有失代偿性肝硬化。在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有显性肝性脑病(ohe)。在一些实施方案中，所述受试者已经或正在接受乳果糖和/或利福昔明(xifaxin)治疗。
[0207]
在某些方面，本文提供了制备包含多种寡糖的寡糖组合物的方法，该方法包括：
[0208]
(a)在搅拌条件下，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃至145℃范围内的温度。
[0209]
(b)形成包含右旋糖制剂(其包含右旋糖单体)与包含酸性质子的催化剂的反应混合物，其中酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.001
‑
0.25的范围内；以及
[0210]
(c)通过向所述反应混合物传递足够的热量以将该反应混合物保持在其沸点直到所述反应混合物中右旋糖单体的重量百分比小于30％来促进该反应混合物中酸催化的寡糖的形成，其中所述反应混合物保持在0.5
‑
1.5atm范围的压力。
[0211]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：
[0212]
(d)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低；和
[0213]
(e)从酸催化剂中分离寡糖。
[0214]
在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.0016
‑
0.022的量存在。
[0215]
在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物中右旋糖单体的重量百分比小于25％(例如小于20％、小于15％、小于10％)。在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物中右旋糖单体的重量百分比在13
‑
18％的范围内。
[0216]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物通过以下方法生产，该方法包括：(a)形成包含右旋糖制剂与催化剂的反应混合物，所述催化剂包含酸性质子；和(b)通过向所述反应混合物传递足够的热量以将该反应混合物保持在其沸点直到所述反应混合物中右旋糖单体的重量百分比小于30％来促进该反应混合物中酸催化的寡糖的形成，其中所述反应混合物保持在0.5
‑
1.5atm范围的压力。
[0217]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含＜10％的山梨糖醇，例如，约10％、约8％、约6％、约4％、约2％、约1％的山梨醇或约0.1％或更少的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述反应混合物包含>90％的葡萄糖，例如约95％、约99％或约100％的葡萄糖。在一些实施方案中，所述反应混合物包含＜10％的山梨糖醇和大于90％的葡萄糖，例如＜1％的山梨糖醇和大于99％的葡萄糖。
[0218]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含＜10％的山梨糖醇，例如，约10％、约8％、约6％、约4％、约2％、约1％的山梨糖醇或约0.1％或更少的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含<1％的山梨糖醇，例如，约0.9％、约0.5％或约0.1％的山梨糖醇。在某些实施方案中，所述寡糖组合物包含<0.1％的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含>90％的葡萄糖，例如，约95％、约99％或约100％的葡萄糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含＜10％的山梨糖醇和大于90％的葡萄糖，例如＜1％的山梨糖醇和大于99％的葡萄糖。在一些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在5
‑
6的范围内。在其他实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在4
‑
9的范围内。
[0219]
在一些实施方案中，所述右旋糖制剂包含一水右旋糖或玉米糖浆，例如70ds玉米糖浆。在一些实施方案中，加热右旋糖制剂包括熔化右旋糖制剂和/或在以实现均质性和均匀的热传递的合适的条件下加热右旋糖制剂。
[0220]
在一些实施方案中，所述催化剂是具有根据下表的物理和化学性质的强酸阳离子交换树脂：
[0221]
表1：强酸阳离子交换树脂性质的非限制性实例
[0222][0223]
在一些实施方案中，所述催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。在一些实施方案中，所述催化剂具有45
‑
50重量百分比的标称含水量。
[0224]
在一些实施方案中，通过在合适的条件下将温度逐渐升高至约130℃以实现均质性和均匀的热传递来制备寡糖组合物。在一些实施方案中，通过蒸发从反应混合物中除去水。在一些实施方案中，将反应混合物保持在93
‑
94重量百分比的溶解固体。
[0225]
在一些实施方案中，所述水是去离子水。在一些实施方案中，所述水具有约60
‑
100℃的温度。在一些实施方案中，在足以避免所述混合物固化的条件下将所述水加入所述反应混合物中。在一些实施方案中，分离包括通过过滤除去催化剂。在一些实施方案中，在过滤之前将所述反应混合物冷却至低于约85℃。
[0226]
在一些实施方案中，制备寡糖组合物的方法进一步包括：(f)用例如去离子水将(e)的寡糖组合物稀释至约5
‑
65重量百分比的浓度，以及使稀释的组合物通过阳离子交换树脂；(g)使稀释的组合物通过阴离子交换树脂；和(h)使稀释的组合物通过脱色聚合物树脂。在一些实施方案中，(f)、(g)和(h)中的每一个可以以任何顺序进行一次或多次。
[0227]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物进一步包含低于室温储存时微生物生长所需水平的水。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含24
‑
33重量百分比范围内的水。控制水分水平以解决微生物生长的方法描述于ergun，r.等人，“moisture and shelf life in sugar confections,critical reviews in food science and nutrition”,2010,50：2,162
‑
192；和niroomand,f.等人，“fate of bacterial pathogens and indicator organisms in liquid sweeteners”journal of food protection，卷61，第3部分，1998，第295
‑
299页；其各内容都整体并入。
[0228]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含具有在852
‑
1475范围内的mww(重均分子量)(g/mol)的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含具有在612
‑
912范围内的mwn(数均分子量)(g/mol)的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有在3.0
‑
7.5的范围内的ph。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含83
‑
86重量百分比范围内的具有两个或更多个单体(dp2 )的寡聚物。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含80
‑
99重量百分比范围
内的具有两个或更多个单体(dp2 )的寡聚物。在一些实施方案中，所述寡糖组合物基本上不可被人体吸收(例如，所述寡糖组合物基本上不被胃或肠吸收)。
[0229]
一方面，本文提供了包含式(i)的寡糖的寡糖组合物：
[0230][0231]
其中每个r独立地选自氢、以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：
[0232][0233]
其中每个r独立地定义如上，并且其中：
[0234]
i)所述寡糖的平均支化度(db)在0.1到0.4之间；
[0235]
ii)45％至55％的所述寡糖具有至少为3的聚合度(dp)和小于或等于10个聚糖单元；
[0236]
iii)所述寡糖的平均聚合度(dp)(平均dp)在约5到8之间；
[0237]
iv)存在于所述组合物的寡糖中的α
‑
与β
‑
糖苷键的比例为约1：1至约1.5：1或1：1至约3：1；
[0238]
v)所述寡糖组合物包含20mol％至60mol％的1,6糖苷键；
[0239]
vi)所述寡糖组合物包含5mol％至25mol％的1,2；1,3；和1,4糖苷键中的至少一种、两种或三种；
[0240]
vii)所述寡糖组合物在23℃时在水中的最终溶解度极限为至少约70brix；和
[0241]
viii)所述寡糖组合物具有含量为至少70％的膳食纤维。
[0242]
在另一方面，本公开内容的特征为在人类受试者中降低氨水平的方法，其包括：向所述人类受试者施用如本文所述的寡糖组合物。
[0243]
在一些实施方案中，所述氨水平是人受试者中的全身氨水平。在一些实施方案中，所述氨水平的降低在血液中测量。在一些实施方案中，所述氨水平的降低包括脑脊液中氨水平的降低。在一些实施方案中，所述氨水平(例如，全身性氨水平或血氨水平)的降低是相对于施用所述寡糖组合物前在人类受试者中的氨水平至少约5％、10％、15％或至少约20％的降低。在一些实施方案中，所述氨水平(例如，全身性氨水平)的降低是相对于在健康人类受试者中的氨水平至少约5％、10％、15％或至少约20％的降低。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述氨水平(例如，全身性氨水平或血氨水平)的降低是相对于在人类受试者群体(例如，健康人类受试者群体)中的平均氨水平至少约5％、10％、15％或至少约20％的降低。在一些实施方案中，所述氨水平的降低是源于微生物的氨水平的降低。在一些实施方案中，所述氨水平(例如源自微生物的氨水平(例如肠道中))的降低是相对于施用所述寡糖组合物前在人类受试者中的氨水平至少约10％、20％或至少约30％的降低。在一些实施方
案中，所述氨水平(例如源自微生物的氨水平(例如肠道中))的降低是相对于健康的人类受试者中的氨水平至少约10％、20％或至少约30％的降低。在一些实施方案中，所述氨水平(例如源自微生物的氨水平(例如肠道中))的降低是相对于在人类受试者群体(例如，健康人类受试者群体)中的氨水平至少约10％、20％或至少约30％的降低。
[0244]
在另一方面，本公开的特征在于在受试者(例如人类受试者)中治疗尿素循环障碍(ucd)(例如，氨甲酰磷酸合成酶i(cpsi)缺乏、鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏、精氨基琥珀酸合成酶(ass)缺乏、精氨基琥珀酸裂解酶(asl)缺乏、n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏、精氨酸酶缺乏、鸟氨酸转位酶缺乏(hhh)或希特林(citrin)缺乏症(cit ii))的方法，其包括：向所述受试者施用本文所述的寡糖组合物。在一些实施方案中，ucd不包括n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏。
[0245]
在一些实施方案中，向患有ucd的受试者施用寡糖组合物降低了高氨血症危机(hyperammonemic crisis)的风险、严重程度和/或频率(例如，与未施用所述寡糖组合物的受试者(包括同一受试者)相比))。在一些实施方案中，所述受试者处于低蛋白质或其他补充饮食。在一些实施方案中，所述受试者同时接受苯基丁酸甘油酯(例如ravicti)(或类似的氮清除剂治疗)治疗。在一些实施方案中，所述受试者处于低蛋白或其他补充饮食，并同时接受苯基丁酸甘油酯(例如ravicti)(或类似的氮清除剂治疗)治疗。在一些实施方案中，所述受试者对用氮清除剂(例如，苯基丁酸甘油酯)的治疗没有反应。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿、儿童或年轻成人。在一些实施方案中，所述受试者尚未接受肝移植。在一些实施方案中，所述受试者患有尿素循环障碍(ucd)(例如，氨甲酰磷酸合成酶i(cpsi)缺乏、鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏、精氨基琥珀酸合成酶(ass)缺乏、精氨基琥珀酸裂解酶(asl)缺乏、n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏或精氨酸酶缺乏、鸟氨酸转位酶缺乏(hhh)或希特林(cit ii)缺乏)。在一些实施方案中，通过施用本文所述的寡糖组合物至少1年的持续时间，例如1年、5年、10年、20年、50年或终身来治疗受试者中的ucd，例如慢性ucd。在一些实施方案中，所述寡糖组合物可按实施例3和4所述使用。
[0246]
在一些实施方案中，人类受试者至少2岁。在一些实施方案中，所述人类受试者至少2个月大。
[0247]
在一些实施方案中，所述人类受试者被施以氮清除剂疗法。在一些实施方案中，所述人类受试者被施以限制性饮食(例如，对蛋白质摄入的饮食限制)。在一些实施方案中，施用寡糖可以避免对蛋白质摄入的饮食限制(例如，氨基酸摄入的数量或量增加)。在一些实施方案中，用氮清除剂疗法对受试者的控制较差(例如，根据例如以下各项确定：i)受试者循环中氨的平均水平；和/或ii)受试者经历的氨危机次数)。在一些实施方案中，所述受试者表现出的全身性氨水平持续高于正常上限0.5倍。
[0248]
在一些实施方案中，以下一项或两项降低：i)一年内发生氨危机的次数(例如，减少至少1、2或至少3次危机)，ii)氨危机引起的并发症的严重性，所述并发症包括神经发育迟缓和/或认知功能减退(例如，与未接受所述寡糖组合物的合适对照组相比)。在一些实施方案中，氨危机之间的时间间隔增加，例如，至少增加了15％、30％、60％、100％或200％(例如，与未接受所述寡糖组合物的合适对照组相比)。
[0249]
在另一方面，本公开的特征在于用于治疗肝性脑病(he)(例如显性(overt)he(ohe)或轻微型(minimal)he(mhe)的方法。
[0250]
在一些实施方案中，提供了用于治疗患有或已经被诊断出患有肝硬化的人类受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述人类受试者施用本文所公开的寡糖组合物。在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有失代偿性肝硬化。在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有显性肝性脑病(ohe)。在一些实施方案中，所述受试者已经或正在接受乳果糖和/或利福昔明(xifaxin)治疗。在一些实施方案中，基于一种或多种神经精神病学测试和/或晚期肝病的诊断，已经确定(例如，由医师)所述受试者受益于该治疗或成为该治疗的候选者。
[0251]
在一些实施方案中，向患有he的受试者施用寡糖组合物降低了he的风险和/或复发(例如，he的严重性和/或频率)，例如，与未施用所述寡糖的受试者(包括同一受试者)相比。在一些实施方案中，所述受试者同时接受乳果糖治疗。在一些实施方案中，所述受试者同时接受利福昔明治疗。在一些实施方案中，在施用所述寡糖组合物之前，已经用乳果糖对所述受试者进行了治疗。在一些实施方案中，在施用所述寡糖组合物之前，已经用利福昔明对所述受试者进行治疗。在一些实施方案中，在施用所述寡糖组合物之前，已经用乳果糖和利福昔明所述受试者进行治疗。在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断出患有显性肝性脑病(ohe)。在一些实施方案中，所述受试者(尚未)接受过he治疗(例如在施用寡糖组合物之前)。在一些实施方案中，所述受试者患有轻微型肝性脑病(mhe)，而在一些实施方案中，所述受试者在很大程度上没有症状(例如，针对ohe症状)。
[0252]
在一些实施方案中，患有高氨血症的受试者患有肝性脑病(he)。在一些实施方案中，高氨血症由酒精和/或酒精性肝硬化、自身免疫性肝炎、慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎、脂肪肝、丙型肝炎、丙型肝炎和酒精、铁超载和脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和乙型肝炎或原发性胆汁性肝硬化引起或与之至少部分相关。在一些实施方案中，患有高氨血症的受试者先前已经接受过乳果糖或利福昔明的治疗或施用。在一些实施方案中，所述受试者是成年人(例如20
‑
64岁)或老年人(例如65岁及以上)。在一些实施方案中，通过施用本文所述的寡糖组合物至少1年的持续时间(例如1年，5年，10年，20年，50年或终身)治疗受试者中的he(例如，慢性he)。在一些实施方案中，所述he是显性肝性脑病(ohe)。在一些实施方案中，所述he是轻微型肝性脑病(mhe)。在一些实施方案中，可以如实施例2中所述使用所述寡糖组合物。
[0253]
在另一方面，本公开内容的特征在于生产寡糖组合物的方法，所述寡糖组合物包含人类最低限度可消化的多种寡糖。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)在搅拌条件下，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃至135℃范围内的温度；(b)装载所述右旋糖制剂与包含酸性质子的固体催化剂，其量使得酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.016
‑
0.022的范围内，从而形成反应混合物；以及(c)在促进酸催化的寡糖形成的条件下，将反应混合物保持在大气压下、120℃至135℃的温度范围内直到组合物中右旋糖单体的重量百分比在14
‑
17的范围内；(d)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低；以及任选地(e)从酸催化剂中分离寡糖；从而获得寡糖组合物。
[0254]
在一些实施方案中，本文提供了寡糖组合物，其包含多种在人体中可被最低限度消化的寡糖，并且所述寡糖包括式(i)：
[0255][0256]
其中每个r独立地选自氢，以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：
[0257][0258]
其中每个r独立地如上所定义。
[0259]
在其他实施方案中，所述寡糖组合物通过以下方法生产，该方法包括：在例如搅拌条件下，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃至135℃范围内的温度；(b)装载所述右旋糖制剂与包含酸性质子的固体催化剂，以例如使酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.016
‑
0.022的范围内的量，从而形成反应混合物；以及(c)在促进酸催化的寡糖形成的条件下，将反应混合物保持在大气压下、120℃至135℃的温度范围内直到组合物中右旋糖单体的重量百分比在14
‑
17的范围内；(d)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低；以及任选地(e)从酸催化剂中分离寡糖，从而获得寡糖组合物。
[0260]
在其他实施方案中，所述方法包括：(a)在搅拌条件下，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃至135℃范围内的温度；(b)装载所述右旋糖制剂与包含酸性质子的固体催化剂，其量使得酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.016
‑
0.022的范围内，从而形成反应混合物；以及(c)在促进酸催化的寡糖形成的条件下，将反应混合物保持在其沸点、在0.5
‑
1.5atm的压力范围内直到组合物中右旋糖单体的重量百分比在14
‑
17的范围内；(d)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低；以及任选地(e)从酸催化剂中分离寡糖；从而获得寡糖组合物。
附图说明
[0261]
图1a
‑
1b提供了非限制性的图，其显示了在离体氨降低测定中的氨降低结果(归一化为水对照)，其中粪便浆液与不同的寡糖组合物一起孵育。图1a是展示基于寡糖组合物在调节氨水平上的有效性的寡糖组合物的等级的图，归一化为阴性对照(水)。箭头指示阴性对照(水)和所选的寡糖组合物。图1b显示归一化为阴性对照(水)的氨水平的条形图。
[0262]
图2提供了响应于消耗寡糖组合物的患者耐受性的图。图2显示了在不同摄入剂量水平报告腹泻的患者数量(每组12名患者之中：麦芽糖糊精(安慰剂)、所选的寡糖组合物和阳性对照纤维)。
[0263]
图3a
‑
3b提供了显示离体氨降低测定中氨降低(归一化为水对照)的图，其中将来自患者的粪便样品与所选的寡糖组合物一起孵育。图3a是显示来自尿素循环障碍(ucd)患者的样品中通过所选寡糖组合物的氨降低的图。图3b是显示来自肝
[0264]
受损患者的样品中通过所选寡糖组合物的氨降低的图。
[0265]
图4描绘了未修饰的寡糖组合物和已经通过胺柱快速色谱法脱单体的寡糖组合物的叠加sec
‑
hplc色谱图，如实施例9中所述。
[0266]
图5描绘了用于实施例13的标准聚糖的sec
‑
hplc色谱图的叠加图。
具体实施方式
[0267]
本公开内容的方面涉及可有效降低受试者，例如人类受试者中氨水平的寡糖组合物。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡糖组合物可用于治疗患有与高氨血症有关的障碍的受试者，例如尿素循环障碍(ucd)。在一些实施方案中，本文公开的寡糖组合物可用于治疗患有与高氨血症有关的另一种障碍的受试者，例如，肝性脑病(he，例如轻微型he(mhe)或显性he(ohe))。
[0268]
本公开内容的一些方面基于进行广泛筛选工作的结果，该工作用于鉴定能够在受试者中调节(例如，降低)氨水平的寡糖组合物。测定了数百种独特的寡糖组合物对氨水平的影响。在筛选中测试的寡糖组合物使用不同的糖单体，例如右旋糖单体、木糖单体等，并在涉及不同反应温度的条件下、在不同的时间段内、和/或在不同的催化剂条件下产生。
[0269]
通过该筛选工作，所选的寡糖组合物被鉴定为氨水平的高效调节剂，其在降低氨水平方面比在筛选中测试的比较物组合物显著更有效(实施例1)。在进一步的研究中，在健康人的成年人中的安慰剂对照研究中还发现所述寡糖组合物是安全的并且具有良好的耐受性(实施例2)。因此，在一些实施方案中，该寡糖组合物特别适用于治疗患有与高氨血症有关的障碍，例如尿素循环障碍和肝性脑病的受试者。
[0270]
下面提供了本公开的其他方面，包括定义的术语的描述。
[0271]
i.定义
[0272]
搅拌条件：如本文所用，术语“搅拌条件”是指促进或维持混合物(例如，包含右旋糖制剂的反应混合物)关于固体(例如固体催化剂)分散的基本均匀或均质状态、热传递均匀性或其他类似参数的条件。搅拌条件通常包括搅拌、摇动和/或混合反应混合物。在一些实施方案中，搅拌条件可以包括向溶液中添加气体或其他液体。在一些实施方案中，搅拌条件用于维持催化剂，例如酸催化剂的基本均匀或均质的分布。在一些实施方案中，在酸催化剂的存在和以实现均质性和均匀的热传递合适的条件下加热右旋糖制剂，从而合成寡糖组合物。
[0273]
约：如本文所用，术语“近似地”或“约”，应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于陈述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似地”或“约”是指以任何方向(大于或小于)落入所陈述的参考值的15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少中的一系列值，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。
[0274]
右旋糖单体：如本文所用，术语“右旋糖单体”是指葡萄糖单体的d
‑
异构体，称为
d
‑
葡萄糖。
[0275]
右旋糖制剂：如本文所用，术语“右旋糖制剂”是指包含两种或更多种糖单元的制剂，该糖单元包括右旋糖。在一些实施方案中，包括右旋糖的糖单元是右旋糖单体。在一些实施方案中，右旋糖制剂包含右旋糖一水合物。在一些实施方案中，所述右旋糖制剂包含右旋糖一水合物。在一些实施方案中，右旋糖制剂包含70ds玉米糖浆。在一些实施方案中，右
旋糖制剂包含淀粉水解物，例如玉米糖浆(例如，还原糖含量大于20％右旋糖当量(de)的玉米糖浆)或麦芽糖糊精(例如，还原糖含量少于20％de的麦芽糖糊精)。在一些实施方案中，右旋糖制剂可以是固体，例如粉末或糖浆，例如，包含大于70％固体的液体。在一些实施方案中，右旋糖单体符合良好生产规范(gmp)条件。
[0276]
有效量：如本文所用，术语“有效量”是指，例如在受试者或患者中引起生物反应所必需和充分的寡糖组合物的施用量或浓度。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如，增加或减少)在受试者中的酶的活性或水平。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如，增加或减少)代谢物的处理。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如，增加或减少)至少一种微生物的浓度或数量。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如，降低)在受试者中与高氨血症有关的疾病的症状(例如症状的严重程度或数量)。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够在受试者中治疗与高氨血症有关的疾病。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如减少)在受试者中与尿素循环障碍有关的症状(例如症状的严重性或数量)。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够在受试者中治疗尿素循环障碍。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节(例如减轻)在受试者中与肝性脑病有关的症状(例如，症状严重程度或数量)。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够在受试者中治疗肝性脑病。
[0277]
肝性脑病(he)：如本文所用，术语“肝性脑病(he)”是指包括多发性不良神经系统症状的一类疾病，其由于晚期肝病或其他当肝不能去除血液中例如氨的有毒物质的疾病而发生。在一些实施方案中，he是由肝硬化引起或与肝硬化一起出现的。在一些实施方案中，患有肝性脑病的受试者的氨水平高于正常健康的受试者。在一些实施方案中，患有肝性脑病的受试者可能患有轻度he、重度he或显性he。he的护理治疗标准包括乳果糖，乳糖醇和抗生素(例如利福昔明或新霉素)。治疗方法还包括饮食调整和益生菌。可以通过上述症状的缓解(例如，血清氨水平降低)，未来he发作的发生率降低或在具有he风险的受试者中通过减少he初始发作的发生来评估治疗效果。在一些实施方案中，具有高氨血症或高氨峰值持续时间延长的患者，尤其是肝损害患者(例如，肝硬化患者，例如老年患者)，可能会发展为与深远(profound)和慢性神经系统发病率相关的肝性脑病(he)，其包括严重的智力残疾，影响日常活动的执行功能缺陷，例如意识模糊、健忘、焦虑或兴奋、性格或行为突然改变、睡眠方式变化、定向障碍、甜或霉味的呼吸、言语不清和/或难以控制运动机能。
[0278]
高氨血症：如本文所用，术语“高氨血症”是指受试者(例如人受试者)中与氨水平升高相关的病症。通常，患有高氨血症的受试者在循环中(例如血液中)的氨水平升高。在一些实施方案中，高氨血症的持续时间和严重程度与脑损伤呈正相关。在一些实施方案中，经历高氨血症或高氨峰值持续时间延长的患者，尤其是儿童患者，可能会发展深远和慢性神经系统疾病，其包括发育迟缓、严重智障、影响日常活动的执行功能缺陷、脑瘫和癫痫发作。
[0279]
寡糖：如本文所用，术语“寡糖”(在某些情况下可以与术语“聚糖”互换使用)是指包含至少两个经由糖苷键(聚合度(dp)至少为2(例如，dp2 ))连接在一起的单糖(例如，右旋糖单体)的糖分子。在一些实施方案中，寡糖包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个通过糖苷键连接的单糖亚基。在一些实施方案中，10
‑
25、20
‑
50、40
‑
80、75
‑
100、100
‑
150或至少100个单糖范围内的寡糖通过糖苷键连接。在一些实施方案中，寡糖包含至少一个1,2；1,3；1,4；和/或1,6糖苷键。寡糖可
以是直链或支链的。寡糖可具有一个或多个呈α
‑
构型的糖苷键和/或一个或多个呈β
‑
构型的糖苷键。
[0280]
药物组合物：如本文所用，“药物组合物”是指在减轻、治疗或预防疾病中具有药理活性或其他直接作用的组合物，和/或其最终剂型或制剂，并且用于人类。药物组合物或药物制剂通常是在良好生产规范(gmp)条件下生产的。药物组合物或制剂可以是无菌的或非无菌的。如果是非无菌的，则此类药物组合物或制剂通常符合美国药典(usp)或欧洲药典(ep)中所述的非无菌药物产品的微生物学指标和标准。本文所述的任何寡糖组合物都可以配制成药物组合物。
[0281]
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人类受试者或患者。受试者可以包括新生儿(早产儿、足月新生儿)、不超过一岁的婴儿、幼儿(例如，1岁至12岁)、青少年(例如，13
‑
19岁)、成人(例如，20
‑
64岁)和老年人(65岁及以上)。在一些实施方案中，受试者为儿童人群或其子人群，其包括新生儿(出生至1个月)、婴儿(1个月至2岁)、发育中的儿童(2至12岁)和青少年(12至16岁)。
[0282]
治疗方法和治疗：如本文所用，术语“治疗”和“治疗方法”是指将组合物施用于受试者(例如，患有不良病症、障碍或疾病的有症状受试者)以影响症状严重程度和/或频率的降低、消除症状和/或其根本原因，和/或促进损害的改善或补救，和/或在易患特定的不良病症、障碍或疾病，或怀疑患有该病症、障碍或疾病或有发展这种病症、障碍或疾病的风险的无症状受试者人中预防所述不良病症、障碍或疾病。
[0283]
尿素循环障碍：如本文所用，术语“尿素循环障碍”是指由突变引起的一组遗传疾病，其导致尿素循环中一种或多种酶的缺乏。在一些实施方案中，这样的酶通常负责从血流中去除氨。例如，尿素循环通常包括一系列将氮从周围(肌肉)和肠内(蛋白质摄入)源转化为尿素进行排泄的反应。在一些实施方案中，参与该代谢途径的酶的遗传缺陷导致氨解毒/精氨酸合成的各种功能失常。在一些实施方案中，尿素循环中的缺陷会导致氨水平升高的代谢状态(高氨血症)，从而导致脑水肿、神经系统损伤、呼吸性碱中毒，昏迷甚至死亡。疾病的严重程度因酶/转运蛋白的缺乏水平、尿素循环障碍(ucd)亚型和其他因素而显著不同。在一些实施方案中，ucd的发作有两种类型：新生儿和晚期发作。超过69％的病例是迟发的，这意味着它们发生在新生儿期之后。超过50％的病例发生在美国0
‑
18岁的儿童人群中。
[0284]
ii.寡糖组合物
[0285]
本文提供了寡糖组合物(例如，聚糖聚合物)，及其用于在人受试者中调节氨水平和用于治疗尿素循环障碍的方法。
[0286]
在一个方面，本文提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖(例如，可被人类最低限度消化的多种寡糖)，所述寡糖包括式(i)：
[0287][0288]
其中每个r独立地选自氢以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：
[0289][0290]
其中每个r独立地如上所定义。
[0291]
在一些实施方案中，人体对寡糖的消化作用很小(例如，不会被人体细胞分解或催化，也不会被人体酶的酶促功能分解或催化)。
[0292]
寡糖组合物的产生
[0293]
包含寡糖组合物的制剂可以使用非酶催化剂来制备，例如，如wo 2019/090181，methods of producing glycan polymers所述。在某些情况下，所述寡糖组合物可以使用wo 2012/118767，“polymeric acid catalysts and uses thereof”中描述的聚合催化剂或通过其他合适的方法，例如描述于wo 2016/007778，“oligosaccharide compositions and methods for producing thereof”的方法生成，其中的每一个均通过引用整体并入本文。可以使用其他酸催化剂(例如固体催化剂)。可以在wo 2014/031956，“polymeric and solid
‑
supported catalysts,and methods of digesting cellulosic materials using such catalysts”中找到制备本文所述的聚合物和固体负载的催化剂的方法，其通过引用整体并入本文。
[0294]
在一些实施方案中，此类寡糖组合物是通过以下方法生产的，该方法首先涉及将包含右旋糖(例如，右旋糖单体或单糖)的右旋糖制剂加热至约120℃至约135℃的温度，例如，120℃至130℃、125℃至130℃、125℃至135℃、128℃至132℃、130℃至133℃、130℃至135℃或132℃至135℃。在一些实施方案中，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃、121℃、122℃、123℃、124℃、125℃、126℃、127℃、128℃、129℃、130℃、131℃、132℃、133℃、134℃或135℃的温度。加热可以在搅拌条件下进行。
[0295]
将包含酸性质子的催化剂添加到右旋糖制剂中(例如，在加热期间或之后)以促进右旋糖单元(例如右旋糖单体)之间形成一个或多个糖苷键，从而产生寡糖组合物。合适的催化剂包含酸性单体，任选地，其中每种酸性单体具有至少一种布朗斯特
‑
劳里酸(bronsted
‑
lowry acid)。通常，催化剂的加入量应使得酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.001
‑
0.25，例如，0.001
‑
0.1、0.01
‑
0.1、0.001
‑
0.08、0.01
‑
0.05、0.016
‑
0.022、0.05
‑
0.1或0.05
‑
0.2的范围内。在一些实施方案中，所述催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。在一些实施方案中，所述催化剂具有45
‑
50重量百分比的标称含水量。
[0296]
在一些实施方案中，所述催化剂可以是碱性或酸性催化剂、催化树脂或金属催化剂。在一些实施方案中，所述催化剂是有机酸、无机酸或酸酐。在一些实施方案中，所述催化剂是均相酸催化剂。在一些实施方案中，所述催化剂是非均相酸催化剂。在一些实施方案中，所述催化剂不是酶。
[0297]
可用于生产如本文所述的寡糖的酸催化剂的非限制性实例包括：己二酸、乙酸、柠
檬酸、富马酸、葡糖酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、对苯二甲酸、盐酸、硫酸、亚硫酸、硫代硫酸、连二硫酸、焦硫酸、硒酸、亚硒酸、硝酸、磷酸、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、多磷酸、连二磷酸、硼酸、高氯酸、次氯酸、氢溴酸。在一些实施方案中，所述酸催化剂是无机酸的酸性碱金属或碱土金属盐。
[0298]
在一些实施方案中，用于制备寡糖组合物的催化剂是固体酸性催化剂，例如，固体负载或树脂结合的酸性催化剂。在一些实施方案中，用于制备聚糖聚合物制剂的催化剂是固体酸催化剂(例如，粘土矿物(例如，蒙脱石、膨润土、高岭石或阳离子交换的沸石和粘土，和/或其硫酸化或酸化形式)、沸石、氧化铝、硅铝磷酸盐、杂多金属氧酸盐、金属氧化物和硫化物(ala和zns)、金属盐(mgso4)、混合氧化物(sio2
‑
al2o3)、硫酸盐促进的金属氧化物和混合氧化物(so4(2
‑
)/zro2、so4(2
‑
)/tio2和so4(2
‑
)/fe2o3)、固定酸(适合的载体如多孔氧化物、石墨、金属盐、经过处理或与液态酸(如h2so4/sio2、sbf5/sio2
‑
al2o3、alcl3/cuso4)组合、阳离子交换树脂、全氟聚合物硫酸(nafion
‑
h)和杂聚酸(12
‑
钨磷酸)、杂多金属氧酸盐、磺化碳、硫酸化碳、硫酸灰分。在某些实施方案中，所述催化剂是质子化形式的离子交换树脂(例如，amberlite fpc11 na、amberlite fpc14 na、dowex 88、dowex 88h、dowex 88mb、dowex 88mb h、dowex fpc16ups h、dowex fpc16ups na、dowex fpc23ups h、dowex mac
‑
3、dowex monosphere 88、dowex monosphere 88h、dowex monosphere 99ca/310、dowex monosphere 99ca/320、dowex monosphere 99k/310、dowex monosphere 99k/320、dowex monosphere 99k/350、dowextmpsr
‑
2、dowextmg
‑
26h、amberjet 1600h、amberjet 2000h、amberlite irn150、amberlite irn160、amberlite irn170、amberlite irn217、amberlite irn317、amberlite irn360、amberlite irn77、amberlite irn97 h、amberlite irn99 h、amberlite irn9652、amberliteirn9882、amberlite irn9687、ambersep 252h、dowex monosphere 1400pc h、dowex monosphere 650c h、amberlite 200c na、amberlite ir120 h、amberlite ir120 na、amberlite irc83、amberlite mb20、dowex marathon 1200h、dowex marathon 1200na、dowex marathon 1300h、dowex marathon 8300、dowex marathon c、dowex marathon c
‑
10、dowex marathon mr
‑
3、dowex marathon msc、dowex marathon msc h、dowex
tm hcr
‑
s/s、imac
tm hp333、amberjet up1400、amberjet up6040、amberjet up6150、dowex monosphere mr
‑
3upw、dowex monosphere mr
‑
450upw、amberlite cg50 type 1、amberlite cobalamion、amberlite fpc3500、amberlite irp476、amberlite irp64、amberlite irp69、amberlite irp88、dowex 50wx2(h )、dowex 50wx4(h )、dowex 50wx8(h )、amberlite bd10、amberlite irc84spi h、amberlyst 123、amberlyst 125、amberlyst 131、amberlyst 15、amberlyst 16、amberlyst 19、amberlyst 33、amberlyst 35、amberlyst 36、amberlyst 39、amberlyst 40、amberlyst 45、amberlyst bd20、amberlyst ch28、ambersep bd19、ambersep 200h)。
[0299]
在一些实施方案中，所述催化剂选自聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯](poly[styrene
‑
co
‑4‑
vinylbenzenesulfonic acid
‑
co
‑3‑
methyl
‑1‑
(4
‑
vinylbenzyl)
‑
3h
‑
imidazol
‑1‑
ium chloride
‑
co
‑
divinylbenzene])；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基
苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硝酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
乙基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
乙基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
乙基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
乙基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硝酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓碘化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓溴化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
苯并咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
苯并咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
苯并咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
苯并咪唑
‑1‑
鎓甲酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
硝酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
氯化物
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
溴化物
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
碘化物
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
硫酸氢盐
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓
‑
乙酸盐
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
甲基
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
甲基
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
甲基
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
甲基
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
鎓甲酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三苯基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三苯基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三苯基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
哌啶
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
哌啶
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑1‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
哌啶
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
氧化物
‑
共
‑‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三乙基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
铵氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三乙基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
铵硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
三乙基
‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
铵乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑4‑
硼基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吡啶鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苯基)甲基膦酸
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苯基)甲基膦酸
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苯基)甲基膦酸
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硝酸盐
‑
共
‑1‑
(4
‑
乙烯基苯基)甲基膦酸
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基氯化物
‑
共
‑1‑
甲基
‑2‑
乙烯基
‑
吡啶鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基氯化物
‑
共
‑1‑
甲基
‑2‑
乙烯基
‑
吡啶鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基氯化物
‑
共
‑1‑
甲基
‑2‑
乙烯基
‑
吡啶鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑4‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
吗啉
‑4‑
氧化物
‑
共
‑‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯基膦酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯基膦酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯基膦酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
羧甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
羧甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑3‑
羧甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑5‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
间苯二甲酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑5‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
间苯二甲酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑5‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
间苯二甲酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
乙酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
乙酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚[苯乙烯
‑
共
‑
(4
‑
乙烯基苄基氨基)
‑
乙酸
‑
共
‑3‑
甲基
‑1‑
(4
‑
乙烯基苄基)
‑
3h
‑
咪唑
‑1‑
鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯]；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基
苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓氯化物
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基吗啉鎓乙酸盐
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓硝酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基甲基咪唑鎓乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑4‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻乙酸盐
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(丁基
‑
乙烯基咪唑鎓氯化物
‑
共
‑
丁基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸)；聚(丁基
‑
乙烯基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑
丁基咪唑鎓硫酸氢盐
‑
共
‑4‑
乙烯基苯磺酸)；聚(苄醇
‑
共
‑4‑
乙烯基苄醇磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基
‑
三苯基鏻氯化物
‑
共
‑
二乙烯基苄醇)；聚(苄醇
‑
共
‑4‑
乙烯基苄醇磺酸
‑
共
‑
乙烯基苄基三苯基鏻硫酸氢盐
‑
共
‑
二乙烯基苄醇)；聚(苯乙烯
‑
共
‑
乙烯基苯磺酸
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑
乙烯基苯膦酸
‑
共
‑
二乙烯基苯)；聚(苯乙烯
‑
共
‑
乙烯基苯硼酸
‑
共
‑
二乙烯基苯)；磺化聚苯乙烯
‑
共
‑
二乙烯基苯
微孔凝胶树脂；磺化聚苯乙烯
‑
共
‑
二乙烯基苯大孔树脂。
[0300]
在一些实施方案中，所述催化剂是具有根据表1的一种或多种物理和化学性质的强酸阳离子交换树脂。在一些实施方案中，所述催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。
[0301]
在一些实施方案中，用于制备所述寡糖组合物的催化剂是可溶性酸性催化剂。
[0302]
在一些实施方案中，用右旋糖制剂负载催化剂后，将所得反应混合物在促进酸催化的寡糖形成的条件下保持在大气压和在约120℃至135℃的温度。在一些实施方案中，负载催化剂后，在促进酸催化的寡糖形成的条件下，将所述反应混合物保持在其沸点。所述反应混合物的环境压力可以在0.5
‑
1.5atm的范围内。例如，所述压力可以小于1atm(例如，约0.5、0.6、0.7、0.8或0.9atm)、约1atm或大于1atm(例如，约1.1、1.2、1.3、1.4或1.5atm)。在一些实施方案中，用右旋糖制剂负载催化剂后，将所得反应混合物保持在大气压之外(例如，小于0.5atm或大于1.5atm)，但是保持在促进酸催化的寡糖形成的温度和条件下。
[0303]
在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点，直到合成的寡糖组合物中右旋糖单体的重量百分比在特定范围内，例如，一旦合成的寡糖组合物中右旋糖单体的重量百分比为30％或更小(例如，28％或更少、25％或更少、22％或更少、20％或更少、19％或更少、18％或更少、17％或更少、16％或更少、15％或更少、14％或更少、13％或更少、12％或更少、11％或更少或10％或更少)。在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点，直到合成的寡糖组合物中右旋糖单体的重量百分比在特定范围内，例如，10％至20％、12％至22％、14％至22％、14％至20％、14％至18％、12％至18％或16％至24％。在一些实施方案中，一旦合成的寡糖组合物中的右旋糖单体的重量百分比在特定范围内，例如，一旦合成的寡糖组合物中的右旋糖单体的重量百分比为30％或更少(例如28％或更少、25％或更少、22％或更少、20％或更少、19％或更少、18％或更少、17％或更少、16％或更少、15％或更少、14％或更少、13％或更少、12％或更少、11％或更少、或10％或更少)，将所述反应混合物淬灭。在一些实施方案中，一旦合成的寡糖组合物中右旋糖单体的重量百分比在特定范围内，例如10％至20％、12％至22％、14％至22％、14％至20％、14％至18％、12％至18％或16％至24％，将所述反应混合物淬灭。在一些实施方案中，淬灭包括使用水(例如去离子水)稀释所述反应混合物，并将所述反应混合物的温度逐渐降低至100℃或更低。
[0304]
在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点直到净水冷凝物相对于加热前所述反应混合物中存在的总右旋糖的摩尔比在特定范围内，例如，0.35至1.0(例如，0.35至0.8、0.4至0.9、0.5至0.9、0.5至0.8、0.6至0.9、0.6至0.8或0.7至0.9的范围)的范围。例如，在一些实施方案中，将所述反应混合物保持在其沸点直到净水冷凝物相对于加热前所述反应混合物中的总右旋糖单体的摩尔比为0.4至0.9(例如，约0.6至0.8)。
[0305]
在一些实施方案中，一旦净水冷凝物与加热前所述反应混合物中存在的总右旋糖的摩尔比在特定范围内，例如，0.35至1.0(例如0.35至0.8、0.4至0.9、0.5至0.9、0.5至0.8、0.6至0.9、0.6至0.8或0.7至0.9)，将所述反应混合物淬灭。例如，在一些实施方案中，一旦净水冷凝物与加热前反应混合物中总右旋糖单体的摩尔比为0.4至0.9(例如约0.6至0.8)，将所述反应混合物淬灭。在一些实施方案中，淬灭包括使用水(例如去离子水)稀释所述反应混合物，并将所述反应混合物的温度逐渐降低至100℃或更低。
[0306]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物在反应混合物中包含少于10％的山梨糖醇，
例如，约10％、约8％、约6％、约4％、约2％、约1％的山梨糖醇或约0.1％或更少的山梨糖醇。在一些实施方案中，所述寡糖组合物在反应混合物中包含少于10％的山梨糖醇，例如约10％、约8％、约6％、约4％、约2％、约1％的山梨糖醇或约0.1％或更少的山梨糖醇，和在所述寡糖组合物中少于10％的山梨糖醇，例如约10％、约8％、约6％、约4％、约2％、约1％的山梨糖醇或约0.1％或更少的山梨糖醇。
[0307]
通常，将所述催化剂和所述右旋糖制剂同时或顺序地引入反应器的内部腔室。寡糖合成可以分批过程或连续过程进行。例如，在一个实施方案中，聚糖聚合物的合成是分批进行的，其中将反应器的内容物连续混合或共混，并且移出(例如，分离和/或回收)全部或大量的反应产物。在一个变体中，聚糖聚合物的合成以分批过程进行，其中反应器的内容物最初被搀和(intermingled)或混合，但不进行进一步的物理混合。在另一个变体中，聚糖聚合物的合成以分批过程进行，其中一旦进行内容物的进一步混合或反应器中的内容物的定期混合(例如，每小时一次或多次)，则在一定时间后移出(例如，分离和/或回收)全部或大量的的反应产物。
[0308]
在其他实施方案中，寡糖合成是在连续过程中进行的，其中内容物以平均连续流速流过反应器。在将催化剂和葡萄糖引入反应器中之后，将反应器的内容物连续或定期地混合或共混，并且在一段时间后，移出(例如，分离和/或回收)少于全部的反应产物。在一个变体中，聚糖聚合物的合成是在连续过程中进行的，其中不主动混合包含催化剂和葡萄糖的混合物。另外，催化剂和右旋糖的混合可由于催化剂在重力作用下重新分布而发生，或者是当物料流过连续反应器而发生的非主动混合。在另一个变体中，通过反应物流连续地给反应器供料，同时从反应器中连续地转移产物流。在另一个变体中，反应器在稳态下操作，其中反应物流和产物流保持在固定的流速下。在其他变体中，一部分反应器内容物通过外部循环回路被连续地泵送，例如，为了控制或测量反应器内容物的性质，例如温度、密度、ph、粘度、水含量和/或化学组成。在一些变型中，通过将经过这样的外部循环回路的一部分反应器内容物泵送的作用来实现反应器内容物的混合。在一个特定的变体中，所述外部循环回路包含在线热交换器、闪蒸罐或排污罐。在另一个变体中，所述外部循环回路包含静态混合元件或混合室。
[0309]
在本文提供的方法的一些实施方案中，用于所述聚合反应的起始原料是一种或多种单糖、一种或多种二糖、一种或多种三糖、一种或多种寡糖或其组合。例如，所述聚合反应的起始原料可以是由右旋糖单体、右旋糖二聚体和/或右旋糖三聚体组成的右旋糖制剂。在一些实施方案中，所述聚合反应的起始原料是右旋糖一水合物。在一些实施方案中，所述聚合反应的起始原料是一种或多种葡萄糖单体、二聚体和/或三聚体。在该方法的一些实施方案中，用于所述聚合反应的起始原料是呋喃糖和/或吡喃糖。在该方法的一些实施方案中，用于所述聚合反应的起始原料是一种或多种选自于四糖、戊糖、己糖或庚糖的聚糖单元。在该方法的一些实施方案中，用于所述聚合反应的起始原料是葡萄糖，任选地以其l
‑
或d
‑
形式、α或β构型(对于葡萄糖二聚体)和/或脱氧形式，如果适用，及其任何组合。在一些实施方案中，所述葡萄糖被乙酸酯、硫酸半酯、磷酸酯或丙酮酰(pyruvyl)环缩醛基团中的一种或多种取代或衍生化，或者以其他方式，例如，在一个或多个羟基上衍生化。
[0310]
在一些实施方案中，所述聚合反应的起始原料是淀粉水解物，例如葡萄糖浆、玉米糖浆或其混合物。在一些实施方案中，所述聚合反应的起始原料是右旋糖浆。在一些实施方
案中，所述起始原料可以是选自一定范围的右旋糖当量(de)糖浆内的任何糖浆的糖浆，例如选自20
‑
99de糖浆的糖浆。
[0311]
在一个实施方案中，本文所述方法中使用的葡萄糖(例如，右旋糖)可以是一种或多种c5或c6单糖。在一些实施方案中，所述葡萄糖是c5单糖。在一些实施方案中，所述葡萄糖是c6单糖。
[0312]
在一些实施方案中，所述聚合反应的起始原料是选自氨基糖、脱氧糖、亚氨基糖、糖酸、糖酰胺、糖醚、短链脂肪酸、糖醇或其任何组合中的一种或多种聚糖单元。
[0313]
在一些实施方案中，为了获得纯化的寡糖组合物，可以例如通过用水将淬灭的反应混合物稀释至约5
‑
65重量百分比的浓度，然后使该混合物通过一系列色谱树脂，而将该组合物与酸催化剂分离。该系列色谱树脂可涉及阳离子交换树脂，然后阴离子交换树脂，并以脱色聚合物树脂结束。在一些实施方案中，可以以任何顺序一次或多次使用任何或所有类型的树脂。
[0314]
对于某些应用，期望将残留糖单体的水平降低至低于合成期间所达到的水平，例如，从约20％至小于10％(例如，小于5％、小于2％或小于1％的单体)。在一些实施方案中，寡糖组合物可以脱单体化。在一些实施方案中，脱单体化涉及从寡糖组合物中除去残留的糖单体。可以使用多种方法从寡糖制剂中除去单体糖，例如分步沉淀、膜分离、色谱分离和发酵。参见，例如，sen,等人，2011,food chem.,128(3),773
‑
777；pinelo,等人，2009,separation purification technol.,70,1
‑
11；vanneste,等人，2011,separation purification technol.,80,600
‑
609；以及guerrero,等人，2014,int.dairy j.,39,78
‑
88，其所有内容均通过引用并入本文。这些脱单体方法可以单独使用或组合使用，以降低寡糖制剂中的单体水平。在一些实施方案中，使用色谱树脂进行脱单体化。因此，在一些实施方案中，取决于存在的单体的百分比，可以制备不同的组合物。在一些实施方案中，将所述寡糖组合物脱单体至约1％、约3％、约5％、约10％或约15％的单体含量。在一个实施方案中，将所述寡糖组合物脱单体至小于1％的单体含量。在一个实施方案中，将所述寡糖组合物脱单体至约12％至18％之间的单体含量。在一个实施方案中，将所述寡糖组合物脱单体至约13％至17％之间的单体含量。在一些实施方案中，通过渗透分离实现脱单体。在一些实施方案中，通过切向流过滤(tff)实现脱单体。在一些实施方案中，通过乙醇沉淀实现脱单体。
[0315]
在一些实施方案中，如表2所示，具有不同单体含量的寡糖组合物也可具有不同测量值的总膳食纤维、水分、总膳食纤维(干基)或de百分率。
[0316]
表2.脱单体对寡糖组合物特征的影响
[0317][0318]
在一些实施方案中，总膳食纤维根据aoac 2011.25的方法测量。在一些实施方案中，水分通过使用真空烘箱在60℃测量。在一些实施方案中，计算总膳食纤维(干基)。在一些实施方案中，右旋糖当量(de)(干基)百分率根据食品化学品法典(fcc)测量。
[0319]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物例如通过实施例9中所述的方法脱单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有约13至27％的de(干基)、约18至28％的de(干基)、约16至24％(干基)或20至26％(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的de为15至25或16至24(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总膳食纤维(干基)为至少70％，例如，70％至99％(干基)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总膳食纤维含量为至少70％(干基)、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含低于定量极限的可溶性膳食纤维沉淀物(sdfp)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含低于定量极限的不溶性膳食纤维(idf)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含高分子量膳食纤维(hmwdf)，即sdfp和idf，其低于定量极限。在一些实施方案中，根据本文提供的方法的寡糖组合物的生产可以分批过程或连续过程进行。例如，在一个实施方案中，以分批过程生产寡糖组合物，其中将反应器的内容物置于搅拌条件(例如，连续混合或共混)，并且移出(例如，分离和/或回收)全部或大量的反应产物。
[0320]
在某些实施方案中，使用催化剂的方法在水性环境中进行。一种合适的水性溶剂是水，其可以从各种来源获得。通常，在一些实施方案中，可以使用离子物种(例如，钠、磷、铵或镁的盐)浓度较低的水源，因为这类离子物种可能会降低催化剂的效力。在所述水性溶剂是水的一些实施方案中，所述水具有小于10％的离子物种(例如，钠、磷、铵、镁的盐)。在所述水性溶剂是水的一些实施方案中，所述水的电阻率为至少0.1兆欧
‑
厘米、至少1兆欧
‑
厘米、至少2兆欧
‑
厘米、至少5兆欧
‑
厘米或至少10兆欧
‑
厘米。在一些实施方案中，随着本文所述反应的进行，各个糖苷偶联(例如，在两个或更多个糖单体之间)产生水(例如，释放的水)。在某些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括在一段时间内监测所述反应混合物中存在的水的量和/或水与单体或催化剂的比例。因此，在一些实施方案中，所述反应混合物中的水含量可以在反应过程中改变，例如通过除去产生的释放的水。可以使用适当的方法去除反应混合物中的水(例如，释放的水)，包括例如通过蒸发，例如通过蒸馏。在一些实施方案中，所述方法包括在反应混合物中包括水。在某些实施方案中，所述方法包括通过蒸
发从反应混合物中除去水。
[0321]
在一些实施方案中，向反应混合物中加入水以使反应混合物的温度达到100℃或更低以淬灭反应。在一些实施方案中，添加的水是去离子水。在一些实施方案中，添加的水的温度为约60℃至约100℃。在一些实施方案中，在足以避免混合物固化的条件下将水加入到反应混合物中。
[0322]
可以在反应过程中测量和/或改变反应混合物的粘度。通常，粘度是指流体的内部流动阻力(例如“稠度”)的度量，以厘泊(cp)或帕斯卡
‑
秒表示。在一些实施方案中，所述反应混合物的粘度为约100cp至约95,000cp、约5,000cp至约75,000cp、约5,000至约50,000cp或约10,000至约50,000cp之间。在某些实施方案中，所述反应混合物的粘度在约50cp至约200cp之间。
[0323]
在一些实施方案中，本文提供的寡糖组合物可以进行一个或多个另外的处理步骤。另外的处理步骤可包括例如纯化步骤。纯化步骤可包括例如分离、脱单体、稀释、浓缩、过滤、脱盐或离子交换、色谱分离或脱色或其任何组合。
[0324]
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括脱色步骤。所产生的一种或多种寡糖组合物可使用适当的方法进行脱色步骤，所述方法包括例如用吸附剂、活性炭、色谱法(例如，使用离子交换树脂)和/或过滤(例如，微滤)处理。
[0325]
在一些实施方案中，使产生的一种或多种寡糖组合物与材料接触以除去盐、矿物质和/或其他离子物质。例如，在某些实施方案中，使产生的一种或多种寡糖组合物流过阴离子交换柱。在其他实施方案中，使产生的寡糖组合物流过阴离子/阳离子交换柱对。
[0326]
在一些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括浓缩步骤。例如，在一些实施方案中，可将寡糖组合物进行蒸发(例如，真空蒸发)以产生浓缩的寡糖组合物。在其他实施方案中，可将寡糖组合物进行喷雾干燥步骤以产生寡糖粉末。在某些实施方案中，所述寡糖组合物可同时进行蒸发步骤和喷雾干燥步骤。在一些实施方案中，将所述寡糖组合物进行冻干(例如，冷冻干燥)步骤以除去水并产生粉状产物。
[0327]
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括分级步骤。制备和纯化的寡糖组合物可以随后使用本领域已知的任何方法通过分子量分离，所述方法包括例如高效液相色谱法、吸附/解吸(例如低压活性炭色谱法)或过滤(例如，超滤或渗滤)。在某些实施方案中，寡糖组合物被分成代表60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或大于98％的短(约dp1
‑
2)、中(约dp3
‑
10)、长(约dp11
‑
18)或非常长(约dp>18)的物种的集合。
[0328]
在某些实施方案中，制备的寡糖组合物通过吸附在碳质材料上进行分级，随后通过用在水中的浓度为1％、5％、10％、20％、50％或100％的有机溶剂的混合物洗涤所述材料，将级分解吸。在一个实施方案中，所述吸附材料是活性炭。在另一个实施方案中，所述吸附材料是活性炭和如硅藻土或celite 545的填充剂(按体积或重量计5％、10％、20％、30％、40％或50％的比例)的混合物。
[0329]
在进一步的实施方案中，如本文所述制备的寡糖组合物通过高效液相色谱系统分离。在某些变体中，通过离子亲和色谱、亲水相互作用色谱或包括凝胶渗透和凝胶过滤的尺寸排阻色谱分离所制备的寡糖组合物。
[0330]
在一些实施方案中，过滤除去催化剂。在其他实施方案中，通过过滤方法除去低分子量材料。在某些变体中，可以通过透析、超滤、渗滤或切向流过滤除去低分子量材料。在某
些实施方案中，所述过滤是在静态透析管装置中进行的。在其他实施方案中，所述过滤在动态流过滤系统中进行的。在其他实施方案中，所述过滤是在离心力驱动的滤筒中进行的。在某些实施方案中，将所述反应混合物冷却至低于约85℃，然后过滤。
[0331]
寡糖组合物的表征
[0332]
在一些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度在4
‑
10的范围内。在一些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度在4
‑
8、5
‑
9、5
‑
8、5
‑
7、6
‑
9、6
‑
8、4
‑
5、5
‑
6、6
‑
7、7
‑
8、8
‑
9或9
‑
10的范围内。在一些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度为约5.5
‑
8.5。在某些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度为约6。在某些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度为约7。在一些实施方案中，所有聚糖的平均聚合度在约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的范围内。
[0333]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)在700
‑
1620范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)在852
‑
1475范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)在850
‑
14500，例如，850
‑
1410、870
‑
1410、850
‑
1200、900
‑
1100或900
‑
1050范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)在1005
‑
1315范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)在700
‑
850、900
‑
1000、850
‑
1000、850
‑
1050、1000
‑
1200、1200
‑
1400、1400
‑
1600或1500
‑
1620范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)为约900、950、980、1000、1050、1075、1100、1150或1200的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mww(g/mol)为约960或1150的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在560
‑
960范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在600
‑
900，例如，600
‑
850、625
‑
860、650
‑
850、650
‑
800、600
‑
700或700
‑
800范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在612
‑
912范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在700
‑
820范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在600
‑
700，例如，620
‑
700或650
‑
700范围内的寡糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含mwn(g/mol)在560
‑
700、600
‑
750、650
‑
800、700
‑
850、850
‑
900、900
‑
960或900
‑
1000范围内的寡糖。
[0334]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含在70
‑
99％重量百分比(干基)(例如，根据例如尺寸排阻色谱法(sec)测定，例如根据在实施例11中所述的方法)范围内的具有两种或更多种单体(dp2 )的寡聚物。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含的具有两种或更多种单体(dp2 )的寡聚物在80
‑
95％重量百分比、80
‑
90％重量百分比、82
‑
95％重量百分比、82
‑
90％重量百分比、83
‑
91％重量百分比、83
‑
89％重量百分比、83
‑
86％重量百分比、83
‑
85％重量百分比、84
‑
89％重量百分比、84
‑
86％重量百分比、85
‑
87％重量百分比、86
‑
89％重量百分比、87
‑
89％重量百分比、88
‑
90％重量百分比或89
‑
91％重量百分比范围内。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含的具有两种或更多种单体(dp2 )的寡聚物在83
‑
86重量百分比范围内的单体(dp2 )。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含的具有两种或更多种单体(dp2 )的寡聚物在约80％、约81％、约82、约83、约84、约85、约86、约87重量百分比、约88百分比、约89百分比或约90百分比范围内。在一些实施方案中，所述组合物包含约6％至约23％的单体(dp1)和/或约4％至约12％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述组合物包含8％至17％的单体(dp1)和/或约6％至约10％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述组合物包含约12％至约21％的单体(dp1)和/或约7％至约12％的二糖(dp2)。
[0335]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含葡萄糖(例如，右旋糖)单糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有如通过例如，实施例11中所述的sec hplc测定的不超过30％的单糖或单体(干基)。在某些情况下，所述寡糖组合物含有少于28％的单体(干基)、少于25％的单体、少于22％的单体、少于20％的单体、少于18％的单体、少于16％的单体、少于14％的单体、少于12％的单体、少于10％的单体、少于8％的单体、少于6％的单体、少于4％的单体、或少于2％的单体。在某些情况下，寡糖组合物含有范围为12
‑
25％的单体(干基)、10
‑
20％的单体、12
‑
22％的单体、10
‑
18％的单体、12
‑
18％的单体、13
‑
18％的单体、1
‑
10％的单体、或5
‑
10％的单体。在一些情况下，所述寡糖组合物，例如，根据实施例9中所述的方法脱单体。在一些情况下，所述寡糖组合物包含少于5％的单体(干基)，例如，少于4％、少于2％或少于1％的单体。在某些情况下，所述寡糖组合物含有0
‑
5％的单体或2
‑
5％的单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的多分散指数(pdi)为1.3
‑
1.8，例如pdi为1.4
‑
1.7或1.5
‑
1.7。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的pdi为1.0
‑
1.2、1.2
‑
1.3、1.3
‑
1.4、1.4
‑
1.5、1.5
‑
1.6、1.7
‑
1.8或1.8
‑
2.0。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的pdi为约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7或约1.8。
[0336]
在一些实施方案中，使用实施例11中所述的尺寸排阻色谱法确定寡糖组合物中寡糖的mww、mwn、pdi、单体含量(dp1)和/或dp2 值。
[0337]
在一些实施方案中，使用实施例13中所述的尺寸排阻色谱法确定寡糖组合物中单糖和二糖的量。在一些实施方案中，使用实施例13中所述的尺寸排阻色谱法测定寡糖组合物中寡糖的单体(dp1)、二糖(dp2)和dp3 含量。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含5.5％至24％的单体(dp1)，例如，5.61％至23.21％或12％至22％的单体(dp1)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约10％至约20％的单体dp1。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含5％至8％、5％至10％、7％至10％、10％至15％、9％至12％、11％至14％、15％至20％、13％至16％、15％至18％、12％至19％、17％至20％、20％至25％、19％至22％、21％至24％或20％至23％的单体(dp1)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含8.27％至16.89％或12.34％至21.39％的单体(dp1)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含4％至14％的二糖(dp2)，例如4.45％至12.30％或7％至12％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约6％至约11％的二糖(dp2)，例如6％至9％、7％至11％或8％至10％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含4％至5％、5％至6％、6％至7％、7％至8％、8％至9％、9％至10％、10％至11％、11％至12％、或12％至13％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含5％至10％、5％至15％、10％至15％或15％至20％的二糖(dp2)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含5.73％至9.68％或6.97％至11.86％的二糖(dp2)。
[0338]
在一些实施方案中，如例如实施例12中所述，通过例如sec hplc测定本文所述的寡糖组合物中杂质的量。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含3.0％或更少的总杂质(不包括单体)，例如，少于3.0％、少于2.5％、少于2.0％、少于1.5％、少于1.0％或少于0.5％的杂质。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.2％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.10％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.05％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.30％、0.20％、0.15％、0.10％或0.05％的总杂质(不包括单体)。
[0339]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有0.2％w/w的乳酸或更少(例如，0.0
‑
0.05％w/w的乳酸)、0.7％w/w的甲酸或更少(例如，0.05
‑
0.45％w/w的甲酸)、0.2％w/w的乙酸或更少(例如，0.0
‑
0.05％w/w乙酸)、2.0％w/w的乙酰丙酸或更少(例如，0.1
‑
0.8％或0.1
‑
1.5％w/w的乙酰丙酸)、2.0％w/w的左旋葡聚糖或更少(例如，0.0
‑
0.5％或0.0
‑
1.3％w/w的左旋葡聚糖)、1.0％w/w的左旋葡聚糖异构体或更少(0.0
‑
0.5％w/w的左旋葡聚糖异构体)和/或0.2％w/w的羟甲基糠醛(hmf)或更少(例如，0.0
‑
0.05％w/w的hmf)或其任何组合，例如，所述寡糖组合物中这些杂质的任何组合，其中所述寡糖组合物中的总杂质为3.0％或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含少于0.1％w/w的乳酸、少于0.1％w/w的甲酸、少于0.1％w/w的乙酸和/或少于0.1％w/w的hmf。
[0340]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.01％w/w的乙酸、约0.2％w/w的甲酸、约0.6％w/w的乙酰丙酸和/或约0.4％的左旋葡聚糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含0.00％至0.03％w/w的乙酸、0.5％至0.7％w/w的乙酰丙酸、0.2％至0.3％w/w的甲酸和0.4％至0.5％的左旋葡聚糖。在一些实施方案中，所述寡糖组合物不含可检测量的乙酸、乳酸或hmf，或其任何组合。
[0341]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至1.0％w/w之间的乳酸(例如，0.0
‑
0.05％w/w的乳酸)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至0.5％w/w之间的甲酸(例如，0.2
‑
0.3％w/w的甲酸)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至0.1％w/w之间的乙酸(例如，0.0
‑
0.05％w/w的乙酸)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至1.2％w/w之间的乙酰丙酸(例如，0.5
‑
0.8％w/w的乙酰丙酸)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至1.0％w/w之间的hmf(例如，0.0
‑
0.03％w/w的hmf)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至1.3％w/w之间的左旋葡聚糖(例如，0.0
‑
0.5％w/w的左旋葡聚糖)。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含约0.0％w/w至0.6％w/w之间的左旋葡聚糖异构体(例如，0.0
‑
0.25％w/w的左旋葡聚糖异构体)在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.1％w/w的乳酸，例如，0.05％、0.03％、0.02％或0.01％的乳酸或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.5％w/w的甲酸，例如，0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的甲酸或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.1％w/w的乙酸，例如，0.05％、0.03％、0.02％或0.01％的乙酸或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过1.0％w/w的乙酰丙酸，例如，0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的乙酰丙酸或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.1％w/w的hmf，例如，0.05％、0.03％、0.02％或0.01％的hmf或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.8％w/w的左旋葡聚糖，例如，0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.45％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的左旋葡聚糖或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有不超过0.5％w/w的左旋葡聚糖异构体，例如，0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的左旋葡聚糖异构体或更少。在一些实施方案中，所述寡糖组合物被脱单体化。在一些实施方案中，所述寡糖组合物是未脱单体的。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有0.0％至0.4％w/w的甲酸(例如，0.1％至0.3％w/w的甲酸)、0.3％至1.0％w/w的乙酰丙酸(例如，0.5％至0.7％)、无可检测量的乳酸、无可检测量的乙酸或无可检测量的hmf。在一些实施方案中，所述寡糖组合物含有0.0％至0.4％w/w的甲酸(例如，0.1％至0.3％w/w的甲酸)、0.3％至1.0％w/w的乙酰丙酸(例如，0.5％至0.7％)、无
可检测量的乳酸、无可检测量的乙酸和无可检测量的hmf。
[0342]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总水含量为20
‑
35％重量百分比，例如，水含量为22
‑
32％、25
‑
35％、24
‑
33％、26
‑
32％或28
‑
30％重量百分比。
[0343]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的ph范围为2.5至7.5，例如，2.5至5.0或3.0至4.0。
[0344]
通过全甲基化分析进行表征
[0345]
本文所述的寡糖组合物，以及根据本文所述的方法制备的寡糖组合物，可以使用全甲基化分析来表征和区别于现有技术的组合物。参见，例如，zhao,y.,等人
‘
rapid,sensitive structure analysis of oligosaccharides,’pnas march4,1997 94(5)1629
‑
1633；kailemia,m.j.,等人
‘
oligosaccharide analysis by mass spectrometry:a review of recent developments,’anal chem.2014jan 7；86(1):196
–
212。因此，在另一方面，本文提供了寡糖组合物，其包含人类最低限度可消化的多种寡糖，所述多种寡糖包含单体基团。所述多种寡糖中不同类型单体基团的摩尔百分比可以使用全甲基化测定法定量。在一些实施方案中，对所述组合物的脱单体化样品进行全甲基化测定。
[0346]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含选自表3的基团(1)
‑
(15)的单体基团：
[0347]
表3.单体基团
[0348]
[0349][0350]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(1)
‑
(7)的两种或更多种单体基团：
[0351]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.8
‑
8.9mol％的单体基团；
[0352]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中20.0
‑
23.5mol％的单体基团；
[0353]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中7.0
‑
8.3mol％的单体基团；
[0354]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.6
‑
1.3mol％的单体基团；
[0355]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.5
‑
2.4mol％的单体基团；
[0356]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.9mol％的单体基团；和
[0357]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.4
‑
0.7mol％的单体基团。
[0358]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(1)
‑
(7)的两种、三种、四种、五种、六种或七种类型的单体基团。
[0359]
在某些实施方案中，所述多种寡糖进一步包含选自基团(8)
‑
(12)的一种或多种类型的单体基团：
[0360]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中30.9
‑
43mol％的单体基团；
[0361]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中7.4
‑
8.8mol％的单体基团；
[0362]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.7
‑
1.3mol％的单体基团；
[0363]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中6.0
‑
8.8mol％的单体基团；和
[0364]
(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.7mol％的单体基团。
[0365]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(8)
‑
(12)的一种、两种、三种、四种或五种类型的单体基团。
[0366]
在某些实施方案中，所述多种寡糖进一步包含一种或多种类型的选自基团(13)
‑
(15)的单体基团：
[0367]
(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中3.0
‑
5.3mol％的单体基团；
[0368]
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.7mol％的单体基团；和
[0369]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中0.1
‑
0.5mol％的单体基团。
[0370]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(13)
‑
(15)的一种、两种或三种类型的单体基团。
[0371]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含以下单体基团：
[0372]
(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.8
‑
8.9mol％的单体基团；
[0373]
(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中20.0
‑
23.5mol％的单体基团；
[0374]
(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中7.0
‑
8.3mol％的单体基团；
[0375]
(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.6
‑
1.3mol％的单体基团；
[0376]
(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.5
‑
2.4mol％的单体基团；
[0377]
(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.9mol％的单体基团；
[0378]
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.4
‑
0.7mol％的单体基团；
[0379]
(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中30.9
‑
43mol％的单体基团；
[0380]
(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中7.4
‑
8.8mol％的单体基团；
[0381]
(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中0.7
‑
1.3mol％的单体基团；
[0382]
(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中6.0
‑
8.8mol％的单体基团；
[0383]
(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.7mol％的单体基团；
[0384]
(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中3.0
‑
5.3mol％的单体基团；
[0385]
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.2
‑
0.7mol％的单体基团；和
[0386]
(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中0.1
‑
0.5mol％的单体基团。
[0387]
在一个特定的实施方案中，提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述寡糖包含表4所示的摩尔百分比的单体基团(1)
‑
(15)。在某些实施方案中，所述寡糖组合物被脱单体化，例如，所述寡糖组合物包含3％的葡萄糖(例如，右旋糖)单体或更少(例如，2％的葡萄糖或右旋糖单体或更少)。
[0388]
当定义的摩尔百分比(mol％)范围关于基团时是指多种寡糖中相对于总基团的摩尔量的单独基团(例如，单体基团)的摩尔量。例如，通过将t
‑
吡喃葡萄糖基团的摩尔总数除以多种寡糖中所有基团的摩尔量来确定t
‑
吡喃葡萄糖基团的mol％。
[0389]
在一些实施方案中，单独基团的mol％在去除呋喃糖衍生的基团信号后确定，在一
些实施方案中，单独基团的mol％归一化至脱单体化的寡糖。
[0390]
表4.所选寡糖组合物的单体基团的平均mol％
[0391][0392]
在某些实施方案中，所述多种寡糖包含：30
‑
43mol％吡喃葡萄糖单基；41
‑
50mol％吡喃葡萄糖二基；12
‑
19mol％吡喃葡萄糖三基；和0.8
‑
3mol％吡喃葡萄糖四基。
[0393]
在某些实施方案中，所述寡糖组合物不含单体。在其他实施方案中，所述寡糖组合物包含单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物包含5％或更少的单体，例如，5％、4％、3％、2％或1％或更少的单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有10％或更少的单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物具有30％或更少的单体、25％或更少、20％或更少或18％或更少的单体。在一些实施方案中，所述寡糖组合物被脱单体化，例如，使用实施例9中所述的方法。
[0394]
在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总支化百分比为约9％至约13％，例如，约10％至约12％。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总呋喃糖百分比(包括末端)为约1％至约4％，例如约2％或约3％。在一些实施方案中，所述寡糖组合物的总末端糖百分比为约42％至约50％，例如，约45％至约48％。
[0395]
通过2dnmr分析表征
[0396]
本文所述的寡糖组合物，以及根据本文所述的方法制备的寡糖组合物，可以使用二维异核nmr来表征和区别于现有技术的组合物。因此，在一些实施方案中，提供了包含多种寡糖(例如，人类最低限度可消化的)的寡糖组合物，该组合物的特征在于1h
‑
13
c异核单量
子相干(hsqc)nmr谱图包含信号1
‑
14，各个信号均具有如表5所示的中心位置和面积。在一些实施方案中，信号可称为峰。
[0397]
表5.属于寡糖组合物的hsqc nmr信号/峰
[0398][0399][0400]
在某些实施方案中，所述谱图包含信号1、3和4，各信号具有如下中心位置和面积：
[0401][0402]
在某些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0403]
[0404]
在某些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0405][0406]
在某些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0407][0408]
在某些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0409][0410]
在某些实施方案中，信号1、3和4定义如下：
[0411][0412]
在某些实施方案中，所述谱图进一步包含1
‑
2个(例如，一个或两个)选自信号8和9的信号：
[0413][0414]
在某些实施方案中，所述谱图进一步包含1
‑
2个(例如，一个或两个)选自信号8和9的信号：
[0415][0416]
在某些实施方案中，信号8和9定义如下：
[0417][0418][0419]
在某些实施方案中，信号8和9定义如下：
[0420][0421]
在某些实施方案中，信号8和9定义如下：
[0422][0423]
在某些实施方案中，信号8和9定义如下：
[0424][0425]
在某些实施方案中，所述谱图进一步包含1
‑
6个(例如，1、2、3、4、5或6个)选自信号6、7、11、12、13和14的信号：
[0426][0427]
在某些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0428][0429]
在某些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0430][0431]
在某些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0432][0433]
在某些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0434][0435][0436]
在某些实施方案中，信号6、7、11、12、13和14定义如下：
[0437][0438]
在某些实施方案中，所述谱图进一步包含1
‑
3个选自信号2、5和10的信号：
[0439][0440]
在某些实施方案中，所述谱图进一步包含1
‑
3个选自信号2、5和10的信号：
[0441][0442][0443]
在某些实施方案中，信号2、5和10定义如下：
[0444][0445]
在某些实施方案中，信号2、5和10定义如下：
[0446][0447]
在某些实施方案中，信号2、5和10定义如下：
[0448][0449]
在某些实施方案中，信号2、5和10定义如下：
[0450][0451]
在某些实施方案中，信号1
‑
14定义如下：
[0452][0453]
在某些实施方案中，信号1
‑
14定义如下：
[0454]
[0455][0456]
在某些实施方案中，信号1
‑
14各自进一步通过1h积分区和
13
c积分区表征，其定义如下：
[0457][0458]
在某些实施方案中，通过使组合物的样品进行异核单量子相干(hsqc)nmr来获得nmr谱图，其中该样品是在氘代溶剂中的溶液。合适的氘代溶剂包括氘代乙腈、氘代丙酮、氘代甲醇、d2o及其混合物。在一个特定的实施方案中，所述氘代溶剂是d2o。
[0459]
使用相对于定义的组的所有信号的总auc(例如，表5中提供的所有信号位置的总auc)的1h位置(ppm)和
13
c位置(ppm)为中心的峰积分确定单个信号(或峰)的曲线下面积(auc)。在一些实施方案中，该总面积是表5的信号1
‑
14中各个的面积之和。在一些实施方案中，每个独立信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和/或14的曲线下面积(auc)定义为表5中提供的信号1
‑
14的总面积的百分比。在一些实施方案中，提供了信号1
‑
14的总面积的百分比(％)，其代表特定信号的面积相对于信号的总面积(例如，表5中信号1
‑
14的各个信号的面积之和)的百分比。在一些实施方案中，该百分比可以称为曲线下面积(auc)参数。在一些实施方案中，可以将这些参数指定为特定样品或组合物落入的范围。在一些实施方案中，提及nmr谱图时，术语“信号”与术语“峰”可互换使用。在一些实施方案中，单独信号或峰的曲线下面积是从积分区(例如，椭圆积分区)得出的。在一些实施方案中，单独信号或峰的积分区(例如，椭圆积分区)由表5中提供的表示位置(例如，1h位置(ppm)和
13
c位置(ppm))定
义。
[0460]
在某些实施方案中，所述nmr谱图如实施例10所述获得。例如，所述组合物的nmr谱图是通过对该组合物样品进行多重编辑梯度增强的1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)实验而得到的，该实验使用回波
‑
反回波方案通过以下脉冲序列图和采集参数和处理参数进行相干选择：
[0461]
脉冲序列图
[0462][0463]
采集参数
[0464]1h载波频率＝4ppm
[0465]
13
c载波频率＝65ppm
[0466]
采集维度中的点数＝596
[0467]
采集维度中的频谱范围＝6.00ppm至2.03ppm
[0468]
间接维度中的点数＝300个复杂点
[0469]
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
[0470]
循环延迟＝1秒
[0471]
单键1h
‑
13
c耦合常数＝j
ch
＝146hz
[0472]
扫描次数＝8
[0473]
温度＝298k
[0474]
溶剂＝d2o
[0475]
处理参数
[0476]
直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66hz
[0477]
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48hz
[0478]
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点
[0479]
在某些实施方案中，通过nmr分析的组合物含有单糖单体(dp1)，即在nmr分析之前未从所述组合物中除去dp1组分。在某些实施方案中，通过nmr分析的组合物被脱单体化，即在nmr分析之前组合物的dp1组分被除去。
[0480]
iii.使用方法
[0481]
i.概述.
[0482]
如本文所述，寡糖组合物(例如，如实施例1
‑
4中所述)可用于在受试者(例如，氨水平升高的受试者)中降低氨水平。在一些实施方案中，将所述寡糖组合物配制为粉末，例如，用于重构(例如，在水中)以口服。因此，在一些实施方案中，本文提供了用于治疗与升高的氨水平有关的尿素循环障碍(ucd)的方法。在一些实施方案中，该方法降低了代谢物，例如，在患有ucd的受试者中累积的代谢物的水平。在一些实施方案中，该方法降低或增加了在受试者中(例如，在受试者的胃肠道中)的微生物或微生物类群的流行。
[0483]
在一些实施方案中，所述尿素循环障碍与受试者中(例如人类受试者中)氨甲酰磷酸合成酶i(cpsi)缺乏、鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏、精氨基琥珀酸合成酶(ass)缺乏、精氨基琥珀酸裂解酶(asl)缺乏、n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏、精氨酸酶缺乏、鸟氨酸转位酶缺乏(hhh)或希特林(citrin)缺乏症(cit ii)有关。在一些实施方案中，ucd不包括n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏。
[0484]
在一些实施方案中，患有ucd的受试者(例如，患者)可表现出一种或多种(例如，一、二、三、四、五、六或更多种)ucd症状。ucd的症状包括神经系统症状(例如，包括：意识水平下降、精神状态改变、运动机能异常和癫痫发作)和胃肠道症状(例如，包括：呕吐、喂食情况差、腹泻、恶心、便秘和蛋白质厌恶)。患有ucd的受试者可具有血液，例如，血浆、血清或全血的氨浓度升高。在一些实施方案中，所述受试者显示持续高于正常上限0.5倍的全身性氨水平。ucd也可以通过神经影像(例如，mri)诊断。基于dna测序的突变测试和/或下一代测序也可用于评估受试者(例如患者)是否具有ucd相关的突变。
[0485]
在一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的受试者正在或已经(例如，在前一年内)经历了ucd的护理治疗标准，其通常包括氮结合疗法或氮清除剂疗法、饮食(例如蛋白质)限制和/或血液透析。在一些实施方案中，可以将寡糖组合物与用于ucd的护理治疗标准一起施用，例如，可以将所述寡糖组合物与氮结合疗法或氮清除剂疗法一起施用。
[0486]
在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法治疗患有肝性脑病(he)的受试者。在一些实施方案中，所述受试者由于肝硬化而患有he。在一些实施方案中，这样的受试者显示出肝的多发性不良神经系统症状，这些症状会在肝脏无法从血液中去除例如氨的有毒物质时发生。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有轻微型he。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有显性he。显性he的护理治疗标准包括乳果糖、乳糖醇和抗生素(例如利福昔明或新霉素)。治疗还包括饮食调整和益生菌。在一些实施方案中，这样的方法通过减少氨危机的初始发作的发生而导致未来氨危机发作的发生率或受试者患he的风险降低。
[0487]
在一些实施方案中，本文提供的治疗的功效可以通过上述症状或诊断标准的缓解(例如，血清氨水平降低)来评估。在一些实施方案中，减少以下一项或两项：i)一年内氨危机的次数(例如，减少至少1、2或至少3次危机)，ii)氨危机引起的并发症的严重性，所述并发症包括神经发育迟缓和/或认知功能减退(例如，与未接受所述寡糖组合物的合适对照组相比)。在一些实施方案中，氨危机之间的时间间隔增加，例如，至少15％、30％、60％、100％或200％(例如，与未接受所述寡糖组合物的合适对照组相比)。
[0488]
在一些实施方案中，施用寡糖组合物(例如，根据实施例5、6或14生产的)，通过调节(例如，增加或减少)微生物酶活性和/或调节(例如，增加或减少)代谢产物(例如，积累和与疾病症状相关的代谢产物，例如，氨)，例如代谢产物的水平，来调节受试者(例如，受试者的胃肠道)，例如，具有ucd或he(例如，mhe或ohe)的受试者中的微生物(例如，微生物群落，例如，微生物组)。在一些实施方案中，施用寡糖组合物通过有效地调节(例如，增加或减少)微生物的酶活性和/或调节(例如，增加或减少)代谢物(例如，累积并与疾病症状有关的代谢物，例如，氨)，例如，代谢物的水平，来调节(例如，增加或减少)受试者(例如，受试者的胃肠道)，例如患有ucd或he的受试者(例如，mhe或ohe)中一种或多种微生物分类群的水平。
[0489]
ii.氨测试
[0490]
患有、怀疑患有高氨血症或有风险患高氨血症(例如，ucd和肝性脑病(he))的受试
者可具有相对于对照受试者(例如，未怀疑患有高氨血症的受试者)升高的血氨水平，例如，血浆氨水平、血清氨水平或全血氨水平。在一些实施方案中，健康成人受试者(例如，未怀疑患有高氨血症的受试者)中的血氨水平小于15、20、25、30、35、40、45或50μmol/l，例如，小于30μmol/l。在一些实施方案中，比正常水平高约0.5倍、约1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍或约3倍的血氨水平提示ucd或he。在一些实施方案中，患有或怀疑患有ucd或he的受试者的血氨水平大于或等于90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180μmol/l。在一些实施方案中，患有或怀疑患有ucd或he的受试者的血氨水平大于或等于100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μmol/l。在一些实施方案中，患有或怀疑患有ucd或he的受试者的血氨水平大于或等于100μmol/l。在一些实施方案中，患有或怀疑患有ucd或he的受试者的血氨水平大于或等于150μmol/l。
[0491]
患有、怀疑患有高氨血症或有风险患高氨血症的新生儿和儿童(例如，ucd和肝性脑病，he)可能具有相对于健康的新生儿或儿童升高的血氨水平，例如血浆氨水平、血清氨水平或全血氨水平。在一些实施方案中，健康的新生儿或儿童的平均血氨浓度为45
±
10μmol/l。在一些实施方案中，健康的新生儿或儿童(例如，未怀疑患有高氨血症的受试者)的平均血氨浓度小于或等于70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、87、88、89、90、91、92、93、94或95μmol/l，例如80或90μmol/l。在一些实施方案中，患有或怀疑患有ucd或he的新生儿或儿童的血氨水平大于或等于55、60、65、70、75、80、90或95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180μmol/l。
[0492]
在一些实施方案中，可以在静脉和动脉血样品中测量血氨浓度。在一些实施方案中，测量血清氨水平可用于监测本文所述的聚糖制剂的功效。例如，在一些实施方案中，在施用本文所述的寡糖组合物之前至少一个时间点和在施用所述寡糖组合物之后至少一个时间点(例如，施用所述寡糖组合物3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天、21天、30天或45天或更长时间中的一个或多个时间后)，在受试者(例如，血清氨水平升高的受试者)中测量血清氨水平。相对于施用所述寡糖组合物之前的时间点，在施用所述寡糖组合物之后的时间点血清氨水平降低表明该组合物表现出功效。
[0493]
在一些实施方案中，可通过测量气态氨(pnh3)的分压(例如，脑中)来评估高氨血症的等级或严重性。pnh3值可由总氨和ph值计算得出。在一些实施方案中，患有高氨血症的受试者具有相对于对照受试者(例如，未怀疑患有高氨血症的受试者)升高的pnh3水平。
[0494]
在一些实施方案中，在患有、怀疑患有轻微型肝性脑病(mhe)或具有患轻微型肝性脑病(mhe)的风险的受试者中，3
‑
硝基酪氨酸的血清水平可能升高。在一些实施方案中，患有、怀疑患有mhe或具有患mhe风险的受试者的血清3
‑
硝基酪氨酸水平大于约10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。在一些实施方案中，患有、怀疑患有mhe或具有患mhe风险的受试者的血清3
‑
硝基酪氨酸水平大于约10nm或约15nm。
[0495]
iii.肝性脑病(he)
[0496]
在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法(例如，使用如实施例5、6或14所述生产的寡糖组合物)治疗患有肝性脑病(he)的受试者。肝性脑病涉及一系列复杂的神经精神症状和临床症状，其会影响患者及其亲属的生活质量。肝性脑病是包括各种形式肝硬化在内的晚期肝病的常见并发症，并且高达80％的肝硬化患者具有某种形式的he，范围从轻
微型肝性脑病(mhe)到显性肝性脑病(ohe)。
[0497]
ohe被定义为临床医生无需特殊测试即可观察到的神经系统异常。症状可包括手或手臂的晃动、定向障碍和言语不清；患者可能会陷入昏迷状态。ohe可以在患有肝病、肝硬化的患者和经颈静脉肝内门体分流术(tips)的患者中发生。这种情况可能发生在胃肠道出血或感染之后。ohe的发展与死亡率增加相关。患有晚期肝病(esld)的患者经常需要ohe入院。
[0498]
患有mhe的患者有只有通过专门的心理测验才能发现的细微的症状，而且mhe通常被诊断不足。目前在临床实践中尚无常见的诊断范式来定义mhe，也没有获批的mhe治疗方法。mhe可导致失去独立的生活技能(例如，驾驶)，并预示后续发展为ohe。通常由沉淀物引起的单次ohe发作并随后恢复的患者也可能具有一定水平的mhe。
[0499]
a.表现和症状
[0500]
肝性脑病包括多发性不良神经系统症状，这些症状会在肝脏无法从血液中去除例如氨的有毒物质时发生。肝功能障碍包括：肝硬化(和门脉高压)，例如，类型a(由急性肝衰竭(alf)导致)、b(主要由pss引起)或c(由肝硬化导致)(肝硬化严重程度的child
‑
pugh评分)；在没有肝硬化的情况下
‑
具有自发性或手术产生的门体分流术(门体分流手术)；门体旁路(portal
‑
systemic bypass)、急性肝衰竭(alf)或慢加急性肝衰竭(aclf)。
[0501]
2014年aasld和easl处理he的临床实践指南建议根据潜在的肝脏疾病、表现的严重程度、时间进程和诱发因素对he进行分类。he的严重程度可根据临床表现进行分级：轻微型(心理或神经生理学检查结果异常，无临床表现)；i级(轻度意识模糊、言语含糊、睡眠障碍、行为改变)；ii级(嗜睡，轻度意识模糊)；iii级(明显的意识模糊(恍惚)、言语不连贯、沉睡但可唤醒)；iv级(昏迷，对疼痛无反应)。he可以根据疾病的时间进程进一步细分：发作性；复发(he发作持续6个月或更短)；和持久性(行为改变的模式始终存在，并穿插着显性he复发)。
[0502]
与术语“隐性肝性脑病”(che)可互换使用的“轻微型肝性脑病”(mhe)的定义是，在没有定向障碍或显示扑翼样震颤的慢性肝病(cld)患者中依赖于测试的或临床体征的脑功能障碍的存在。术语“轻微”表示没有he的临床体征、认知体征或其他征兆。术语“隐性”包括最低限度和1级he。由于cld患者中mhe和che的发生率可能高达50％，因此应对有风险的患者进行测试。
[0503]
患有he的受试者可能表现出认知缺陷，其包括：意识模糊、健忘、焦虑或兴奋、性格或行为的突然改变、睡眠方式的改变、定向障碍、甜或霉味的呼吸、言语不清和/或难以控制运动机能。这种情况反映了由于晚期肝病或大型门体分流术(例如，tips)引起的脑功能的弥散性紊乱。患者可能出现神经肌肉障碍，其包括运动迟缓、反射亢进、僵硬、肌阵挛和扑翼样震颤。昼夜睡眠方式紊乱(失眠和嗜睡)是肝性脑病的常见初始表现并通常先于其他精神状态改变或神经肌肉症状出现。
[0504]
b.诊断
[0505]
可以使用肝功能、血清氨水平、eeg以及其他血液和神经系统测试来诊断he。诊断的心理测试包括：数字连接测试(reitan测试)(分两部分进行的定时数字连接测试，其中无肝性脑病的患者应在小于或等于其年龄的秒数内完成测试)；心理肝性脑病评分(phes)(评估认知和心理运动处理速度和视觉运动协调性的五项纸笔测试)；抑制控制测试(ict)(注
意力和反应抑制的计算机化测试，已用于表征注意力不足障碍、精神分裂症和外伤性脑损伤)；stroop task(心理运动速度和认知灵活性测试，评估前部注意系统的功能，对检测轻微型肝性脑病的认知障碍敏感)；用于评估神经心理状态的可重复性成套测验(rbans)(测量与轻微型肝性脑病有关的多种神经认知功能)；和连续反应时间(crt)测试(取决于反复记录相对于听觉刺激(通过耳机)的运动反应时间(按一个按钮))。
[0506]
用于诊断的神经生理学测试包括临界闪烁频率(cff)测试(心理生理学工具，定义为指观察者观察到的融合光(从60hz向下显示)闪烁的频率)；脑电图检查(可以根据he的谱图检测整个大脑皮层大脑活动的变化，而无需患者配合或没有学习效果的风险)；以及诱发电位(外部记录的电信号，其反映通过神经元网络对各种传入刺激做出的同步放电(synchronous volleys of discharges))。在一些实施方案中，可以使用两种或多种心理测验或神经生理学测试的任意组合来诊断肝性脑病。
[0507]
c.he的治疗
[0508]
目前he的医学治疗包括治疗潜在的沉淀物(precipitant)(如果存在的话)，例如胃肠道出血或感染。he的护理治疗标准包括乳果糖、乳糖醇和抗生素(例如利福昔明或新霉素)。
[0509]
乳果糖是一种不被吸收的二糖，已经被使用了几十年以减少ohe患者的高氨血症。乳果糖的作用机理被认为主要是通过排泄粪便和酸化结肠环境来起作用，从而导致氨转化为铵，而铵则不易穿过结肠屏障进入血流。乳果糖还显示出刺激细菌生长，从而促进氨同化成细菌蛋白。与安慰剂相比，乳果糖可将ohe发作减少多达50％。
[0510]
利福昔明(一种来自利福霉素的吸收不良的抗生素)目前被批准用作ohe的二线治疗药物，并且当单独使用乳果糖无法控制ohe时，可与乳果糖联合使用。与乳果糖联合施用时，利福昔明可减少约50％的ohe发作。乳果糖和利福昔明均不足以降低ohe复发的风险，每次发作均会显著增加死亡风险。
[0511]
治疗方法还包括饮食调整和益生菌。可以通过以上列出的症状或诊断标准的解决(例如，降低血清氨水平)、降低未来he发作的发生率，或在具有he风险的受试者中降低he初次发作的发生率来评估治疗效果。
[0512]
iv.试剂盒
[0513]
还考虑了试剂盒。例如，试剂盒可包含寡糖组合物的单位剂型，以及包含使用该组合物治疗，例如，与高氨血症有关的疾病，例如，尿素循环障碍或肝性脑病的说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述组合物以干粉形式提供。在一些实施方案中，所述组合物以溶液形式提供。所述试剂盒在合适的包装中包括寡糖组合物以供有需要的受试者使用。本文所述的任何组合物都可以以试剂盒的形式包装。试剂盒可包含足以用于整个治疗过程或部分治疗过程的量的寡糖组合物。所述寡糖组合物的剂量可以单独包装，或者所述寡糖组合物可以散装提供，或其组合。因此，在一个实施方案中，试剂盒在合适的包装中提供了与治疗方案中的给药点相对应的寡糖组合物的单独剂量，其中该剂量被包装在一个或多个小包中。
[0514]
试剂盒可进一步包括书面材料，例如说明书、预期结果、鉴定书(testimonials)、解释、警告、临床数据、供保健专业人员使用的信息等。在一个实施方案中，所述试剂盒包含标签或其他指示该试剂盒仅在保健专业人员的指导下使用的信息。容器可进一步包括勺、
注射器、瓶子、杯子、涂抹器或其他测量或服务装置。
[0515]
实施例
[0516]
实施例1.在寡糖组合物存在下从人粪便浆料中减少氨
[0517]
测试了约三百五十种寡糖组合物体外调节健康人受试者的粪便浆料中的氨水平的能力(也称为离体测定)。在钯催化剂的存在下，在厌氧室(as
‑
580，anaerobe systems)中处理粪便样品和浆料。在水中以5％w/v制备寡糖组合物，过滤灭菌并添加到96孔深孔微孔板检测板中，以使测定中的终浓度为0.5％或0.05％w/v，水作为阴性对照提供。
[0518]
人类粪便样本捐赠物被保存在
‑
80℃。为了制备粪便浆液的工作储备液，将该粪便样品转移到厌氧室中并使其解冻。然后在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(p0261，teknova inc.，hollister，ca)、15％甘油中以20％w/v制备粪便样品。将该20％w/v粪便浆液 15％甘油以2,000x g离心，除去上清液，将沉淀物悬浮在1％pbs中，然后稀释在培养基中，该培养基由900mg/l氯化钠、26mg/l二水氯化钙、20mg/l六水合氯化镁、10mg/l四水合氯化锰、40mg/l硫酸铵、4mg/l七水合硫酸铁、1mg/l六水合氯化钴、300mg/l磷酸氢二钾、1.5g/l磷酸氢二钠、5g/l碳酸氢钠、0.125mg/l生物素、1mg/l吡哆醇、1m/l泛酸、75mg/l组氨酸、75mg/l甘氨酸、75mg/l色氨酸、150mg/l精氨酸、150mg/l蛋氨酸、150mg/l苏氨酸、225mg/l缬氨酸、225mg/l异亮氨酸、300mg/l亮氨酸、400mg/l半胱氨酸和450mg/l脯氨酸组成(theriot cm等人，nat commun.2014；5:3114)，且其进一步补充了750μm尿素以提供最终稀释为1％w/v的粪便浆液。
[0519]
将制得的1％w/v粪便浆液暴露于寡糖组合物的96孔板中，0.5％w/v的终浓度，每孔350μl终体积，在厌氧条件下于37℃持续45小时。
[0520]
离体温育后，以3,716x g使用离心10分钟沉淀细胞并将上清液储存在
‑
80℃或干冰上，然后进行分析。使用10kda过滤器(acroprep omega 10k,pall corporation,port washington new york)以1500x g过滤样品15分钟，并在水中稀释至原始浓度的1/10。然后使用氨比色测定试剂盒ii(k470,biovision incorporated,milpitas ca)分析样品。寡糖组合物的氨比色测定的结果示于图1a和1b中。氨水平归一化至阴性对照(水)。如图1a
‑
1b所示，相对于阴性对照，所选的寡糖组合物在降低氨水平方面显示出大于95％的功效。
[0521]
实施例2：在健康人受试者中对所选的寡糖组合物的研究
[0522]
在健康的成年人中通过一项随机、双盲、安慰剂对照研究(n＝47)评估了实施例1所述的所选寡糖组合物的安全性和耐受性，该研究旨在测量高蛋白质饮食存在下的益生菌(prebiotic)活性。为了使耐受性最大化，将以四个阶段逐步增加剂量，从每天两次随食物服用9g持续四天开始到每天两次36g持续六天；允许受试者根据耐受性降低剂量(剂量逐步降级)。
[0523]
肠(例如，通过肠细菌的食物发酵和肠上皮细胞的谷氨酰胺酶活性)为人的新陈代谢贡献了大量氨。根据一些评估，高氨血症受试者中多达70％的过量氨会积聚在胃肠道中(美国专利号9,487,764)。在肠道中，氨是通过微生物脲酶和氨基酸脱氨作用以及肠上皮细胞谷氨酰胺酶产生的(romero
‑
gomez等人，metab brain dis(2009)24:147
–
157)。减少源自肠道微生物群的氨的量可能对与高氨血症有关的疾病具有治疗作用。高氨血症相关疾病肝性脑病(he，包括显性he(ohe))用乳果糖(4
‑
o
‑
β
‑
d
‑
半乳糖基
‑
d
‑
果糖)和/或利福昔明(衍生自利福霉素sv的抗生素)治疗。两种试剂均靶向肠道细菌氨对全身氨负荷的贡献。患有其他
与高氨血症有关的疾病(例如尿素循环障碍(ucd))的受试者和处于发展高氨血症风险的受试者(例如，表现出轻微型he，mhe的受试者)也可能会受益于肠道细菌氨对全身氨负荷的贡献的减少。然而，在这些受试者中不使用乳果糖和利福昔明。
[0524]
进行了针对人类的高蛋白考验研究以测试口服本文所述的聚糖是否可以减少源自肠的氨的量。
[0525]
健康受试者由于完整的肝脏代谢(例如，尿素循环能力和无肝脏分流术)和肾功能(例如，尿素和氨排泄功能)而在蛋白质考验后不会发展高氨血症。血清氨水平高度可变，例如，部分由于测量偏差(例如，静脉血在通过存储氨的肌肉后会捕获氨)、分析物的挥发性以及受试者饮食的影响。健康受试者接受为结肠氨生成提供底物的高蛋白饮食(2g/kg蛋白/天，持续4周)考验，并被施用稳定的同位素示踪物(
15
n乳酰脲(lactoureide))以量化肠道细菌衍生的氨。受试者食用所选寡糖组合物、对照、市售的纤维制剂(阳性对照)或作为安慰剂或阴性对照的麦芽糖糊精(mdx)。mdx完全可消化，不会作为细菌发酵的底物到达结肠。在施用
15
n示踪物之前，让受试者(n＝12/组)接受高蛋白饮食7天(磨合)。在第二次施用
15
n示踪物之前，所述饮食继续进行另外的16天，同时逐步调高聚糖制剂的剂量。将受试者的剂量从9g/d bid逐步提高到36g/d bid(总计72g/天)。收集血液、尿液和粪便样本。
[0526]
这项研究的结果表明，所选寡糖组合物是安全的，并且总体上具有良好的耐受性(使用胃肠道耐受性调查表(gitq)进行评估，其中肠胃气胀、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹胀、腹鸣、打嗝和胃灼热的胃肠道症状的严重程度和出现频率以及排便的频率和紧迫性在每日问卷中记录)。
[0527]
还通过腹泻评分来评估所选寡糖组合物的耐受性(图2)。在每天的7分bristol粪便评分调查表中评估每个受试者的粪便组成。如图2所示，所选的寡糖组合物具有与安慰剂相同或更少的报告腹泻的受试者，而可商购的阳性对照纤维导致报告腹泻的受试者增加，在最高剂量的12个受试者中有10个报告了腹泻。
[0528]
在高蛋白饮食的背景下，麦芽糖糊精对照增加了
15
n氮的排泄，而所选的寡糖组合物和阳性对照纤维与对照组相比(p＝0.002)，尿液中
15
n氮的排泄减少了30
‑
40％。所选的寡糖组合物和阳性对照纤维对尿液中
15
n
‑
尿素排泄的减少相对于对照显著(分别为p＝0.0343和p＝0.0002)，而效果大小相似(减少30
‑
40％)。
15
n尿液氨的排泄是可变的，没有统计学显著性，但显示出相似的减少趋势。
[0529]
在4周内每天2x10 g和2x15 g乳果糖可使正常饮食中健康受试者的
15
n氮的尿排泄量相比于基线降低12
‑
22％(de preter等人，liment pharmacol ther(2006)23,963
–
974)。在he患者的面对面试验中，乳果糖和利福昔明分别将血氨降低了33％和32％(paik等人，yonsei medical journal卷46，第3部分，第399
‑
407页，2005年)。在一项研究中，乳果糖将动脉血氨降低了23％(60名he患者)，并显示在10天内53％的患者he完全逆转(sharma等人，journal of gastroenterology and hepatology 32(2017)1234
–
1239)。对于本文测试的所选寡糖组合物观察到的源自肠的氨的减少，尿液
15
n
‑
氮排泄减少30
‑
40％，表明该减少是临床相关的，并且本文所述的所选寡糖组合物可用于降低血液氨。
[0530]
所选的寡糖组合物不会引起严重的腹泻，表明降氮效果不是由腹泻驱动的氮冲洗引起的，而可能是微生物类群变化和/或相关氮代谢的效果。阳性对照纤维的效果可能主要是由于阳性对照纤维引起的腹泻(以及物理冲洗出氮)。腹泻是不良的副作用。
[0531]
所选择的寡糖组合物因此可以用于治疗患有与高氨血症相关的疾病(例如，he(例如，ohe)和ucd)的受试者以及有发展为高氨血症的风险(例如，mhe)的受试者。
[0532]
实施例3：尿素循环障碍(ucd)患者粪便样品的离体测定中氨水平的降低
[0533]
进行离体测定以评估从尿素循环障碍(ucd)患者收集的人粪便群落利用所选寡糖组合物(如实施例1所述)并减少氨的产生或增加其消耗的能力。从诊断为尿素循环障碍(ucd)的12名患者(患者1至患者12，图3a)中收集粪便样品。
[0534]
人类粪便样本捐赠物被保存在
‑
80℃。为了制备工作储备液，将该粪便样品转移到厌氧室中并使其解冻。在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(p0261，teknova inc.，hollister，ca)、15％甘油中以20％w/v制备每种粪便样品并在
‑
80℃保存。将该20％w/v粪便浆液 15％甘油以2,000x g离心，除去上清液，将沉淀物悬浮在900mg/l氯化钠、26mg/l二水氯化钙、20mg/l六水合氯化镁、10mg/l四水合氯化锰、40mg/l硫酸铵、4mg/l七水合硫酸铁、1mg/l六水合氯化钴、300mg/l磷酸氢二钾、1.5g/l磷酸氢二钠、5g/l碳酸氢钠、0.125mg/l生物素、1mg/l吡哆醇、1m/l泛酸、75mg/l组氨酸、75mg/l甘氨酸、75mg/l色氨酸、150mg/l精氨酸、150mg/l蛋氨酸、150mg/l苏氨酸、225mg/l缬氨酸、225mg/l异亮氨酸、300mg/l亮氨酸、400mg/l半胱氨酸和450mg/l脯氨酸组成的培养基中(theriot cm等人，nat commun.2014；5:3114)，并补充了750μm尿素以制备1％w/v的粪便浆液。
[0535]
将制备的1％w/v粪便浆液暴露于所选寡糖组合物并测试其氨水平的有效降低。在96孔深孔微孔板中以0.5％w/v的终浓度添加所选寡糖组合物，水包含在“未添加聚糖”对照中，每孔终体积为500μl。该聚糖和浆液混合物在厌氧条件下于37℃温育45小时。
[0536]
如本文所述离体温育后，通过以3,716x g离心10分钟使细胞沉淀并将上清液储存在
‑
80℃或干冰上直至对其进行分析。将样品在1500x g的10kda过滤器(acroprep omega 10k,pall corporation,port washington new york)中过滤15分钟并在水中稀释至原始浓度的1/10。使用氨比色测定试剂盒ii(k470,biovision incorporated,milpitas ca)分析样品。所述寡糖组合物的氨比色测定的结果示于图3a。氨水平归一化至阴性对照(水)。
[0537]
在45小时测试的整个粪便样品中，所选的寡糖组合物显示了在所有尿素循环障碍(ucd)患者样品中氨水平的降低(图3a)。具体地，在12个患者群体中的10个，相比于对照，所选的寡糖组合物产生的氨水平降低大于约50％(图3a)。这表明施用所选的寡糖组合物可用于降低尿素循环障碍患者中的氨水平。
[0538]
实施例4：来自肝脏受损患者的粪便样品的离体测定中氨水平的降低
[0539]
进行离体测定以评估从肝脏受损患者收集的人类粪便群落利用所选寡糖组合物(如实施例1所述)并与现有治疗相比减少氨的产生或增加氨消耗的能力。在肠道中，氨是通过微生物脲酶和氨基酸脱氨作用以及肠上皮细胞谷氨酰胺酶产生的(romero
‑
gomez等人，metab brain dis(2009)24:147
–
157)。减少源自肠道微生物群的氨的量可在与高氨血症有关的疾病中具有治疗作用。高氨血症相关的肝性脑病(he)用乳果糖(4
‑
o
‑
β
‑
d
‑
半乳糖基
‑
d
‑
果糖)治疗，其靶向肠道细菌氨对全身氨负荷的贡献。从19名被诊断为酒精、自身免疫性肝炎、慢性乙型肝炎、脂肪肝疾病/nash或铁超负荷和脂肪变性引起的肝性脑病(he)的患者中收集粪便样本。
[0540]
人类粪便样本捐赠物被保存在
‑
80℃。为了制备工作储备液，将该粪便样品转移到厌氧室中并使其解冻。在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)(p0261，teknova inc.，
hollister，ca)、15％甘油中以20％w/v制备每种粪便样品并在
‑
80℃保存。将该20％w/v粪便浆液 15％甘油以2,000x g离心，除去上清液，将沉淀物悬浮在900mg/l氯化钠、26mg/l二水氯化钙、20mg/l六水合氯化镁、10mg/l四水合氯化锰、40mg/l硫酸铵、4mg/l七水合硫酸铁、1mg/l六水合氯化钴、300mg/l磷酸氢二钾、1.5g/l磷酸氢二钠、5g/l碳酸氢钠、0.125mg/l生物素、1mg/l吡哆醇、1m/l泛酸、75mg/l组氨酸、75mg/l甘氨酸、75mg/l色氨酸、150mg/l精氨酸、150mg/l蛋氨酸、150mg/l苏氨酸、225mg/l缬氨酸、225mg/l异亮氨酸、300mg/l亮氨酸、400mg/l半胱氨酸和450mg/l脯氨酸组成的培养基中(theriot cm等人，nat commun.2014；5:3114)，并补充了750μm尿素以制备1％w/v的粪便浆液。
[0541]
将制备的1％w/v粪便浆液暴露于所选的寡糖组合物或乳果糖中，并测试其氨水平的有效降低。将寡糖组合物和乳果糖以0.5％w/v的终浓度添加到96孔深孔微孔板中，“无添加的聚糖”对照中包含水，每孔终体积为500μl。将测试化合物和浆液混合物在厌氧条件下于37℃温育45小时。
[0542]
如本文所述离体温育后，通过以3,716x g离心10分钟使细胞沉淀，并将上清液储存在
‑
80℃或干冰上直至对其进行分析。将样品在10kda过滤器(acroprep omega 10k,port washington new york)中以1500x g过滤15分钟，并在水中稀释至原始浓度的1/10。使用氨比色测定试剂盒ii(k470,biovision incorporated,milpitas ca)分析样品。寡糖组合物和乳果糖的氨比色测定的结果示于图3b。氨水平归一化至阴性对照(水)。
[0543]
在45小时测试的整个粪便样品中，所述寡糖组合物显示出在19个肝脏受损患者样品中的18个样品中氨水平降低(图3b)。在19个患者群体中的14个患者中，所述寡糖组合物降低氨水平的表现优于乳果糖(图3b)。这表明寡糖组合物的施用可用于降低肝脏受损患者的氨水平。
[0544]
实施例5：由一水右旋糖或70ds玉米右旋糖浆以100g规模生产寡糖组合物
[0545]
开发了以100克规模合成实施例1
‑
4中所述的所选寡糖组合物的过程。如下所述，该过程允许从葡萄糖源，例如右旋糖一水合物或玉米右旋糖浆液开始合成所选的寡糖组合物。该过程使用了带有加热罩的多颈反应器，该加热罩配置有顶置搅拌器。探针热电偶通过隔膜放置在容器中以使探针尖端位于搅拌叶片上方，并且不与反应容器的壁接触。
[0546]
该过程以右旋糖一水合物(100克，干固体基)或95de、70ds玉米右旋糖浆液(100克，干固体基)作为d( )葡萄糖使用进行。当使用右旋糖一水合物生产寡糖时，冷凝器最初配置为重熔反应配置(re
‑
flux reaction configuration)。当使用70ds玉米右旋糖浆生产寡糖时，该设备最初配置用于蒸馏。
[0547]
根据该过程，首先在多颈反应容器中装入109.9g右旋糖一水合物粉末(或142.9g 70ds 95de玉米糖浆)，以为反应提供100g干葡萄糖。
[0548]
将温度控制器设置为130℃，并搅拌容器内容物以促进均匀的热传递并融化糖固体。在环境(大气压)压力下，将糖浆的温度升至约130℃。
[0549]
当反应容器中加入右旋糖一水合物时，一旦糖浆的温度约为130℃，冷凝器回流系统便转换为蒸馏配置。当反应容器中装入70ds玉米右旋糖浆时，并且当糖浆达到130℃时，将冷凝器回流系统保持在蒸馏配置。
[0550]
接下来，在容器中装入7克(干固体基)低聚催化剂以生成反应混合物。在某些情况下，所述催化剂以湿形式(例如，标称水分含量为45
–
50wt％
h2o)处理。催化剂的确切水分含量通常是根据每个实验确定的，例如，使用水分分析天平(例如，mettler
‑
toledo mj
‑
33)。
[0551]
加入催化剂后，通过hplc追踪反应确定，在连续混合下将体系在约130℃保持约4小时。接下来，在保持恒定搅拌的同时关闭加热。
[0552]
然后通过缓慢加入约60ml的热(～80℃)去离子(di)水来淬灭反应，以稀释并冷却产物混合物，直到其最终浓度为约70wt％的溶解固体为止。通常，当所述寡糖组合物被冷却和稀释时，调节将水添加到产物混合物中的速率以控制混合物粘度。
[0553]
稀释后，将所述寡糖组合物冷却至约60℃。然后由通过100微米筛网或烧结玻璃过滤器的真空过滤除去催化剂，以获得最终的寡糖组合物。
[0554]
实施例6：由一水右旋糖生产10kg规模的寡糖组合物
[0555]
本实施例证实了在22l水平混合反应器中以10kg规模合成实施例1
‑
4中所述的所选寡糖组合物。
[0556]
将约10kg食品级右旋糖一水合物装入装有热油夹套的22l水平犁式混合器(littleford
‑
day,lexington,ky)中。通过在30rpm连续搅拌并逐渐加热至约120℃的温度来熔化所述右旋糖。然后将1.27kg(以干固体基计为0.70kg)固体酸催化剂(例如，包含磺酸部分的苯乙烯
‑
二乙烯基苯，例如，二乙烯基苯，例如，树脂)添加到反应混合物中以形成混合悬浮液。在大气压下，在三小时内将反应温度逐渐升高至约130℃，同时保持在30rpm连续搅拌。该反应在130℃保持7小时。然后将热的去离子水以6ml/min的速度逐渐添加到该反应混合物中，直到反应器内容物的温度降至120℃，然后以150ml/min的速度直到反应器内容物的温度降至110℃，然后以480ml/min的速度，直到总共添加6kg的水，并且反应器内容物的温度降至低于100℃。将反应器内容物进一步冷却至低于85℃，然后通过100目筛网将反应器排空，以从寡糖组合物中除去固体酸催化剂。回收了约12kg的产物。
[0557]
将寡糖组合物在去离子水中进一步稀释至约35wt％的浓度，然后通过流过阳离子交换树脂(monosphere 88h)柱、阴离子交换树脂(monosphere 77wba)柱、脱色聚合物树脂(optipore sd
‑
2)和阴离子交换树脂(monosphere 77wba)柱纯化。然后通过真空旋转蒸发将得到的纯化物浓缩至最终浓度为约75wt％固体以得到纯化的寡糖组合物。
[0558]
实施例7：使用全甲基化分析确定糖苷键分布
[0559]
根据下文所述的方案，使用全甲基化分析来确定所选寡糖组合物的样品(如实施例1
‑
4所述)的糖苷键分布。实施例5、6和14的制备方法制备的所选寡糖组合物的样品使用此过程分析。
[0560]
此过程中使用的试剂包括甲醇、乙酸、硼氘化钠、碳酸钠、二氯甲烷、异丙醇、三氟乙酸(tfa)和乙酸酐。此过程中使用的装置包括加热模块、干燥设备、为毛细管柱配备并配有rid/msd检测器的气相色谱仪和30米的(restek)。所有推导过程均在通风橱中完成。
[0561]
醛糖醇乙酸酯的制备
[0562]
a.标准制备
[0563]
制备以下标准分析物的1mg/ml溶液：阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和肌醇。通过将50μl阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖或半乳糖与20μl
肌醇在小瓶中混合来制备每种标准品。随后将该标准品冻干。
[0564]
b.样品制备
[0565]
通过将100
‑
500μg所选寡糖组合物(以分析天平称重)与20μg(20μl)肌醇在小瓶中混合来制备每个寡糖样品。
[0566]
c.水解
[0567]
将200μl 2m三氟乙酸(tfa)加入每个寡糖样品中。将装有样品的小瓶盖紧并在加热模块上于121℃温育2小时。2小时后，将样品从加热模块取出并冷却至室温。然后将该样品用n2/空气干燥。加入200μl的异丙醇(ipa)并再次用n2/空气干燥。将此水解步骤(在121℃添加tfa持续2小时；用异丙醇洗涤)重复两次。
[0568]
如样品所述，类似地使用tfa对标准品进行水解。
[0569]
d.还原和乙酰化
[0570]
在1m氢氧化铵中制备10mg/ml硼氘化钠溶液。将200μl的此溶液添加到每个寡糖样品中。然后将样品在室温下温育至少一小时或过夜。与硼氘化钠溶液一起温育后，将5滴冰醋酸添加到样品中，然后添加5滴甲醇。然后将样品干燥。将500μl的9：1meoh：hoac添加到样品中，然后干燥(重复两次)。然后将500μl meoh添加到样品中，然后干燥(重复一次)。这在样品瓶侧面产生了硬皮白色残留物。
[0571]
然后将250μl乙酸酐添加到每个样品瓶中，并将样品涡旋至溶解。向每个样品中加入230μl的浓tfa，并将样品在50℃温育20分钟。将样品从热源移开并冷却至室温。加入约1ml异丙醇，并将样品干燥。然后，加入约200μl异丙醇，并再次干燥样品。然后将约1ml的0.2m碳酸钠添加到每个样品中，并轻轻混合。最后将约2ml二氯甲烷添加到每个样品中，然后将其涡旋并短暂离心。丢弃水性顶层。加入1ml水并将样品涡旋并短暂离心。重复此步骤，然后除去有机层(底部)并转移到另一个小瓶中。使用n2/空气将每个样品浓缩至约100μl的最终体积。然后将1μl最终样品注入gc
‑
ms。
[0572]
gc温度程序sp2330用于gc
‑
ms分析。初始温度为80℃，初始时间为2.0分钟。第一次升温速率为30℃/min，最终温度为170℃且最终时间为0.0分钟。第二次升温速率为4℃/min，最终温度为240℃且最终时间为20.0分钟。
[0573]
箱守法(hakomori)甲基化分析多糖和寡糖的糖基连接
[0574]
a.naoh碱的制备
[0575]
在玻璃螺旋顶管中，将100μl的50/50naoh溶液和200μl的无水meoh合并。塑料移液管用于naoh，玻璃移液管用于meoh。将该溶液短暂涡旋，加入约4ml无水的dmso，然后再次涡旋该溶液。离心该管以浓缩溶液，然后从沉淀物中吸出dmso和盐。重复前两个步骤约四次，以除去沉淀中的所有水。从管的侧面除去所有白色残留物。除去所有残留物并澄清沉淀后，加入约1ml无水dmso并将溶液涡旋。然后所述碱就可以使用了。每次需要时，都要重新制备所述碱。
[0576]
b.全甲基化
[0577]
通过将600
‑
1000μg所选寡糖组合物(以分析天平称重)与200μl dmso混合来制备每个样品。将样品搅拌过夜直至寡糖组合物溶解。
[0578]
向样品中加入等量的naoh碱(400μl)，然后将该样品放回搅拌器中并充分混合10分钟。将100μl碘甲烷(ch3i)添加到样品中。将该样品在搅拌器上混合20分钟，然后重复前
面的步骤(添加naoh碱和碘甲烷)。
[0579]
将约2ml超纯水添加到样品中并将该样品充分混合，以致浑浊。将移液器的尖端放在试管底部的样品溶液中并用极少量的空气鼓泡ch3i。随着ch3i的鼓泡，样品变得清澈。将移液器移至溶液周围以确保所有ch3i均已消失。然后加入约2ml的二氯甲烷，并将该溶液通过涡旋充分混合30秒。然后将样品离心并除去顶部的水层。加入约2ml水并将样品混合，然后短暂离心，然后除去顶部的水层。重复添加二氯甲烷和水。除去有机底层并转移到另一管中，使用n2干燥。使用醛糖醇乙酸酯(alditol acetate)继续进行分析。
[0580]
c.水解
[0581]
将200μl 2m三氟乙酸(tfa)加入每个寡糖样品中。将装有样品的小瓶盖紧并在加热模块上于121℃温育2小时。2小时后，将样品从加热模块取出并冷却至室温。然后将该样品用n2/空气干燥。加入200μl的异丙醇(ipa)并再次用n2/空气干燥。将此水解步骤(在121℃添加tfa持续2小时；用异丙醇洗涤)重复两次。
[0582]
d.还原和乙酰化
[0583]
在1m氢氧化铵中制备10mg/ml硼氘化钠溶液。将200μl的此溶液添加到每个寡糖样品中。然后将样品在室温下温育至少一小时或过夜。与硼氘化钠溶液一起温育后，将5滴冰醋酸添加到样品中，然后添加5滴甲醇。然后将样品干燥。将500μl的9：1meoh：hoac添加到样品中，然后干燥(重复两次)。然后将500μl meoh添加到样品中，然后干燥(重复一次)。这在样品瓶侧面产生了硬皮白色残留物。
[0584]
然后将250μl乙酸酐添加到每个样品瓶中，并将样品涡旋至溶解。向样品中加入230μl的浓tfa，并将样品在50℃温育20分钟。将样品从热源移开并冷却至室温。加入约1ml异丙醇，并将样品干燥。然后，加入约200μl异丙醇，并再次干燥样品。然后将约1ml的0.2m碳酸钠添加到样品中并轻轻混合。最后将约2ml二氯甲烷添加到样品中，然后将其涡旋并短暂离心。丢弃水性顶层。加入1ml水并将样品涡旋并短暂离心。重复此步骤，然后除去有机层(底部)并转移到另一个小瓶中。使用n2/空气将每个样品浓缩至约100μl的最终体积。然后将1μl最终样品注入gc
‑
ms。
[0585]
gc温度程序sp2330用于gc
‑
ms分析。初始温度为80℃，初始时间为2.0分钟。第一次升温速率为30℃/min，最终温度为170℃且最终时间为0.0分钟。第二次升温速率为4℃/min，最终温度为240℃且最终时间为20.0分钟。
[0586]
实施例8：使用全甲基化分析建立糖苷键分布的过程
[0587]
使用实施例7中所述的方法收集十批脱单体化的寡糖组合物的全甲基化数据(其中所述寡糖组合物是通过实施例5中所述的过程生产的)。根据实施例9中所述的方法对这些批次进行脱单体。该分析的结果列于表4中。
[0588]
对于每个全甲基化数据集，确定表4中列出的所有峰的auc的总和值。
[0589]
对于表4中列出的每个峰，将峰的auc除以所有峰的auc的总和值，将其转换为百分比格式至三位有效数字，然后记录。
[0590]
给定数据集中记录的百分比值的总和被确认为100％。
[0591]
表4中列出了每个峰的平均值，该平均值是使用标准公式根据所有数据集确定的。
[0592]
表4中列出了每个峰的标准偏差，该偏差是使用标准公式根据所有数据集确定的。
[0593]
表4列出了所选寡糖组合物每个峰的可接受范围，其确定为小于(mean_p1 5*std_
p1)和大于(mean_p1
‑
5*std_p1)
[0594]
表4.所选寡糖组合物的单体基团的平均mol％
[0595][0596][0597]
还使用实施例7中介绍的方法收集了实施例14中所述方法制备的五批寡糖组合物的全甲基化数据。该分析的结果列于表6中。
[0598]
表6.所选寡糖组合物的单体基团的最大和最小mol％
[0599][0600]
实施例9：脱单体化过程
[0601]
将使用实施例5中的方法生产的各批纯化的寡糖组合物在旋转蒸发仪上浓缩至约50bx(通过白利度折光仪(brix refractometer)测量)。使用粗头注射器将所得浓缩糖浆(200mg)加载到teledyne isco redisep rf gold amine柱(11克固定相)上。也可以使用其他类似的色谱柱，例如biotage snap kp
‑
nh catridges。然后将浓缩的糖浆在配备elsd检测器的biotage isolera上纯化(使用超过55倍柱体积的20/80至50/50(v/v)去离子水/acn流动相梯度洗脱)。也可以使用其他快速色谱系统，例如teledyne isco rf。流速是根据制造商针对色谱柱和系统的规格设置的。在～20柱体积单体级分完全洗脱后，将流动相设置为100％水，直到寡糖组合物的其余部分洗脱并收集。含非单体的级分通过旋转蒸发浓缩以得到脱单体产物。未改性和脱单体的组合物的sec
‑
hplc如图4所示。
[0602]
实施例10：使用varian unity inova nmr机进行hsqc分析程序
[0603]
根据下文所述的方案，使用varian unity inova nmr确定所选寡糖组合物的样品(如实施例1
‑
4所述)的hsqc nmr谱。使用本文所述的nmr方法分析了所选寡糖组合物的158种制剂。如实施例6中所述，在22
‑
升反应中生产了148种这些制剂；在189
‑
升(50
‑
加仑)反应中生产了五种制剂，并且在2,840
‑
升(750
‑
加仑)反应(如实施例14所述)中制备了五种制剂。以较大规模(189
‑
升和2,840
‑
升)生产的寡糖批次未脱单体。如实施例9所述，将一部分以22
‑
升生产的寡糖制剂脱单体化。
[0604]
方法
[0605]
样品制备：
[0606]
将25mg所选寡糖组合物的样品溶于300ul的d2o中，其中0.1％丙酮作为内标。然后将溶液放入3mm nmr管中。
[0607]
nmr实验：
[0608]
在运行于499.83mhz(125.69mhz 13c)的配备了具有z轴梯度的xdb宽带探头的varian unity inova中对每个样品进行了分析，调至13c，并在25℃运行。对每个样品进行多重编辑梯度增强的1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)实验，该实验使用回波
‑
反回波方案进行相干选择。使用以下脉冲序列图以及采集和处理参数得到每个样品的nmr谱图：
[0609]
脉冲序列图
[0610][0611]
采集参数
[0612]
1h载波频率＝4ppm
[0613]
13c载波频率＝65ppm
[0614]
采集维度中的点数＝596
[0615]
采集维度中的频谱范围＝6.00ppm至2.03ppm
[0616]
间接维度中的点数＝300个复杂点
[0617]
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
[0618]
循环延迟＝1秒
[0619]
单键1h
‑
13
c耦合常数＝jch＝146hz
[0620]
扫描次数＝8
[0621]
温度＝298k
[0622]
溶剂＝d2o
[0623]
处理参数
[0624]
直接维度中的窗函数＝高斯展宽，7.66hz
[0625]
间接维度中的窗函数＝高斯展宽26.48hz
[0626]
处理＝直接维度中512个复杂点，间接维度中1024个复杂点
[0627]
谱图分析：
[0628]
使用mestrelab research(santiago de compostela,spain)的mnova软件包对所得谱图进行分析。该谱图参比于内标丙酮信号(1h
–
2.22ppm；13c
–
30.8ppm)，并使用regions2d方法在f2和f1维度上进行定相。在f2和f1维度上都应用了使用90度位移正弦的衍射控象法(apodization)。对于每个谱图，使用具有椭圆积分形状的“预定义积分区”，通过将其各自的峰积分来量化各个信号(c
‑
h相关性)。将得到的积分区表和每个谱图的值归一化为100的总值，以使该值代表总和的百分比。选择峰积分区以避免与单体相关的峰。
[0629]
结果
[0630]
所选寡糖组合物的158份制剂(使用实施例6的方法以22
‑
l规模生产的148种制剂；五批189
‑
l(50
‑
加仑)规模生产的所选寡糖组合物；五批使用实施例14所述方法以2,840
‑
l(750
‑
加仑)规模生产的所选的寡糖组合物)使用上述nmr方法分析。总的来说，这些批次包
含以下nmr峰信号：
[0631][0632][0633]
相对于所有信号1
‑
14的总auc确定信号1
‑
14的每个单独信号的曲线下面积(auc)。确定了以22
‑
l规模生产的148种所选寡糖组合物的信号1
‑
14的的auc。表7列出了总结148种制剂的hsqc nmr分析的汇总结果的统计数据。
[0634]
表7.以22
‑
l规模生产的所选寡糖的148种制剂的hsqc nmr信号1
‑
14的auc汇总统计
[0635]
[0636][0637]
对于以50
‑
加仑和750
‑
加仑规模(如实施例14中所述)生产的所选寡糖组合物的10种制剂，确定积分区域的每个峰的相对大小(auc)。表8列出了汇总了10种总制剂的hsqc nmr分析的汇总结果的统计数据。
[0638]
表8.以50
‑
加仑和750
‑
加仑规模生产的所选寡糖的10种制剂的hsqc nmr信号1
‑
14的auc统计数据
[0639][0640][0641]
实施例11.尺寸排阻色谱
[0642]
通过sec hplc确定所选寡糖组合物(如实施例1
‑
4中所述)的批次和样品的重均分子量(mww)、数均分子量(mwn)和多分散指数(pdi)。
[0643]
方法
[0644]
这些方法涉及配备有两个串联的agilent pl aquagel
‑
oh 20(7.5x 300mm，5μm)色谱柱的带有折射率(ri)检测器的agilent 1100。
[0645]
流动相(0.2m nano3)通过称取34g nano3(acs级试剂)并溶于2000ml去离子(di)水(来自miliq滤水器)中制备。将该溶液通过0.2μm的过滤器过滤。
[0646]
d
‑
( )葡萄糖(分析标准品，sigma
‑
aldrich，目录号47829)、pps
‑
pul342(mp：342)、pps
‑
pul1.3k(mp：1080)、pps
‑
pul6k(mp：6100)、pps
‑
pul10k(mp：9600)和pps
‑
pul22k(mp：22000)中的每种的聚合物标准溶液(10.0mg/ml)通过称20mg的标准品至单独的20ml闪烁瓶中并向每个小瓶添加2.0ml去离子水来制备。
[0647]
一式两份制备样品a。将约300mg的寡糖样品称入20ml闪烁瓶中并加入10ml的去离子水。将该溶液混合并通过具有0.2μm聚醚砜膜的acrodisc 25mm注射器式过滤器过滤。
[0648]
一式两份制备样品b。将约210mg的寡糖样品称量到20ml闪烁瓶中并加入10ml的去离子水。将溶液混合并通过具有0.2μm聚醚砜膜的acrodisc 25mm注射器式过滤器过滤。
[0649]
在运行样品(柱温和ri检测器均设置为40℃，并打开ri检测器净化)之前至少2小时将流速设置为0.9ml/min。
[0650]
关闭检测器净化，并以0.9ml/min的速率运行泵，直到在运行样品之前获得可接受的基线为止。每个样品的进样量为10μl，运行时间为28分钟。
[0651]
运行由去离子水组成的空白样品。运行每种标准品的样品。运行样品a。运行样品b。
[0652]
15至22分钟之间的峰被积分。对样品色谱图中所示的单体和宽峰(产物)进行积分。将empower 3软件中的校准曲线拟合类型设置为3阶。使用empower 3软件计算宽峰的分子量分布和多分散度。报告产物峰(dp2 )的mw、mn和多分散度。
[0653]
结果
[0654]
使用实施例6中描述的方法生产了八批次的所选寡糖组合物(22l规模)；以50
‑
加仑规模生产了五批次的所选寡糖组合物；以及使用实施例14所述方法(以750
‑
加仑规模)生产的四批次所选寡糖组合物通过使用上述sec方法分析。使用实施例9的方法对使用实施例6的方法生产的所选寡糖批次进行脱单体化。表8、9和10列出了这些批次收集的sec数据。
[0655]
表9.所选生产批次的寡糖的sec数据
[0656][0657]
表10.所选生产批次的寡糖的sec数据
[0658][0659]
表11.所选生产批次的寡糖的sec数据
[0660][0661]
总计，表8、9和10中所选的寡糖批次(22升、189升和2840升批次)的平均mww为1150，这些批次的平均mwn为755，平均多分散度为1.5。mww范围为869
‑
1411(以 /
‑
3标准偏差，从671到1630)，mwn范围为626
‑
863(以 /
‑
3标准偏差，从544到966)和多分散度范围为1.4到1.6。
[0662]
根据实施例14的方法生产的所选寡糖批次的平均mww(表z的2,840
‑
升批次)为963，这些批次的平均mwn为667，平均多分散度为1.4。mww范围为869至1038(以 /
‑
3标准偏差，从483至1442)，mwn范围为626到697(以 /
‑
3标准偏差，456至878)，多分散度范围为1.4至1.5。
[0663]
实施例12.用于确定杂质的sec hplc方法
[0664]
sec hplc用于确定在实施例1
‑
4中描述的所选寡糖组合物的批次和样品中残留的有机酸杂质和相关物质的存在。
[0665]
方法
[0666]
这些方法涉及配备有保护柱(bio
‑
rad microguard cation h cartridge，pin 125
‑
0129或等同物)和bio
‑
rad aminex hpx
‑
87h,300x 7.8mm,9μm,pin 125
‑
0140柱，或等同物的带有折射率(ri)检测器的agilent 1100。
[0667]
流动相(水中25mm的h2so4)是通过在瓶中填充2000ml的去离子水并缓慢添加2.7ml的h2so4制备的。将该溶液通过0.2μm的过滤器过滤。
[0668]
通过在100
‑
ml容量瓶中测量50
±
2mg参考标准品，将流动相加入至100
‑
ml刻度并充分混合来制备标准溶液。
[0669]
一式两份制备所选寡糖组合物的样品(样品a)。将约1000mg的寡糖样品称入10ml容量瓶中，将流动相加至刻度。混合该溶液并通过带有0.2μm聚醚砜膜的pes注射器式过滤器过滤。
[0670]
一式两份制备所选寡糖组合物的样品(样品b)。将约700mg的寡糖样品称入10ml容量瓶中，将流动相加至刻度。混合该溶液并通过带有0.2μm聚醚砜膜的pes注射器式过滤器过滤。
[0671]
在运行样品(柱温设置为50℃和ri检测器温度设置为50℃，并打开ri检测器净化)
之前至少2小时将流速设置为0.65ml/min。
[0672]
关闭检测器净化，并以0.65ml/min的速率运行泵，直到在运行样品之前获得可接受的基线为止。每个样品的进样量为50μl，运行时间为40分钟。
[0673]
运行由去离子水组成的空白样品。标准品、样品a和样品b各自独立运行。
[0674]
对位于7.5min(葡萄糖醛酸)、11.3min(左旋葡聚糖)、11.9min(乳酸)、13.1min(甲酸)、14.2min(乙酸)、31.8min(hmf)和8.3min(葡萄糖)的峰积分。empower 3软件中的校准曲线拟合类型设置为3阶。
[0675]
数据
[0676]
使用上述hplc方法测试实施例1
‑
4中描述的并且通过实施例14中的方法生产的四批所选的寡糖。如实施例14所述，所选的寡糖组合物的批次(批次1至5)的单体百分比分别为14％、18％、17％、15％和13％。
[0677]
表12.所选寡糖生产批次的杂质数据
[0678][0679]
将所选寡糖组合物(表12)的批次1喷雾干燥并分析如本文所述的杂质。发现经喷雾干燥的制剂具有以下杂质分布：<loq乳酸；0.20％甲酸；<loq乙酸；0.53％乙酰丙酸；0.43％的左旋葡聚糖；0.22％的左旋葡聚糖异构体；和<loq hmf。该寡糖制剂具有1.5％的总杂质(不包括单体)。
[0680]
实施例13.用于确定dp1至dp7的sec hplc
[0681]
通过sec hplc确定在实施例1
‑
4中描述的所选寡糖组合物的批次和样品中聚合度(dp)为1、2和3 的寡糖的相对量。
[0682]
方法
[0683]
这些方法涉及配备有保护柱(shodex sugar sp
‑
g 6b guard column 6
×
50mm，10μm，p/n f6700081或等同物)和色谱柱(shodex sugar sp0810,8.0x 300mm,8μm,p/n f6378105或等同物)的带有折射率(ri)检测器的agilent1100。
[0684]
流动相(0.1m nano3)通过称取42.5g nano3(acs级试剂)并将其溶于5000ml去离子(di)水(来自miliq滤水器)中制备。将该溶液通过0.2μm的过滤器过滤。
[0685]
d
‑
( )葡萄糖mp 180，carbosynth ltd standard或等同物(cas#50
‑
99
‑
7)(dp1)；麦芽糖mp 342，carbosynth ltd standard或等同物(cas#69
‑
79
‑
4)(dp2)；麦芽三糖mp 504，carbosynth ltd standard或等同物(cas#1109
‑
28
‑
0)(dp3)；麦芽四糖mp 667，carbosynth ltd standard或等同物(cas#34612
‑
38
‑
9)(dp4)；麦芽五糖mp 828，carbosynth ltd standard或等同物(cas#34620
‑
76
‑
3)(dp5)；麦芽六糖mp 990，carbosynth ltd standard或等同物(cas#34620
‑
77
‑
4)(dp6)；麦芽七糖mp 1153，
carbosynth ltd standard或等同物(cas#34620
‑
78
‑
5)(dp7)；和麦芽八糖mp 1315，carbosynth ltd standard或等同物(cas#6156
‑
84
‑
9)(dp8)中的每种的聚合物标准溶液(10.0mg/ml)通过将10mg每种标准品称重到一个单独的1.5ml离心管中并添加去离子水制成10mg/ml溶液来制备。
[0686]
所选寡糖组合物的样品制备为10mg/ml浓缩样品或稀释至2.5
‑
3.5brix的水性样品。
[0687]
在运行样品(柱温设置为70℃和ri检测器温度设置为40℃，并打开ri检测器净化)之前至少2小时将流速设置为1.0ml/min。
[0688]
关闭检测器净化，并以1.0ml/min的速率运行泵，直到在运行样品之前获得可接受的基线为止。每个样品的进样量为5μl，运行时间为15分钟。
[0689]
由去离子水组成的空白样品、各个标准品和样品各自独立运行。
[0690]
将样品运行中4至9.2分钟之间的每个峰(对应于各个标准品)积分。所述标准品的叠加图在图5中示出。empower 3软件中的校准曲线拟合类型设置为3阶。使用这些方法确定所选寡糖组合物样品的dp1、dp2和dp3 值。
[0691]
结果
[0692]
对以22
‑
l规模(7批次，实施例6)、50
‑
加仑规模(3批次)和750
‑
加仑规模(3批次，实施例14)生产的所选寡糖组合物的样品进行了如上所述的测定。表13提供了这些分析的结果。
[0693]
表13.所选的寡糖生产批次的dp1、dp2和dp3 级分
[0694][0695]
总体而言，所选寡糖组合物的样品表现出14.41％(
±
2.93％)的平均单体(dp1)百分比和8.38％(
±
1.31％)的平均二糖(dp2)百分比。根据实施例14的制备方法生产的所选寡糖批次显示出平均单体(dp1)百分比为16.87％(
±
1.51％)和平均二糖(dp2)百分比为9.41％(
±
0.81％)。
[0696]
实施例14.由右旋糖一水合物以780kg规模生产寡糖组合物
[0697]
在具有顶置搅拌的2,840l(750
‑
加仑)的反应器中，以780kg的规模合成实施例1
‑
4中所述的所选寡糖组合物。
[0698]
为开始生产，在室温将约780kg食品级右旋糖一水合物粉末和约100kg固体酸催化剂(例如，包含磺酸部分的苯乙烯
‑
二乙烯基苯，例如，dowex fpc16 ups h ion exchange resin)添加到反应器并加热和连续搅拌至内部温度为130℃。将该内部温度保持2小时。将馏出物冷凝到冷凝液收集罐中。水冷凝物与进料糖(右旋糖)的摩尔比通常在0.4至0.9之间。然后将反应器中的寡糖混合物用热纯净水稀释至约50％的固体浓度，通过100
‑
μm过滤器过滤，然后转移到转鼓中。
[0699]
将粗物质用纯净水加回到反应器中，并在25℃搅拌10分钟。依次用以下离子交换树脂对所得溶液进行处理以减少痕量金属离子、颜色和有机酸：dowex 88(h)树脂(处理60分钟)、dowex optipore sd
‑
2吸附树脂(处理240分钟)和dowex monosphere 77树脂(处理60分钟)。每种树脂搅拌后，将物料通过滤袋进行处理或离心以除去树脂，然后将其添加回反应器中。
[0700]
然后在65℃真空中将最终溶液浓缩至70
‑
74
°
bx(即约70％固体浓度，其中1
°
bx为100克水溶液中1克蔗糖)。释放真空，并在排出之前拉出样品以验证浓度。将纯化的寡糖组合物冷却至55℃，并将所得溶液通过20
‑
μm的过滤器过滤，并收集到容器中。该容器在环境温度保存。表14总结了以2,840升规模生产的所选寡糖中的四个批次的某些特征。
[0701]
表14.以2840升生产的所选寡糖批次的特征
[0702][0703]
然后，通过在容器中混合纯化的组合物和美国药典(usp)级水直至将其以50％的固体浓度完全溶解，将纯化的寡糖组合物转化为固体粉末。然后将溶液喷雾干燥，并将所得粉末转移到低密度聚乙烯(ldpe)袋中。可以将这种材料包装在，例如，两个ldpe袋之间具有约280g干燥剂的扭绑(twist
‑
tied)双ldpe袋中，并储存在，例如，处于控制的室温的30
‑
加仑的高密度聚乙烯(hdpe)容器中。
[0704]
实施例15.可溶性、不溶性和总膳食纤维的测定
[0705]
根据aoac 2011.25的方法(aoac international,aoac official method2011.25,insoluble,soluble,and total dietary fiber in foods)测量实施例1
‑
4中所述的所选寡糖组合物的批次的膳食纤维的量。还根据食品化学品法典(fcc)测量了这些寡糖批次的百分比右旋糖当量(de)(干基)。分析了五批寡糖，每批具有不同的dp1单体水平。所述批次之一没有除去单体。所述寡糖批次中的四个批次除去单体，使它们具有10％的单体、5％的单体、3％的单体或<1％的单体。分析结果如表15所示。
[0706]
表15.以2840升生产的所选寡糖批次的特征
[0707][0708]
实施例16.在患有ucd的人类受试者中研究所选寡糖组合物
[0709]
如实施例1
‑
4中所述的所选寡糖组合物的安全性和胃肠道耐受性，在开放
‑
标签单
‑
中心临床研究中的四名具有良好控制的尿素循环障碍(ucd)的人类成年受试者中评估。该研究还旨在评估所述寡糖组合物对ucd患者氮代谢的影响。受试者至少14岁，无n
‑
乙酰谷氨酸合成酶(nags)缺乏、肝移植或其他可能引起高氨血症(ha)的医学病史。受试者首先经历了磨合期(第
‑
7至
‑
1天)，然后在第0至3天(5.7mg/kg)接受了乳糖
‑
[15n]
‑
酰脲(一种稳定的同位素示踪物)以量化肠道细菌
‑
衍生氨。在第21至24天(5.7mg/kg)再次给予这种同位素示踪物。乳糖
‑
[15n]
‑
酰脲被用作氮代谢的标志物。这种稳定的同位素示踪物不能被人类酶消化，但是是结肠细菌产生的酶的底物，结肠细菌将尿素和乳糖部分分离，然后将尿素水解为氨。消耗示踪物后产生15n氨指示结肠细菌(脲酶)酶活性。在四个阶段(第1阶段(第4
‑
8天)，第2阶段(9
‑
13天)，第3阶段(14
‑
18天)和第4阶段(19
‑
24天))，向受试者施用增加剂量的所述寡糖组合物(一名受试者最多42克/天的最大剂量，三名受试者最多72克/天的最大剂量)以最大化耐受性。最后一剂之后是从第25天到第32天的清除和安全随访阶段。在研究期间的各个时间点从受试者收集血液、尿液和粪便，以进行安全性评估并评估肠道氮代谢的生物标志物。在第25天通过不良事件(ae)报告和胃肠道耐受性调查表(gitq)对受试者的安全性评估进行收集。
[0710]
结果表明，使用胃肠道耐受性调查表(gitq)评估的所选寡糖组合物是安全的，并且总体耐受性良好。受试者报告了轻度的肠胃气胀和胃肠道声音，但未报告任何临床显著的安全性信号。没有出现治疗突发不良事件，也没有因不良事件而发生的终止治疗。
[0711]
数据表明，所述寡糖组合物可以在ucd人类受试者中降低氨。如果粪便中排泄的示踪物增加和/或尿液中排泄的示踪物量减少，则表明氨的降低。受试者粪便中的15n示踪物普遍增加(相对于基线％)，且受试者尿液中的15n示踪物降低(相对于基线％)。在三分之二的可评估的患者中(即提交所需样品的患者)尿液中标记氮的排泄减少。受试者中尿液标记的15n排泄的平均减少量为15.27％(sd 23.66)。四分之三的受试者的粪便中标记的氮的量增加。受试者粪便中标记的15n排泄的平均变化为39.39％(sd 26.79)。在整个研究过程中，受试者的血浆nh3水平得到控制，并保持在正常(基线)水平。
[0712]
这些数据表明，所选寡糖组合物可以用于治疗患有ucd的受试者和其他具有与高
氨血症相关的症状的受试者。
[0713]
等同形式和术语
[0714]
可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素，一个或多个限制的情况下适当地实践本文说明性描述的公开内容。因此，例如，在本文的每种情况中，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不意图在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在本公开的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案、任选的特征具体公开了本公开，但是本领域技术人员可以借助属于本公开的概念进行修改和变型，并且可以将这样的修改和变型视为在本公开的范围内。
[0715]
另外，在根据马库什组或替代的其他分组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开可因此根据马库什组或其他组的任何单个成员或成员的子组来描述。
[0716]
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该/所述”以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何对于实施本发明是必不可少的未要求保护的要素。
[0717]
本文描述了本发明的实施方案。在阅读前述说明之后，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得明显。
[0718]
发明人预期熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同形式。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变化中的任何组合。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。
技术特征：
1.寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述组合物的特征在于，包含信号1、3和4的多重编辑梯度增强的1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)nmr谱图，各个信号具有表5所列的性质：2.权利要求1的组合物，其中信号1、3和4定义如下：3.权利要求1或2所述的组合物，其中，所述谱图进一步包含1
‑
2个选自信号8和9的信号，各个信号具有表5所列的性质：4.权利要求3所述的组合物，其中信号8和9定义如下：4.权利要求3所述的组合物，其中信号8和9定义如下：5.权利要求1
‑
4中任一项所述的组合物，其中所述谱图进一步包含1
‑
6个选自信号6、7、11、12、13和14的信号，各个信号具有表5所列的性质：
6.权利要求5所述的组合物，其中信号6、7、11、12、13和14定义如下：7.权利要求1
‑
6中任一项所述的组合物，其中所述谱图进一步包含1
‑
3个选自信号2、5和10的信号，各个信号具有表5所列的性质：和10的信号，各个信号具有表5所列的性质：8.权利要求7所述的组合物，其中信号2、5和10定义如下：
9.权利要求1
‑
8中任一项所述的组合物，其中信号1
‑
14各自进一步通过1h积分区和
13
c积分区表征，其定义如下：10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述nmr谱图是通过对组合物样品进行多重编辑梯度增强的1h
‑
13
c异核单量子相干(hsqc)实验而得到的，该实验使用回波
‑
反回波方案通过以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干选择：脉冲序列图
采集参数1h载波频率＝4ppm
13
c载波频率＝65ppm采集维度中的点数＝596采集维度中的频谱范围＝6.00ppm至2.03ppm间接维度中的点数＝300个复杂点间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm循环延迟＝1秒单键1h
‑
13
c耦合常数＝j
ch
＝146hz扫描次数＝8温度＝298k溶剂＝d2o处理参数直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66hz间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48hz处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点。11.权利要求1
‑
10中任一项所述的组合物，其中所述nmr谱通过使所述组合物样品进行hsqc nmr来获得，其中所述样品为在d2o中的溶液。12.权利要求1
‑
11中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp11。13.权利要求12的组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp4至约dp8。14.权利要求12的组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp6。15.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含16％至24％的右旋糖当量(干基)。16.权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含13％至27％的右旋糖当量(干基)。17.权利要求1
‑
16中任一项所述的寡糖组合物，其中该组合物包含50％至95％的总膳食纤维(干基)。18.权利要求1
‑
16中任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物包含至少60％、70％、80％或90％的总膳食纤维(干基)。19.寡糖组合物，其包含多种寡糖，每种寡糖包含多种单体基团；所述多种寡糖，其包含选自基团(1)
‑
(7)中的两种或更多种类型的单体基团，其中所选择的基团以限定的摩尔百分比(mol％)范围存在于所述多种寡糖中：(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少18.94mol％的单体基团；(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.74mol％的单体基团；(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.01
‑
2.59mol％的单体基团；(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于1.00mol％的单体基团；和
(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团；其中所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是(4)或(7)。20.权利要求19所述的组合物，其中所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于0.70mol％的单体基团。21.权利要求19所述的组合物，其中所述两种或更多种类型的单体基团中的至少一种是：(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.50mol％的单体基团。22.权利要求19
‑
21中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；和(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团。23.权利要求19
‑
22中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.40mol％的单体基团。24.权利要求19
‑
22中任一项所述的组合物，其包含选自基团(1)
‑
(7)的三种、四种、五种、六种或七种类型的单体基团。25.权利要求19
‑
24中任一项所述的组合物，其进一步包含一种或多种类型的选自基团(8)
‑
(12)的单体基团：(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中26.87
‑
46.98mol％的单体基团；(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少6.94mol％的单体基团；(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.43mol％的单体基团；(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于9.66mol％的单体基团；和(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.07
‑
0.85mol％的单体基团。26.权利要求25所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中30.00
‑
40.00mol％的单体基团。27.权利要求25所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.94
‑
9.25mol％的单体基团。28.权利要求25所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少9.10mol％的单体基团。29.权利要求25所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.10mol％的单体基团。30.权利要求25所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于6.00mol％的单体基团；32.权利要求25至30中任一项所述的组合物，其包含选自基团(8)
‑
(12)的一种、两种、三种、四种或五种类型的单体基团。33.权利要求19
‑
32中任一项所述的组合物，其进一步包含选自基团(13)
‑
(15)的一种或多种类型的单体基团：(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中2.35
‑
6.01mol％的单体基团；
(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.06
‑
0.86mol％的单体基团；和(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团。34.权利要求33所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.10mol％的单体基团。35.权利要求33或34所述的组合物，其包含选自基团(13)
‑
(15)的一种、两种或三种类型的单体基团。36.寡糖组合物，其包含多种寡糖，每种寡糖包含多种单体基团；所述多种寡糖包含基团(1)
‑
(15)，其中基团(1)
‑
(15)以限定的摩尔百分比(mol％)范围存在于所述多种寡糖中：(1)2
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.15
‑
9.54mol％的单体基团；(2)6
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少18.94mol％的单体基团；(3)4
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.63
‑
8.74mol％的单体基团；(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.42mol％的单体基团；(5)2,3
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中1.01
‑
2.59mol％的单体基团；(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于1.00mol％的单体基团；(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.72mol％的单体基团；(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中26.87
‑
46.98mol％的单体基团；(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少6.94mol％的单体基团；(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.43mol％的单体基团；(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于9.66mol％的单体基团；(12)2,3,4
‑
吡喃葡萄糖基团，其代表在所述多种寡糖中0.07
‑
0.85mol％的单体基团(13)3,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中2.35
‑
6.01mol％的单体基团；(14)2,3,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中0.06
‑
0.86mol％的单体基团；和(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.61mol％的单体基团。37.权利要求36所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(4)3,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于0.70mol％的单体基团。38.权利要求36或37所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(7)2,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.50mol％的单体基团。39.权利要求36
‑
38中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(6)3,4,6
‑
吡喃葡萄糖四基，其代表在所述多种寡糖中少于0.40mol％的单体基团。40.权利要求36
‑
39中任一项的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(8)t
‑
吡喃葡萄糖单基，其代表在所述多种寡糖中30.00
‑
40.00mol％的单体基团。41.权利要求36
‑
40中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中6.94
‑
9.25mol％的单体基团。42.权利要求36
‑
41中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(9)3
‑
吡喃葡萄糖二基，其代表在所述多种寡糖中至少9.10mol％的单体基团。
43.权利要求36
‑
42中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(10)2,4
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于1.10mol％的单体基团。44.权利要求36
‑
43中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(11)2,6
‑
吡喃葡萄糖/4,6
‑
吡喃葡萄糖三基，其代表在所述多种寡糖中少于6.00mol％的单体基团。45.权利要求36
‑
44中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含：(15)2,3,4,6
‑
吡喃葡萄糖五基，其代表在所述多种寡糖中少于0.10mol％的单体基团。46.权利要求19
‑
45中任一项所述的组合物，其中所述单体基团的摩尔百分比是使用全甲基化测定法确定的，其中该全甲基化测定法包括使用气相色谱
‑
质谱(gc
‑
ms)分析，任选地，其中包含组合物的样品通过gc
‑
ms进行分析，同时在20.0分钟内以4℃/min的速度从170℃加热到240℃。47.包含多种寡糖的寡糖组合物，所述寡糖包括式(i)：其中r独立地选自氢以及式(ia)、(ib)、(ic)和(id)：其中式(ia)、(ib)、(ic)和(id)中的r独立地如上式(i)中所定义；其中所述组合物通过包括以下的方法制成：(a)形成包含右旋糖制剂与催化剂的反应混合物，所述催化剂包含酸性质子；和(b)通过向反应混合物传递足够的热量以将该反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物产生的净水冷凝物相对于在(a)中负载前的右旋糖制剂中总右旋糖的摩尔比在0.35
‑
1.0的范围内来促进该反应混合物中酸催化的寡糖的形成，其中所述反应混合物保持在0.5
‑
1.5atm范围的压力。48.权利要求47所述的组合物，所述方法进一步包括：(c)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低。49.权利要求47或37所述的组合物，所述方法进一步包括：(d)从所述酸催化剂中分离出至少一部分寡糖。50.权利要求47
‑
49中任一项所述的组合物，其中所述酸催化剂是包含酸性质子的固体基质。51.权利要求50所述的组合物，其中所述酸催化剂是具有根据表1的一种或多种物理和化学性质的强酸阳离子交换树脂，和/或所述催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。
52.权利要求50或51所述的组合物，其中所述催化剂具有45
‑
50重量百分比的标称含水量。53.权利要求47
‑
52中任一项所述的组合物，其中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.001
‑
0.25的量存在。54.权利要求47
‑
52中任一项所述的组合物，其中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.0016
‑
0.022的量存在。55.权利要求47
‑
54中任一项所述的组合物，其中，在步骤(a)中，所述右旋糖制剂包含右旋糖单体。56.权利要求47
‑
54中任一项所述的组合物，其中，在步骤(a)中，所述右旋糖制剂包含右旋糖一水合物或70ds玉米糖浆。57.权利要求47
‑
56中任一项所述的组合物，其中所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。58.权利要求47
‑
46中任一项所述的组合物，其中所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少95％。59.权利要求47
‑
58中任一项所述的组合物，其中所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的至少98％。60.权利要求47
‑
48中任一项所述的组合物，其中所述多种包括式(i)的寡糖占总寡糖组合物的100％。61.权利要求47
‑
60中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物中不超过1％、2％、3％、5％、7％或10％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。62.权利要求47
‑
60中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物中不超过1％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。63.权利要求47
‑
60中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物中不超过5％的单体与式(i)或式ia、ib、ic和id不同。64.权利要求61
‑
63中任一项所述的组合物，其中与式(i)或式ia、ib、ic和id不同的寡糖组合物的单体包含衍生的或化学改变的(例如降解的)糖单元(例如无水形式)。65.权利要求47
‑
64中任一项所述的组合物，其中将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物产生的净水冷凝物相对于在(a)中负载前的右旋糖制剂中总右旋糖的摩尔比在0.40
‑
0.90的范围内。66.权利要求47
‑
54中任一项所述的组合物，其中，在步骤(b)之前，在合适的条件下将所述反应混合物的温度从室温逐渐升高至该反应混合物的沸点以实现均质性和均匀的热传递。67.权利要求47
‑
66中任一项所述的组合物，其中所述反应混合物包含少于1％的山梨糖醇。68.权利要求47
‑
67中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于0.1％的山梨糖醇。69.权利要求47
‑
68中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含至少90％、95％或99％的右旋糖。70.权利要求47
‑
69中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为
约dp4至约dp8。71.权利要求70所述的组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(dp)为约dp5至约dp6。72.权利要求47
‑
71中任一项所述的组合物，其中步骤(b)进一步包括通过蒸发从所述反应混合物中除去水。73.权利要求48
‑
72中任一项所述的组合物，其中在步骤(c)中，所述水是去离子水。74.权利要求48
‑
73中任一项所述的组合物，其中在步骤(c)中，所述水的温度约为60
‑
100℃。75.权利要求48
‑
74中任一项所述的组合物，其中在步骤(c)中，在足以避免所述混合物固化的条件下将水加入所述反应混合物中。76.权利要求49
‑
75中任一项所述的组合物，其中在步骤(d)中，所述分离包括通过过滤除去催化剂。77.权利要求49
‑
76中任一项所述的组合物，其中步骤(d)包括在过滤之前将所述反应混合物冷却至低于约85℃。78.权利要求48
‑
77中任一项所述的组合物，其中所述方法进一步包括用去离子水将(d)的寡糖组合物稀释至约5
‑
65重量百分比的浓度。79.权利要求78所述的组合物，其中所述方法进一步包括步骤(e)至(g)中的一个或多个(例如，两个或更多个，或三个)：(e)使稀释的组合物通过阳离子交换树脂；(f)使稀释的组合物通过阴离子交换树脂；和(g)使稀释的组合物通过脱色聚合物树脂；其中(e)、(f)和(g)中的每一个可以以任何顺序进行一次或多次。80.权利要求47
‑
79中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含的总水含量水平低于室温储存时微生物生长所必需的水平。81.权利要求80所述的组合物，其中所述组合物包含的总水含量在24
‑
33重量百分比范围内。82.权利要求47
‑
81中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的寡糖具有在852
‑
1475范围内的mww(g/mol)。83.权利要求82所述的组合物，其中所述组合物中的寡糖具有在855
‑
1100范围内的mww(g/mol)。84.权利要求47
‑
83中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的寡糖具有在612
‑
912范围内的mwn(g/mol)。85.权利要求84所述的组合物，其中所述组合物中的寡糖具有在612
‑
710范围内的mww(g/mol)。86.权利要求47
‑
85中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物具有在2.5
‑
7.5的范围内的ph。87.权利要求86所述的组合物，其中所述寡糖组合物具有在2.5
‑
5.0的范围内的ph。88.权利要求47
‑
87中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含约75至约95重量百分比(干基)的具有两个或更多个单体(dp2 )的寡聚物。
89.权利要求88所述的组合物，其中所述组合物包含约80至约90重量百分比(干基)的具有两个或更多个单体(dp2 )的聚合度的寡聚物。90.权利要求47
‑
89中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于25％的单体。91.权利要求47
‑
89中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于15％的单体。92.权利要求47
‑
89中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于3％的单体。93.权利要求47
‑
89中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于1％的单体。94.权利要求47
‑
93中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含少于3％w/w的杂质。95.权利要求47
‑
94中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物在人体中基本上是不可吸收的。96.权利要求47
‑
95中任一项所述的组合物，其中人体对所述寡糖组合物的消化作用很小。97.权利要求47
‑
96中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含16％至24％的右旋糖当量(干基)。98.权利要求47
‑
96中任一项所述的组合物，其中所述寡糖组合物包含13％至27％的右旋糖当量(干基)。99.权利要求47
‑
96中任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含至少70％、至少80％、至少90％的总膳食纤维(干基)。100.权利要求47
‑
96中任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含65％至95％的总膳食纤维(干基)。101.权利要求47
‑
100中任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物不含可检测量的可溶性膳食纤维沉淀物(sdfp)、不溶性膳食纤维(idf)和/或高分子量膳食纤维(hmwdf)。102.在人类受试者中降低氨水平的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的根据权利要求1
‑
101中任一项所述的寡糖组合物。103.权利要求102所述的方法，其中所述氨水平是所述人类受试者中的血氨水平。104.权利要求102或103所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有尿素循环障碍。105.权利要求102
‑
104中的任一项所述的方法，其中所述受试者是儿童人群。106.在患有或已诊断出患有与高氨血症相关的疾病或病症的人类受试者中降低高氨血症危机比率的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的根据权利要求1
‑
101中任一项所述的寡糖组合物。107.权利要求106所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有尿素循环障碍。108.权利要求106或107所述的方法，其中所述受试者是儿童人群。109.权利要求106所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有肝性脑病(he)。110.权利要求109所述的方法，其中所述受试者是老年人群。
111.权利要求109或110所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有肝硬化。111.权利要求109
‑
111中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有感染。112.在人类受试者中治疗脑病的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的根据权利要求1
‑
101中任一项所述的寡糖组合物。113.权利要求112所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有肝性脑病(he)。114.权利要求112或113所述的方法，其中所述受试者是老年人群。115.权利要求112或114中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有肝硬化。116.权利要求112
‑
115中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有失代偿性肝硬化。117.权利要求112
‑
116中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有感染。118.治疗患有或已经被诊断出患有肝硬化的人类受试者的方法，其包括向所述人类受试者施用根据权利要求1至101中任一项所述的寡糖组合物。119.权利要求118所述的方法，其中，所述受试者患有或已经被诊断出患有失代偿性肝硬化。120.权利要求118或119所述的方法，其中所述受试者患有或已经被诊断出患有显性肝性脑病(ohe)。121.权利要求106
‑
120中任一项所述的方法，其中所述受试者已经或正在接受乳果糖和/或利福昔明治疗。122.在人类受试者中治疗尿素循环障碍(ucd)的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1
‑
101中任一项所述的寡糖组合物。123.权利要求122所述的方法，其中所述受试者是儿童人群。124.生产包含多种寡糖的寡糖组合物的方法，该方法包括：(a)在搅拌条件下，将包含右旋糖单体的右旋糖制剂加热至120℃至145℃范围内的温度；(b)形成包含右旋糖制剂与催化剂的反应混合物，该右旋糖制剂包含右旋糖单体，该催化剂包含酸性质子，其中酸性质子与右旋糖单体的摩尔比在0.001
‑
0.25的范围内；以及(c)通过向所述反应混合物传递足够的热量以将该反应混合物保持在其沸点直到所述反应混合物中右旋糖单体的重量百分比小于30％来促进该反应混合物中酸催化的寡糖的形成，其中所述反应混合物保持在0.5
‑
1.5atm范围的压力。125.权利要求124所述的方法，其进一步包括：(d)用水淬灭该反应混合物，同时使该反应混合物的温度达到100℃或更低；以及(e)从酸催化剂中分离寡糖。126.权利要求124或125所述的方法，其中，在步骤(a)中，所述酸催化剂以使得酸性质子与右旋糖的摩尔比为0.0016
‑
0.022的量存在。
127.权利要求124
‑
126中任一项所述的方法，其中将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物中右旋糖单体的重量百分比小于25％。128.权利要求124
‑
127中任一项所述的方法，其中将所述反应混合物保持在其沸点直到该反应混合物中右旋糖单体的重量百分比在13
‑
18％的范围内。
技术总结
本公开的方面涉及寡糖组合物及其制备方法。还提供了使用寡糖组合物作为微生物组代谢疗法以降低氨水平和治疗与高氨血症有关的疾病(例如，尿素循环障碍和肝性脑病)的方法。尿素循环障碍和肝性脑病)的方法。尿素循环障碍和肝性脑病)的方法。
技术研发人员：C.M.刘 J.M.杰里迈亚 A.里奥博米罗夫 M.赫克特
受保护的技术使用者：卡莱多生物科技有限公司
技术研发日：2019.08.21
技术公布日：2021/6/29
转载请注明原文地址:https://doc.8miu.com/read-411.html
