一种莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT38的多克隆抗体、应用和方法与流程

专利2022-05-09 70

本发明属于生物技术领域，尤其是一种莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38的多克隆抗体制备、应用和方法。

背景技术：

莱茵衣藻(chlamydomonasreintmrdtii)是一种能进行光合作用的单细胞真核藻类，又称为莱哈衣藻、莱氏衣藻，素有“绿色光合酵母”之称。莱茵衣藻细胞呈椭圆形或圆形，直径为7-10μm，其主要的细胞结构有细胞核、蛋白核、眼点、叶绿体和鞭毛等。在其染色体中，有两种配对型，即mt和mt^-正负两种配子；其上有两根等长的可运动纤毛，大约11μm。其上的纤毛(鞭毛)是以细胞微管为核心而组装形成的一种细胞器官。其主要由纤毛膜、轴丝以及介于纤毛膜和轴丝之间的基质三部分组成。纤毛膜在组成上与细胞膜有一定的差异性，它是由细胞膜向外突出延伸形成的；基质部分中含有许多的蛋白质及其复合物，比如马达蛋白和ift蛋白，它们能够在纤毛膜和轴丝之间的基质区域流动，参与许多蛋白的调控机制；而轴丝是由微管蛋白及其附属蛋白共同组成的结构。

莱茵衣藻模式生物中，从细胞体上分离下来的纤毛，通过蛋白质组学的分析可以发现，纤毛中含有1000多种蛋白，但是众所周知纤毛的结构中没有蛋白质合成的场所，因此纤毛的组装和发生需要一种特殊的蛋白转运系统，这种系统即为“纤毛内运输(intraflagellartransport，ift)”。

纤毛内运输系统主要有两个部分组成，分别是ift蛋白复合物(iftcomplexes)和马达蛋白。ift运输机制又被称为“ift火车”，马达蛋白为其提供动力，而ift蛋白复合物就相当于负责运输货物的“车厢”。马达蛋白分为两种：一种是kinesin-ii驱动蛋白，它是一个异源三聚体，在莱茵衣藻中为fla10、fla8、fla3，负责将蛋白从纤毛基部向纤毛顶端进行正向运输；另一种是dynein-2/1b驱动蛋白，它的结构比较复杂，由重链、中间链、轻中间链和轻链组成，负责沿着微管的正端向负端运动，即从纤毛顶端向纤毛基部的运输。

ift蛋白复合体是ift运输机制的核心组成部分，它的鉴定主要是利用了衣藻突变体fla10-1的温度敏感性。cole等研究发现，马达蛋白kinesin-ii在特定温度下会失活，特定条件下分离纤毛进行蛋白质差异分析，发现一个很大的蛋白复合物只存在于纤毛组分当中。这个蛋白复合物会随着离子强度的升高(50mmnacl条件下)分成两个亚蛋白复合体，即ift-a和ift-b。目前所发现的ift-a蛋白复合物包括6个亚基，即ift43，ift121，ift122，ift139，ift140和ift144；ift-b蛋白复合物包括16个亚基，即ift20，ift22，ift25，ift27，ift38，ift46，ift52，ift54，ift56，ift57，ift70，ift74，ift80，ift81，ift88及ift172。

ift38(哺乳动物中又称为cluap1)是一种属于ift-b2复合物的纤毛蛋白。2019年，nozaki等使用可见的免疫沉淀测定法(vip)，鉴定出了ift38与bbsome复合体之间有相互作用，而且只有当其中的bbs1、bbs2、bbs9共同形成亚复合体的时候，ift38与其之间的相互作用能力最强。katoh等的研究发现，ift38在ift-b的组分中充当着枢纽亚基的作用，它可以与外周亚复合物中的ift20和ift80直接相互作用，并且可以和ift52、ift57、ift88形成一个连接四聚体，充当核心复合物和亚复合物之间的衔接子。2014年，lee等在以斑马鱼为模式生物研究cluap1时构建了一个cluap1^au5突变体，该突变体的cluap1基因具有一个无义突变，并且确定了感光器官的功能依赖于cluap1基因。感光细胞的缺陷是由于其变性引起的，而纤毛发生的缺陷先于感光细胞变性之前。在该斑马鱼突变体中，其视网膜中感光层消失，并表现出轻度的小眼症，感光细胞形成外部片段的能力受损，并且最终退化；在形态学方面，突变体有明显的腹侧弯曲，并且其游泳膀胱不会发生膨胀。除了出现感光缺陷，在嗅觉上皮细胞中纤毛的生成也出现了缺陷，可能会导致嗅觉功能的丧失。作者在非洲爪蟾表皮细胞中表达了cluap1-gfp融合蛋白，发现cluap1以类似于ift20的模式定位于基体沿着轴突双向移动且和ift20在同一粒子中共迁移，说明在脊椎动物中cluap1基因经历了ift转运并作为ift-b复合物的一部分。

目前关于ift38蛋白的相关研究，大都是在模式生物斑马鱼和小鼠中进行的。由于物种的不同，可能会导致抗体的特异性识别有所差异；所以制备莱茵衣藻ift38蛋白的多克隆抗体，对于在莱茵衣藻模式生物中开展研究是必不可少的。

通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一种莱茵衣藻ift144蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用(cn110885371a)，该莱茵衣藻ift144蛋白多克隆抗体的氨基酸序列如序列表中seqidno：1所示。该方法包括：构建重组表达载体，重组表达载体的核苷酸序列包括如序列表中seqidno：2所示的序列；将重组表达载体转化至感受态细胞中，得到重组表达菌株；诱导重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻ift144蛋白；将莱茵衣藻ift144蛋白作为抗原，并进行免疫处理，得到莱茵衣藻ift144蛋白多克隆抗体。该莱茵衣藻ift144蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻ift144蛋白，且效价高和特异性好；该制备方法通过pcr扩增克隆得到编码莱茵衣藻ift144蛋白的cdna序列，再通过构建重组表达载体，从而通过体外表达和纯化获得了制备抗体的抗原。

2、一种莱茵衣藻ift80蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用(cn110938142a)，该莱茵衣藻ift80蛋白多克隆抗体的氨基酸序列如序列表中seqidno：1所示。该方法包括：构建重组表达载体，重组表达载体的核苷酸序列包括如序列表中seqidno：2所示的序列；将重组表达载体转化至感受态细胞中，得到重组表达菌株；诱导重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻ift80蛋白；将莱茵衣藻ift80蛋白作为抗原，并进行免疫处理，得到莱茵衣藻ift80蛋白多克隆抗体。该莱茵衣藻ift80蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻ift80蛋白，且效价高和特异性好；该制备方法通过pcr扩增克隆得到编码莱茵衣藻ift80蛋白的cdna序列，再通过构建重组表达载体，从而通过体外表达和纯化获得了制备抗体的抗原。

通过对比，本发明专利申请相与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38的多克隆抗体、应用和方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38的多克隆抗体，其制备步骤如下：

(1)构建重组表达载体，该重组表达载体的核苷酸序列包括seoidno.2所示的序列；

(2)将所述表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞bl21中，得到重组表达菌株；诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻ift38蛋白；

(3)将所述莱茵衣藻ift38蛋白经过亲和纯化后作为免疫原免疫动物，得到莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体；

其中，所述莱茵衣藻ift38蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno.1所示。

进一步地，所述构建重组表达载体的方法为：

将莱茵衣藻cdna作为模板，进行pcr扩增，获得莱茵衣藻ift38目的基因；

将所述莱茵衣藻ift38目的基因与原核表达载体pet-28a( )连接，得到重组表达载体pet-28a( )-ift38。

进一步地，所述原核表达载体为pet-28a( )；在pcr扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，且所述上游引物序列如seqidno.3所示，所述下游引物如seqidno.4所示。

进一步地，所述步骤(2)的具体方法为：

将构建成功的重组表达载体转入e.colibl21中，挑取单克隆到含有相应抗性的lb液体培养基中，37℃过夜培养，以1：20的体积扩大培养，当600nm处的吸光值a值达到0.6～0.8时，加入1m异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行诱导，使其终浓度至0.2mm，且所述诱导的温度为25℃，所述诱导的时间为8h，将收集的菌体高压破碎，全蛋白、上清和沉淀进行12％sds-page分析蛋白表达情况，得到所述莱茵衣藻ift38融合蛋白。

进一步地，所述步骤(3)中纯化的方法为：

将扩大培养后的6×his-ift38菌体经过第一次离心，得到菌体沉淀；

将菌体沉淀用过膜水重悬，再次离心收集菌体沉淀；用ph8.0且含有20mmol/l咪唑的tris-hcl溶液溶解菌体沉淀并进行高压破碎，将破碎后的菌液离心后取上清液；

将上清液用0.45μm滤膜过滤后加入预先平衡好的蛋白纯化柱中，室温条件下结合2h，用含20mmol/l咪唑的tris盐溶液漂洗3次，最后用ph8.0且含500mmol/l咪唑的tris-hcl溶液洗脱；

将上述收集的全蛋白沉淀、流穿、漂洗，洗脱液用12％sds-page检测，选择浓度＞0.5mg/ml，纯度＞85％的目标蛋白用于后续动物免疫实验。

进一步地，所述蛋白纯化柱为nisepharose^tm6fastflow蛋白纯化柱。

进一步地，所述免疫处理的方法为：

以6×his-ift38融合蛋白为免疫原，与完全弗氏佐剂混合，形成油包水；得到第一混合液，将第一混合液采用背部皮下注射法每次打8-10个点，形成3次加强免疫，每次10-14天，最后1次加强免疫后耳静脉取血，间接elisa法测定免疫效价合格后，颈动脉取血，收集抗血清；

或者，免疫动物为新西兰白兔。

进一步地，所述抗血清经过如下处理：

ift38抗体的纯化；

将每1ml抗血清与10ml结合缓冲液混合后,加入预先平衡好的含有proteina填料的结合柱中,室温结合2h后,用结合缓冲液漂洗至1×g-250不变色为止,最后用洗脱缓冲液洗脱进行洗脱，以得到纯度更高的抗体。

如上所述的多克隆抗体在莱茵衣藻ift38蛋白的检测和/或功能鉴定方面中的应用。

利用如上所述的多克隆抗体检测ift38蛋白在莱茵衣藻中的分布的方法，步骤如下：

以莱茵衣藻固定制片后，于室温下利用牛血清白蛋白封闭1-2h，用纯化后的ift38多克隆抗体(1：200稀释比)室温孵育2-4h，用0.5×pbs溶液洗涤10次，每次3分钟；再用荧光标记羊抗兔二抗室温避光孵育1h，用0.5×pbs溶液洗涤10次，每次3分钟；封片后在荧光显微镜下观察ift38蛋白在莱茵衣藻中的定位并拍照。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻ift38蛋白，且具有效价高和特异性好的特点；该莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体可用于莱茵衣藻ift38蛋白的检测以及后续以莱茵衣藻为模式生物的ift38蛋白的功能研究。

2、为探讨ift38在纤毛组装和发生过程中所起的作用，本发明制备了莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38的多克隆抗体，通过westernblot检测莱茵衣藻中的ift38蛋白，结果表明ift38多克隆抗体的特异性较好，为研究ift38在纤毛组装中的功能和在纤毛病发生机制中的作用奠定了基础。

3、本发明是首次对莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38进行了原核表达、纯化及多克隆抗体制备，并且得到了特异性较好的多克隆抗体。本发明利用莱茵衣藻cdna为模板，通过设计的引物进行pcr扩增得到莱茵衣藻ift38基因的目的片段，插入到原核表达载体，得到重组表达载体。采用的原核表达载体，具有如下特征：一、所述原核表达载体为双酶切的大肠杆菌表达载体pet-28a( )。经诱导后分泌蛋白且诱导时间短。二、与酵母系统相比，大肠杆菌表达系统分泌蛋白的不会使其过糖基化，具有良好的遗传稳定性。

4、本发明以实验室保存的莱茵衣藻cdna为模板，通过设计的引物做pcr扩增，得到大小为1329bp的ift38基因的目的片段；将pcr扩增得到的ift38片段和pet-28a( )载体同时用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，将目的基因与载体片段回收，以摩尔质量比为1∶3室温用t4dna连接酶连接1h；转化至e.colixl1-blue，在含有相应抗性的平板上37℃培养14～16h；挑取转化子至lb液体培养基中过夜培养，提取质粒后用ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切验证，条带大小与预期一致则进行测序验证。经检索本发明在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。

附图说明

图1为本发明中实施例提供的pcr扩增与载体的双酶切验证图(即ift38的cds序列pcr扩增及重组质粒双酶切验证)；其中，a中，m为1kb的dnaladder；1为pcr扩增ift38目的片段；b中，m为1kb的dnaladder；1为ecorⅰ和xhoⅰ双酶切质粒pet-28a( )-ift38；

图2为本发明中实施例提供的融合蛋白成功表达图(重组pet-28a( )-ift38融合蛋白表达及亲和纯化的检测结果)；其中，a为重组蛋白pet-28a( )-ift38的表达情况分析图，横坐标中m为蛋白质标志物；横坐标1为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导前全蛋白；2为iptg诱导后全蛋白；3为iptg诱导后上清；4为iptg诱导后沉淀；b为融合蛋白亲和纯化的检测结果图，其中，横坐标中m为蛋白质标志物；1为elutionbuffer1(5μl)；2为elutionbuffer2(5μl)；3为elutionbuffer3(5μl)；4为elutionbuffer4(5μl)；

图3为本发明中实施案例提供的elisa法评定抗体效价图(抗血清效价的elisa检测结果)，图中横坐标为稀释倍数，纵坐标为酶标仪测定450nm处的a值；

图4为本发明中实施案例提供的抗血清sds-page纯度检测图(抗血清sds-page纯度检测)，图中，左侧纵坐标标注为蛋白质标准分子量；

图5为本发明中实施案例提供的莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体与莱茵衣藻cc-125样品分离鞭毛所得鞭毛蛋白的westernblot测定结果图(ift38抗体特异性检测结果)，其中，左侧纵坐标标注为蛋白质标准分子量。pre-immuune为免疫前血清检测莱茵衣藻野生型藻种cc-125中ift38蛋白；affinitypurified:proteina为纯化后血清检测莱茵衣藻野生型藻种cc-125中ift38蛋白；

图6为本发明中实施案例提供的免疫荧光检测ift38蛋白在莱茵衣藻纤毛中的定位结果图(免疫荧光检测ift38蛋白在莱茵衣藻纤毛中的定位)。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种莱茵衣藻纤毛内运送蛋白ift38的多克隆抗体，其制备步骤如下：

(1)构建重组表达载体，该重组表达载体的核苷酸序列包括seoidno.2所示的序列；

(2)将所述表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞bl21中，得到重组表达菌株；诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻ift38蛋白；

(3)将所述莱茵衣藻ift38蛋白经过亲和纯化后作为免疫原免疫动物，得到莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体；

其中，所述莱茵衣藻ift38蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno.1所示。

较优地，所述构建重组表达载体的方法为：

将莱茵衣藻cdna作为模板，进行pcr扩增，获得莱茵衣藻ift38目的基因；

将所述莱茵衣藻ift38目的基因与原核表达载体pet-28a( )连接，得到重组表达载体pet-28a( )-ift38。

较优地，所述原核表达载体为pet-28a( )；在pcr扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，且所述上游引物序列如seqidno.3所示，所述下游引物如seqidno.4所示。

较优地，所述步骤(2)的具体方法为：

将构建成功的重组表达载体转入e.colibl21中，挑取单克隆到含有相应抗性的lb液体培养基中，37℃过夜培养，以1：20的体积扩大培养，当600nm处的吸光值a值达到0.6～0.8时，加入1m异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropy-beta-d-thiogalactoside,iptg)进行诱导，使其终浓度至0.2mm，且所述诱导的温度为25℃，所述诱导的时间为8h，将收集的菌体高压破碎，全蛋白、上清和沉淀进行12％sds-page分析蛋白表达情况，得到所述莱茵衣藻ift38融合蛋白。

较优地，所述步骤(3)中纯化的方法为：

将扩大培养后的6×his-ift38菌体经过第一次离心，得到菌体沉淀；

将上述收集的全蛋白沉淀、流穿、漂洗，洗脱液用12％sds-page检测，选择浓度＞0.5mg/ml，纯度＞85％的目标蛋白用于后续动物免疫实验。

较优地，所述蛋白纯化柱为nisepharose^tm6fastflow蛋白纯化柱。

较优地，所述免疫处理的方法为：

或者，免疫动物为新西兰白兔。

较优地，所述抗血清经过如下处理：

ift38抗体的纯化；

将每1ml抗血清与10ml结合缓冲液混合后,加入预先平衡好的含有proteina填料的结合柱中,室温结合2h后,用结合缓冲液漂洗至1×g-250不变色为止,最后用洗脱缓冲液洗脱(收集管中提前加入中和液)进行洗脱，以得到纯度更高的抗体。

如上所述的多克隆抗体在莱茵衣藻ift38蛋白的检测和/或功能鉴定方面中的应用。

利用如上所述的多克隆抗体检测ift38蛋白在莱茵衣藻中的分布的方法，步骤如下：

具体地，相关制备及检测实施例如下：

一种莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体的制备方法，该方法包括：

构建重组表达载体，以实验室保存的莱茵衣藻cdna为模板，进行pcr扩增，获得莱茵衣藻ift38目的基因，引物序列如序列表中seqidno.3和seqidno.4所示的序列；

将重组表达的载体转化至感受态细胞中，得到重组表达菌株；

诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻ift38蛋白；

将所述莱茵衣藻ift38蛋白作为抗原，并进行免疫处理，得到所述莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体。

具体地，构建重组表达载体的方法包括：以实验室保存的莱茵衣藻cdna为模板，通过设计的引物做pcr扩增，得到莱茵衣藻ift38目的基因。

将所述莱茵衣藻ift38目的基因与原核表达载体链接，得到重组表达载体。

具体地，所述原核表达载体为双酶切的大肠杆菌表达载体pet-28a( )-ift38。

具体地，所述诱导表重组表达菌株的蛋白表达的方法包括：将所述重组表达菌株37℃摇床中培养14～16h，质粒提取后进行双酶切验证，正确则进行测序。挑取单克隆接种至种子培养基中，37℃培养过夜，以1：20的比例接种至发酵培养基中，当od600为0.7～0.9时，加入0.2mm的iptg，25℃，220rpm，8h进行培养。12000g、2min离心收集菌体，pbs清洗3次后，经超声破碎后，分离上清及沉淀，进行12％sds-page，对ift38蛋白在诱导前后及上清，沉淀的表达情况进行分析，从而获得最优表达条件。

具体地，感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。

进一步地，感受态细胞为大肠杆菌bl21感受态细胞。

具体地，所述方法还包括：将所述莱茵衣藻ift38蛋白进行纯化；所述纯化的方法包括：将所述得到莱茵衣藻ift38融合蛋白进行亲和纯化，将扩大培养后的6×his-ift38菌体经过第一次离心，得到菌体沉淀；

将菌体沉淀用过膜水重悬，再次离心收集菌体沉淀；用含有20mmol/l咪唑的tris-hcl溶液(ph8.0)溶解菌体沉淀并进行高压破碎，将破碎后的菌液离心后取上清液；

将所述上清液用0.45μm滤膜过滤后加入预先平衡好的nisepharose^tm6fastflow蛋白纯化柱中，室温条件下结合2h，用含20mmol/l咪唑的tris盐溶液漂洗3次，最后用含500mmol/l咪唑的tris-hcl溶液(ph8.0)洗脱；

将上述收集的全蛋白，沉淀、流穿、漂洗，洗脱液用12％sds-page检测，选择浓度＞0.5mg/ml，纯度＞85％的目标蛋白用于后续动物免疫实验；

具体地，免疫处理的方法包括：以6×his-ift38融合蛋白为免疫原，与完全弗氏佐剂混合，形成油包水。得到第一混合液，将所述第一混合液采用背部皮下注射法每次打8-10个点，形成3次加强免疫，每次10-14天，最后1次加强免疫后耳静脉取血，间接elisa测定免疫效价合格后，颈动脉取血。收集抗血清。

进一步地，免疫动物为新西兰白兔。

该莱茵衣藻ift38蛋白多克隆抗体的应用，该应用包括将莱茵衣藻ift38蛋白的多克隆抗体用于莱茵衣藻ift38蛋白的检测和功能鉴定。

本实施例中，构建重组表达载体的方法包括：

通过pcr扩增获得1329bp的ift38目的基因，连接至载体后，转化挑取单克隆提取质粒并酶切验证。以实验室保存的莱茵衣藻cdna为模板，通过设计的上、下游引物进行pcr扩增，pcr扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，扩增程序为预变性95℃，5min；(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，1min)×35个循环；延伸72℃，5min。上游引物为5’-ccgaattcatgtcgttcagagagc-3’，下游引物为5’-ggctcgagttagaagtcattgtc-3’。用ecori和xhoi同时将目的基因，表达载体pet-28a( )进行双酶切，将回收得到大小为1329bp的ift38目的基因和载体片段分别按照摩尔质量1﹕3的比例室温连接1h，转化至e.colixl1-blue中后涂板至相应抗性平板上，挑取阳性转化子至lb液体培养基中，37℃摇床中培养14～16h，质粒提取后进行双酶切验证，正确则进行测序。结果如图1所示，1a显示pcr扩增产物，条带单一且大小正确；图1b显示重组表达质粒pet-28a( )-ift38阳性克隆双酶切验证结果，双酶切后两条带大小与预期果一致，经测序验证结果正确，说明表达载体pet-28a( )-ift38构建成功。

将构建成功的重组表达载体pet-28a( )-ift38转化至e.colibl21中，挑取单克隆接种至种子培养基中，37℃培养过夜，以1：20的比例接种至发酵培养基中，当od600为0.7～0.9时，加入0.2mm的iptg，25℃，220rpm，8h进行培养。12000g、2min离心收集菌体，pbs清洗3次后，经超声破碎后，分离上清及沉淀，进行12％sds-page，对ift38蛋白在诱导前后及上清，沉淀的表达情况进行分析，从而获得最优表达条件。

将诱导表达后的菌体经超声破碎后离心后取上清，上清液用0.22μm滤膜过滤后，加入预先平衡好的nisepharose^tm6fastflow填料柱中，4℃结合2小时，收集流穿液，用漂洗液(20mm咪唑，50mmph7.4tris-hcl，0.5mol/lnacl)漂洗3次后收集漂洗液。最后用含的洗脱液(500mm咪唑，50mmph7.4tris-hcl，0.5mol/lnacl)洗脱目的蛋白，静置5～10min后收集洗脱液，将收集的全蛋白、流穿液、漂洗液、洗脱液进行sds-page检测，并做灰度分析，实验选取纯度大于85％，浓度大于0.5mg/ml的6×his-ift38融合蛋白用于后续动物免疫实验，结果如图3所示，纯化后经sds-page分析纯化结果，并利用imagej软件进行灰度分析，融合蛋白经纯化后，纯度为95％，浓度可达到0.5mg/ml，符合免疫标准，将足够纯度和浓度的6×his-ift38抗原用于后续动物免疫实验。

采用间接elisa法检测抗血清效价。以包被液稀释6×his-ift38抗原，至终浓度为2μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜。pbs洗涤2次后，封闭液封闭，每孔加200μl，37℃静置2h，后用pbs洗涤1次。抗血清从200倍开始以pbs溶液逐次做2倍梯度稀释，空白对照为pbs，阴性对照为稀释后的抗血清，均为100μl/well，37℃条件下静置1h，pbs洗涤3次，加入pbs稀释20000倍的二抗，100μl/well，37℃静置1h，再用pbs洗涤3次。每孔加100μl显色液，5-15min后，每孔加50μl终止液。最后，双波长(450nm，630nm)处测吸光值，做好数据的记录，并做折线图进行分析。效价值为1/2最大od值所对应的稀释倍数。间接elisa法测抗血清效价，以免疫前血清做阴性对照组，以免疫后抗血清为实验组，检测结果如图3所示，由图3可看出，抗血清效价达到102400。

将离心分离后的抗血清首先经过proteinasepharosetmcl-4b填料进行纯化，专一性的吸附igg，从而去除igg之外的其他抗体分子。纯化方法为：首先取1ml抗血清与10ml结合缓冲液混合，加入预先平衡好的含proteina填料的柱子中，室温结合1h后，用结合缓冲液漂洗至g-250不变色，最后用洗脱缓冲液洗脱，从而得到纯度较高的抗体。结果如图4所示。

以莱茵衣藻cc-125野生型藻种检测抗体特异性。先取20μg微藻做sds-page电泳，转膜，封闭后，以1：1000的比例孵育ift38多克隆抗体，二抗采用1：10000倍稀释hrp标记的羊抗兔igg，最后进行ecl显色。western印迹法检测抗体特异性，结果显示纯化后的抗血清在1：1000的稀释比下，可与莱茵衣藻cc-125样品于相对分子质量约3.8×10⁴da处形成特异性结合条带，以标签蛋白抗体进行western印迹法检测作为对照，可见同样大小的特异性结合条带，同时以免疫前血清做阴性对照。由此可知抗血清可与莱茵衣藻ift38蛋白发生特异性结合(图5)，表明所制备的ift38多克隆抗体特异性良好。

免疫荧光实验对莱茵衣藻内的ift38蛋白进行定位，以莱茵衣藻野生型藻种cc-125固定制片后，5％bsa室温封闭1h，加入纯化后的anti-ift38抗体(1：200稀释)室温孵育4h，0.5×pbs洗液清洗10次，最后加入荧光标记的羊抗兔二抗室温孵育1h，封片后在荧光显微镜下拍照。免疫荧光实验可用于直接观察ift38蛋白在纤毛中的分布，进而对其在纤毛中的作用机制的研究奠定基础。本实验采用免疫荧光技术分析ift38蛋白在纤毛内的分布，由于荧光素所发出的荧光信号能在荧光显微镜下检出，可通过荧光信号检测莱茵衣藻蛋白ift38的分布情况，结果如图6所示，可知纤毛主要分布于纤毛的基体。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

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