经修饰的丝状真菌宿主细胞的制作方法

经修饰的丝状真菌宿主细胞
1.序列表的引用
2.本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及经修饰的丝状真菌细胞，以及用于生产此类细胞的方法，连同生产其中分泌的目的多肽的方法。


背景技术：

4.已经表明，黑曲霉(aspergillus niger)中的citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白，citt。通过内源黑曲霉citt基因的分裂标记基因替代的灭活消除了此真菌分泌柠檬酸盐的能力，并且在通常有利于黑曲霉柠檬酸盐生产的条件下，增加了细胞外草酸盐的积累(odoni d.i.等人aspergillus niger citrate exporter revealed by comparison of two alternative citrate producing conditions[通过比较两种替代柠檬酸盐生产条件揭示了黑曲霉柠檬酸盐出口],2018年4月23日在线发表；https://doi.org/10.1101/259051)。


技术实现要素：

[0005]
本发明涉及分泌目的异源多肽的经遗传修饰的丝状真菌宿主细胞，其中citt编码的柠檬酸盐转运蛋白的表达被改变，优选地降低，甚至更优选地消除。
[0006]
citt基因的灭活可以通过本领域已知的任何适合的基因灭活方法完成。消除或降低citt表达的便利的方法的实例是基于基因替换或基因中断的技术，如odoni d.i.等人中所完成的(见上文)。
[0007]
在曲霉属丝状真菌宿主细胞中citt的灭活出人意料地导致细胞中表达的异源分泌的目的多肽的产量增加。
[0008]
因此，在第一个方面，本发明涉及突变的丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸，其中与非突变的其他等基因(isogenic)或亲本细胞相比，citt基因的表达被改变、降低或消除，其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)，该柠檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性。
[0009]
在第二个方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010]
a)在有助于该分泌的目的多肽的表达的条件下，培养包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸的突变的丝状真菌宿主细胞，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，citt基因的表达被改变、降低或消除，并且其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)，该柠檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3具有至少80％氨基酸序列同一性；以及，任选地
[0011]
b)回收该分泌的目的多肽。
[0012]
在最后一个方面，本发明涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的异源目的多肽的改善的产量和/或生产力，所述方法包括无具体顺序的以下步骤：
[0013]
a)用编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸转化丝状真菌宿主细胞；以及
[0014]
b)通过改变、降低或消除该丝状真菌宿主细胞中citt基因的表达来突变该宿主细胞，其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)，该檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3中所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性。
[0015]
定义
[0016]
cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mrna。
[0017]
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
[0018]
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0019]
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0020]
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0021]
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
[0022]
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
[0023]
成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(诸如n
‑
末端加工、c
‑
末端截短、糖基化、磷酸化等)之后其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同c
‑
末端和/或n
‑
末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核
苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的c
‑
末端和/或n
‑
末端氨基酸)。
[0024]
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
[0025]
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
[0026]
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0027]
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:the european molecular biology open software suite)，rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276
‑
277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼
‑
翁施算法(needleman
‑
wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443
‑
453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和eblosum62(emboss的blosum62版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0028]
(相同的残基x 100)/(比对长度
‑
比对中的空位总数)
[0029]
出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:the european molecular biology open software suite)，rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼
‑
翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0030]
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度
‑
比对中的空位总数)
具体实施方式
[0031]
宿主细胞
[0032]
本发明涉及重组宿主细胞，该宿主细胞包含与一种或多种控制序列可操作地连接的本发明的多核苷酸，该控制序列指导异源目的多肽的产生和分泌。
[0033]
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0034]
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人在以下文献中所定义：ainsworth and bisby’sdictionary of the fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,
id no:3中所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性。
[0042]
在本发明的方面的优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。
[0043]
优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
‑
葡糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β
‑
木糖苷酶。
[0044]
在本发明的优选的实施例中，柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0045]
优选地，该citt基因或其同源物包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少80％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成。可替代地，citt基因或其同源物包含基因组核苷酸序列或由其组成，其cdna序列与seq id no:2所示的cdna序列具有至少80％同一性；优选地与seq id no:2所示的cdna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性。
[0046]
在本发明的优选的实施例中，与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，在第一方面和第二方面的突变的宿主细胞中，分泌的目的多肽产量和/或生产力提高；优选地，与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，产量和/或生产力提高了至少10％，更优选地至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％。
[0047]
核酸构建体
[0048]
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
[0049]
可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0050]
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0051]
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α
‑
淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α
‑
淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(wo 00/56900)、镶片镰孢quinn(wo 00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β
‑
葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β
‑
木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延伸因子，连同na2
‑
tpi启动子(来自曲霉属中性α
‑
淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α
‑
淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
[0052]
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3
’‑
末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
[0053]
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α
‑
葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β
‑
葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β
‑
木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。
[0054]
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区域，其增加该基因的表达。
[0055]
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'
‑
末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
[0056]
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
[0057]
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3
’‑
末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mrna的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
[0058]
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α
‑
葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0059]
控制序列还可以是编码与多肽的n
‑
末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'
‑
末端可以包
含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
[0060]
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0061]
控制序列还可以是编码位于多肽的n
‑
末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α
‑
因子。
[0062]
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的n
‑
末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的n
‑
末端。
[0063]
还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉taka α
‑
淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶i启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶ii启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
[0064]
表达载体
[0065]
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0066]
重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
[0067]
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。
[0068]
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或
多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
[0069]
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adea(磷酸核糖酰氨基咪唑
‑
琥珀羧胺合酶)、adeb(磷酸核糖酰
‑
氨基咪唑合酶)、amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清酸核苷
‑5’‑
磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adea、adeb、amds、hph以及pyrg基因。
[0070]
选择性标记可以是如wo 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph
‑
tk双选择性标记系统。
[0071]
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
[0072]
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
[0073]
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0074]
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人,1991,gene[基因]98:61
‑
67；cullen等人,1987,nucleic acids res.[核酸研究]15:9163
‑
9175；wo 00/24883)。可以根据wo 00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
[0075]
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
[0076]
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人,1989,同上)。
[0077]
citt活性的去除或降低
[0078]
本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，这些方法包括灭活、破坏或缺失编码本发明的柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)的多核苷酸或其一部分，这些方法导致在相同条件
下培养时，与亲本细胞相比突变细胞产生更少的柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)。
[0079]
可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该citt多核苷酸或其同源物的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选的方面，该多核苷酸是灭活的。例如，待修饰或灭活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其一部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。
[0080]
该多核苷酸的修饰或灭活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过对dna序列进行pcr产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。
[0081]
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(uv)照射、羟胺、n
‑
甲基
‑
n'
‑
硝基
‑
n
‑
亚硝基胍(mnng)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(ems)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
[0082]
当使用这些试剂时，诱变一般是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。
[0083]
该citt多核苷酸或其同源物的修饰或灭活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调控元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除、或可读框的变化。此类修饰或灭活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或pcr产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
[0084]
以下描述了用于缺失或破坏靶向基因的方法，例如：miller等人(1985.mol.cell.biol.[分子细胞生物学]5:1714
‑
1721)；wo 90/00192；may,g.(1992.applied molecular genetics of filamentous fungi.[丝状真菌的应用分子遗传学]j.r.kinghorn和g.turner,编著,blackie academic and professional[布莱基学术和专业],第1
‑
25页)；以及turner,g.(1994.vectors for genetic manipulation.[用于基因操作的载体]s.d.martinelli和j.r.kinghorn,编著,elsevier[爱思唯尔],第641
‑
665页)。
[0085]
消除或降低多核苷酸的表达的便利的方法的实例是基于基因替代、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替代内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用选择性标记，如本文描述的那些来破坏该多核苷酸。
[0086]
本发明还涉及抑制具有citt活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链rna(dsrna)分子或者在细胞中表达双链rna(dsrna)分子，其中dsrna包含citt多核苷酸或其同源物的子序列。在一个优选的方面，dsrna长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
[0087]
该dsrna优选地是小干扰rna(sirna)或微小rna(mirna)。在一个优选的方面，该dsrna是用于抑制转录的小干扰rna。在另一个优选方面，该dsrna是用于抑制翻译的微小rna。
[0088]
本发明还涉及此类双链rna(dsrna)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的seq id no:1的多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsrna可以进入细胞并且导致相似的或一致的序列的单链rna(ssrna)(包括内源mrna)的降解。当细胞被暴露于dsrna时，来自同源基因的mrna选择性地被叫做rna干扰(rnai)的过程所降解；参见例如美国专利号5,190,931。
[0089]
本发明的dsrna可以用于基因沉默。在一方面，本发明提供了使用本发明的dsrnai来选择性地降解rna的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsrna分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsrna分子选择性降解rna的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824和6,515,109。
[0090]
这些citt多肽缺陷型突变体细胞作为用于异源分泌的多肽的表达的宿主细胞尤其有用。
[0091]
用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
[0092]
产生方法
[0093]
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
[0094]
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
[0095]
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。
[0096]
可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、sds
‑
page或提取(参见例如，protein purification[蛋白质纯化],janson和ryden编辑,vch publishers[vch出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
[0097]
在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
[0098]
本发明的一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
[0099]
a)在有助于该分泌的目的多肽的表达的条件下，培养包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸的丝状真菌宿主细胞，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，citt基因的表达被改变、减少或消除，并且其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)，该柠檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3具有至少80％氨基酸序列同一性；以及，任选地
[0100]
b)回收该分泌的目的多肽。
[0101]
在优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。
[0102]
优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
‑
葡糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β
‑
木糖苷酶。
[0103]
在本发明的优选的实施例中，柠檬酸盐转运蛋白多肽(citt)包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0104]
优选地，该citt基因或其同源物包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少80％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成。可替代地，citt基因或其同源物包含基因组核苷酸序列或由其组成，其cdna序列与seq id no:2所示的cdna序列具有至少80％同一性；优选地与seq id no:2所示的cdna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性。
[0105]
实例
[0106]
材料与方法
[0107]
除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行dna操纵和转化：sambrook等人(1989),molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],cold spring harbor lab[冷泉港实验室],冷泉港,纽约州；ausubel,f.m.等人(编辑)“current protocols in molecular biology[当代分子生物学实验手册]”,john wiley and sons[约翰
·
威立父子公司],1995；harwood,c.r.和cutting,s.m.(编辑)“molecular biological methods for bacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方法]”.john wiley and sons[约翰威立父子公司],1990。
[0108]
培养基和溶液
[0109]
amg痕量金属溶液由以下构成：0.3g柠檬酸、0.68g zncl2、0.25gcuso4·
5h2o、
0.024g nicl2·
6h2o、1.39g feso4·
7h2o、1.356g mnso4·
5h2o、以及去离子水补足至1升。
[0110]
cove
‑
n
‑
glyx板由以下构成：218g木糖醇、10g甘油、2.02g kno3、50ml cove盐溶液、25g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。
[0111]
cove
‑
n板由以下构成：342.3g蔗糖、20ml cove盐溶液、3g nano3、30g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。
[0112]
cove
‑
n顶层琼脂糖由以下构成：342.3g蔗糖、20ml cove盐溶液、3g nano3、10g低熔点琼脂糖、以及去离子水补足至1升。
[0113]
cove
‑
n jp板由以下构成：30g蔗糖、20ml cove盐溶液、3g nano3、30g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。
[0114]
cove盐溶液由以下构成：26g的kcl、26g的mgso4·
7h2o、76g的kh2po4、50ml的cove痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
[0115]
cove痕量金属由以下构成：0.04g na2b4o7·
10h2o、0.4g cuso4·
5h2o、1.2g feso4·
7h2o、1.0g mnso4·
5h2o、0.8g na2moo4·
2h2o、10gznso4·
7h2o、以及去离子水补足至1升。
[0116]
lb培养基由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、以及去离子水补足至1升。
[0117]
lb加氨比西林板由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、15g的细菌培养用琼脂、以100μg/ml的氨比西林、以及去离子水补足至1升。
[0118]
mss培养基由以下构成：70g蔗糖、100g豆粉、三滴普鲁尼克(pluronic)消泡剂、以及去离子水补足至1升；将ph调节至6.0。
[0119]
不含尿素的mu
‑
1glu培养基由以下构成：260g葡萄糖、3gmgso4·
7h2o、6g k2so4、5g kh2po4、0.5ml amg痕量金属溶液、几滴消泡剂、以及去离子水补足至1升；将ph调节至4.5。
[0120]
50％尿素由以下构成：500g尿素、以及去离子水补足至1升。
[0121]
ypg培养基由以下构成：10g的酵母提取物、20g的细菌培养用蛋白胨、20g的葡萄糖、以及去离子水补足至1升。
[0122]
stc由0.8m山梨醇、25mm或50mm tris ph 8、和25mm或50mm cacl2组成。
[0123]
sptc由stc缓冲液中的40％聚乙二醇4000(peg4000)组成。
[0124]
soc培养基由以下构成：20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的nacl、10ml的250mm kcl、以及去离子水补足至1升。
[0125]
tae缓冲液由以下构成：4.84g的tris碱、1.14ml的冰乙酸、2ml的0.5m edta ph 8.0、以及去离子水补足至1升。
[0126]
购买的材料(大肠杆菌、质粒和试剂盒)
[0127]
使用expand
tm pcr系统(宝灵曼公司(boehringer mannheim))来进行聚合酶链式反应(pcr)。qiaquick
tm
凝胶提取试剂盒(凯杰公司)被用于纯化pcr片段并从琼脂糖凝胶中提取dna片段。用hd克隆试剂盒(宝酒造公司(takara))将回收的pcr片段掺入质粒载体。将大肠杆菌dh5
‑
α(东洋公司(toyobo))用于质粒构建和扩增。将商购的质粒pbluescript ii sk
‑
(斯图特基因公司(stratagene)#212206)用于pcr片段的克隆。使用qiagen
tm
质粒试剂盒(凯杰公司(qiagen))来回收扩增的质粒。
[0128]
菌株
[0129]
表达宿主菌株黑曲霉菌株gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10由诺维信公司(novozymes)分离并为从土壤分离的黑曲霉nn049184的衍生物。将菌株gp3
‑
13遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性和α
‑
淀粉酶活性的表达，随后引入篱边粘褶菌(gloeophyllum sepiarium)淀粉葡萄糖苷酶基因。将菌株c5255
‑
2161
‑
10遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性和α
‑
淀粉酶活性的表达，随后引入疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)脂肪酶基因。
[0130]
质粒
[0131]
质粒phuda801描述于wo 2012160093中的实例4中。
[0132]
黑曲霉的转化
[0133]
亲本黑曲霉宿主细胞的转化是使用已知用于丝状真菌转化的通用方法，如描述于yelton等人,“transformation of aspergillus nidulans by using a trpc plasmid[通过使用trpc质粒的黑曲霉的转化]”,proc natl acad sci u s a[美国科学院院刊].1984年3月；81(5):1470
‑
4中，并如下来实现的：
[0134]
如果宿主菌株是pyrg缺陷型突变体，则将黑曲霉宿主菌株接种至100ml补充有10mm尿苷的ypg培养基上，并且在32℃下在80rpm下孵育16小时。将球粒进行收集并且用0.6m kcl洗涤，并且重悬浮于包含商业β
‑
葡聚糖酶产品(glucanex
tm
，诺维信公司(novozymes a/s)，鲍斯韦丹麦)的20ml 0.6m kcl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生质体，并且然后用stc缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重悬并调节至终浓度为2.5x 107个原生质体/ml。将大约4μg的质粒dna添加至100μl的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且冰上孵育30分钟。添加1ml的sptc，并且将该原生质体悬浮液在37℃孵育20分钟。在添加10ml 50℃ cove
‑
n顶层琼脂糖后，将混合物倾倒于基本培养基上，并且将这些板在30℃下孵育5天。
[0135]
pcr扩增
[0136][0137]
pcr条件
[0138][0139]
用于报告酶生产的摇瓶培养
[0140]
将选择的转化体的孢子接种进100ml的mss培养基，并且在30℃下培养3天。将10％的种子培养物以实验室规模罐转移至mu
‑
1glu培养基中，用适当量的葡萄糖和铵进行给料，并且在30℃下培养6天。通过离心获得上清液。使用离心后的培养物上清液用于酶测定。
[0141]
葡糖淀粉酶活性
[0142]
葡糖淀粉酶活性以淀粉葡糖苷酶单位(agu)测量。agu被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，ph 4.3，底物：麦芽糖23.2mm，缓冲液：乙酸盐0.1m，反应时间5分钟。可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α
‑
d
‑
葡萄糖变为β
‑
d
‑
葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β
‑
d
‑
葡萄糖特异性地反应，形成nadh，使用光度计在340nm下测定该nadh作为原始葡萄糖浓度的量度。
[0143]
脂肪酶活性
[0144]
脂肪酶活性以klu(千脂肪酶单位)测量。将脂肪酶用底物pnp
‑
棕榈酸酯(c:16)孵育(ph 8.0，30℃)。脂肪酶水解醚键并释放黄色的且可以在405nm处检测到的pnp。随时间并且相对于标准监测颜色的变化(检测是动态的)。
[0145]
柠檬酸盐测定
[0146]
在柠檬酸测定试剂盒(罗氏公司)中测量培养物上清液中的柠檬酸盐浓度。将柠檬酸盐转化为以下三个酶反应。
[0147]
(1)柠檬酸盐
→
丁酮二酸盐 醋酸盐(柠檬酸裂合酶)
[0148]
(2)丁酮二酸盐 nadh h
→
l
‑
苹果酸盐 nad (l
‑
苹果酸盐脱氢酶)
[0149]
(3)丙酮酸盐 nadh h
→
d
‑
乳酸盐 nad (d
‑
乳酸盐脱氢酶)
[0150]
将反应(2)和(3)中氧化的nadh的量化学计量至柠檬酸盐的量。通过其在334、340和365nm处不存在光来确定nadh。
[0151]
southern杂交
[0152]
将所选择的转化体的菌丝体从在3ml ypg培养基中的过夜培养物中收获，用蒸馏水冲洗。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用fastdna spin试剂盒(mp生物医疗)的基因组dna制备。遵循制造商的说明书，使用pcr dig探针合成试剂盒(罗氏应用科学公司(r℃he applied science)，印第安纳波利斯(indianapolis)，印第安纳州(in))合成非放射性探针。遵循制造商的说明书，使用qiaquick tm凝胶提取试剂盒(凯杰公司(qiagen inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州)将dig标记的探针进行凝胶纯化。
[0153]
将5微克的基因组dna用适当的限制性内切酶完全消化16小时(40μl总体积、4u酶/μl dna)并且在0.8％琼脂糖凝胶上运行。将该dna在凝胶中通过用0.2m hcl处理进行片段化、变性(0.5m naoh，1.5m nacl)并且进行中和(1m tris，ph7.5；1.5m nacl)用于随后在20x ssc中转移至海邦(hybond)n 膜(安玛西亚公司(amersham))上。将该dna进行uv交联到
该膜上并且在42℃下在20ml dig easy hyb(罗氏诊断产品有限公司(roche diagnostics corporation)，曼海姆，德国)中预杂交1小时。将变性的探针直接添加至dig easy hyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2x ssc中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1x ssc中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig检测系统和cpd
‑
star(罗氏公司)进行化学发光检测。将dig
‑
标记的dna分子量标记ii(罗氏公司)用于标准标记。
[0154]
实例1：用于黑曲霉citt基因的靶标基因破坏的质粒phuda2298(载体)的构建
[0155]
构建质粒phuda2298以包含黑曲霉柠檬酸盐转运蛋白(citt)基因的5’和3’侧翼区，这两个侧翼区通过与其终止子重复一起的作为选择性标记的构巢曲霉乳清苷
‑5’‑
磷酸脱羧酶基因(pyrg)，和人单纯疱疹病毒1(hsv
‑
1)胸苷激酶基因分开。hsv
‑
1胸苷激酶基因位于citt基因的3’侧翼区的3’端，允许没有正确地靶向citt基因座的黑曲霉转化体的反向选择。以如下所述的若干个步骤构建质粒。
[0156]
使用以下引物产生包含黑曲霉citt的5’侧翼区的pcr产物：
[0157]
引物citt1(正义；seq id no:4)：
[0158]5’
gctccaccgcggtggcggccgccggcgtagatcatcgcct
[0159]
引物citt2(反义；seq id no:5)：
[0160]5’
cattatacgaagttatactagtcaacttagcatacagatt
[0161]
通过反应中的pcr来扩增所希望的片段，该反应由大约100ng黑曲霉nn049184的基因组dna、1μl扩展高保真聚合酶(罗氏)、100μm引物citt1、100μm引物citt2、5x pcr缓冲液(包含mgcl2)、20μl 2.5mm dntp混合物(总体积；100μl)组成。将反应在编程为如下的c1000touch
tm
热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续2分钟；1个循环，在72℃持续7分钟；并且保持在4℃。将生成的2,016bp pcr片段通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将纯化的2,016bp pcr片段用noti和spei进行消化。
[0162]
将质粒phuda801(wo 2012160093 a1中的实例4)用not i和spei进行消化，并且通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将其中的9,558bp片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。在反应中将2,016bp片段并入9,558bp pcr片段，该反应由1μl9,558bp片段、3μl 2,016bp片段、3μl h2o、以及2μlhd克隆试剂盒(宝酒造公司)组成。将infusion反应在50℃孵育10分钟。将5μl混合物转化到dh5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用qia小量制备试剂盒，将质粒dna从若干个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒dna。将一种质粒命名为phuda801
‑5’
citt。
[0163]
使用以下引物产生包含黑曲霉citt的3’侧翼区的pcr产物：
[0164]
引物citt3(正义；seq id no:6)：
[0165]5’
tgctatacgaagttatgtttaaactcggaagaaagaggtagc
[0166]
引物citt4(反义；seq id no:7)：
[0167]5’
ggcgaattcgtttgtgttaattaaaaacagggatactctaca
[0168]
通过反应中的pcr来扩增所希望的片段，该反应由大约100ng黑曲霉nn049184的基因组dna、1μl扩展高保真聚合酶(罗氏)、100μm引物citt3、100μm引物citt4、5x pcr缓冲液(包含mgcl2)、20μl 2.5mm dntp混合物(总体积；100μl)组成。将反应在编程为如下的c1000touch
tm
热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续2分钟；1个循环，在72℃持续7分钟；并且保持在4℃。将生成的1,645bp pcr片段通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将纯化的1,645bp pcr片段用pmei和paci进行消化。将质粒phuda801
‑5’
citt用pmei和paci进行消化，并且通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将其中的11,989bp片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。在反应中将1,645bp pcr片段并入11,989bp片段，该反应由1μl 11,989bp片段、3μl 1,645bp片段、3μl 1,645bp片段、3μl h2o、以及2μlhd克隆试剂盒(宝酒造公司)组成。将infusion反应在50℃孵育10分钟。将5μl的连接混合物转化到dh5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用qia小量制备试剂盒，将质粒dna从若干个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒dna。将一种质粒命名为phuda2298。
[0169]
实例2：在gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10中的黑曲霉citt基因破坏
[0170]
gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10中的pyrg基因被如下解救。将菌株gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10接种到包含10mm尿苷和1g/l 5
‑
氟
‑
乳清酸(5
‑
foa)的cove
‑
n jp培养基上，在30℃下持续5天。其中pyrg基因已经缺失的菌株将在5
‑
foa的存在下生长；保留该基因的那些将转换5
‑
foa为5
‑
氟
‑
ump，即毒性中间体。将这些生长的菌落用灭菌的牙签转移到补充有10mm尿苷的cove
‑
n
‑
gly板上，并且在30℃下生长7天。将分离的菌株分别命名为gp3
‑
13
‑
p1和c5255
‑
2161
‑
10
‑
p1。
[0171]
通过在32℃下持续16小时，以80rpm轻微搅动，在补充有10mm尿苷的100ml的ypg培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株gp3
‑
13
‑
p1和c5255
‑
2161
‑
10
‑
p1的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6m kcl洗涤，并且将其重悬浮于含有商业β
‑
葡聚糖酶产品(glucanex
tm
，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml 0.6m kcl(终浓度为20mg/ml)中。将该悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体。将原生质体通过衬有的漏斗，过滤到50ml无菌塑料离心管中，并且用0.6m kcl进行洗涤以提取受陷的原生质体。通过在2,000rpm离心15分钟收集合并的滤液和上清液。弃去上清液，并且用10
‑
25ml的stc洗涤该球粒，并且在2,000rpm再次离心10分钟，并且然后用stc缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重悬并调节至终浓度为2.5x 107个原生质体/ml。
[0172]
将约10μg的phuda2298添加至0.3ml的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml sptc，并且将该原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml 50℃ cove
‑
n顶层琼脂糖之后，将该混合物倾倒于cove
‑
n板上，并且将这些板在30℃下孵育7天。用无菌牙签将这些生长转化体转移到补充有1.5μm 5
‑
氟
‑2‑
脱氧尿苷(fdu)(杀死表达包含在phuda2298中的单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的细胞的试剂)的cove
‑
n jp
板上。将单孢子分离物转移至cove
‑
n
‑
glyx板上。
[0173]
通过southern分析来筛选包含用来破坏citt基因的phuda2298的黑曲霉菌株gp3
‑
13
‑
p1和c5255
‑
2161
‑
10
‑
p1的可能的转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的ypg培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有的漏斗来收集生物质。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用fastdna spin试剂盒(mp生物医疗)的基因组dna制备。
[0174]
进行southern印迹分析，以确认citt基因座的破坏。用hindiii来消化来自每个转化体的5μg的基因组dna。基因组dna消化反应由以下构成：5μg基因组dna、1μl hindiii、2μl 10xcut smart缓冲液、以及水补足至20μl。在37℃，将基因组dna消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用tae缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用印迹至hybond n (ge医疗集团生命科学部(ge healthcare life sciences)，曼彻斯特，新罕布什尔州，美国)持续大约1小时。将膜与500bp地高辛标记的黑曲霉citt探针杂交，其中使用如下所示的引物citt5(正义)和citt6(反义)，通过pcr，通过掺入地高辛
‑
11
‑
dutp合成该探针。
[0175]
正向引物(citt5；seq id no:8)：
[0176]5’‑
gaaccccagaagctgggagc
[0177]
反向引物(citt6；seq id no:9)：
[0178]
5'
‑
ggtagacggcctgtctttat
[0179]
扩增反应(100μl)是以下项组成的：200μm pcr dig标记的混合物(vial2)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、0.5μm引物，高保真酶混合物(vial 1)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、以及作为模板的1μl(100pg/μl)的phuda2298，最终体积为100μl。将扩增反应在编程为如下的c1000touch
tm
热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续30分钟；且保持在4℃。将pcr产物通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将0.5kb片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将变性的探针直接添加至dig easy hyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2x ssc中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1x ssc中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig检测系统和cpd
‑
star(罗氏公司)进行化学发光检测。将dig
‑
标记的dna分子量标记ii(罗氏公司)用于标准标记。选择分别在gp3
‑
13
‑
p1和c5255
‑
2161
‑
10
‑
p1产生的citt位点(杂交带从5.1kb转移到4.0kb)处提供了正确的整合的菌株(gp3
‑
2298
‑
1、2、3和c5255
‑
2161
‑
2298
‑
2、4、7)进行后续实验。
[0180]
实例3：citt基因缺失菌株(disruptant)的摇瓶发酵
[0181]
将黑曲霉菌株gp3
‑
2298
‑
1、2、3，c5255
‑
2161
‑
2298
‑
2、4、7及其亲本菌株gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10在30℃下在cove
‑
n
‑
glyx板上培养约一周。使用无菌移液管将来自每个板的一块小塞子打洞，将其各自接种到在500ml烧瓶中的100ml的mss培养基中。将这些烧瓶在30℃下以200rpm孵育3天。然后，将10ml的培养液转移至在500ml烧瓶中的100ml的mu1 glu培养基中。
[0182]
将这些烧瓶在32℃下以200rpm孵育6天。将每个培养物在10ml试管中以5,000rpm
离心10分钟，并且回收培养物上清液，用于确定葡糖淀粉酶(ag；参见表1)或脂肪酶(klu；参见表2)生产力。同样，在培养物上清液中确定柠檬酸盐的量，随后是材料和方法。通过从产生的标准曲线外推，并且与设置在100％的黑曲霉菌株gp3
‑
13和c5255
‑
2161
‑
10相比来确定酶生产力。
[0183]
与未突变的参考黑曲霉菌株相比，citt基因破坏菌株的脂肪酶生产力提高了60％～75％，葡糖淀粉酶生产力提高了12％～20％。
[0184]
表1：摇瓶培养中的葡糖淀粉酶和柠檬酸盐生产力。
[0185][0186]
表2：摇瓶培养中的脂肪酶和柠檬酸盐生产力。
[0187]

技术特征：
1.一种突变的丝状真菌宿主细胞，其包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，citt基因的表达被改变、降低或消除，其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽citt，该柠檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3的多肽具有至少80％氨基酸序列同一性。2.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。3.如权利要求2所述的宿主细胞，该宿主细胞是曲霉属细胞；优选地棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。4.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
‑
葡糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β
‑
木糖苷酶。5.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该柠檬酸盐转运蛋白多肽citt包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。6.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该citt基因或其同源物包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少80％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成。7.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该citt基因或其同源物包含基因组核苷酸序列或由其组成，其cdna序列与seq id no:2所示的cdna序列具有至少80％同一性；优选地与seq id no:2所示的cdna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性。8.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，该分泌的目的多肽的产量和/或生产力提高。9.一种产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在有助于该分泌的目的多肽的表达的条件下，培养包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸的突变的丝状真菌宿主细胞，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，citt基因的表达被改变、降低或消除，并且其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽citt，该柠檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3具有至少80％氨基酸序列同一性；以及，任选地b)回收该分泌的目的多肽。10.如权利要求9所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以
下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。11.如权利要求10所述的方法细胞，其中该丝状真菌宿主细胞是棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。12.如权利要求9
‑
11中任一项所述的方法，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
‑
葡糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β
‑
木糖苷酶。13.如权利要求9
‑
12中任一项所述的方法，其中该柠檬酸盐转运蛋白多肽citt包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。14.如权利要求9
‑
13中任一项所述的方法，其中该citt基因或其同源物包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少80％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成。15.如权利要求9
‑
14中任一项所述的方法，其中该citt基因或其同源物包含基因组核苷酸序列或由其组成，其cdna序列与seq id no:2所示的cdna序列具有至少80％同一性；优选地与seq id no:2所示的cdna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性。16.如权利要求9
‑
14中任一项所述的方法，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，该分泌的目的多肽的产量和/或生产力提高。17.一种产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的异源目的多肽的改善的产量和/或生产力，所述方法包括无具体顺序的以下步骤：a)用编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸转化丝状真菌宿主细胞；以及b)通过改变、降低或消除该丝状真菌宿主细胞中citt基因的表达来突变该宿主细胞，其中所述citt基因编码柠檬酸盐转运蛋白多肽citt，该檬酸盐转运蛋白多肽与seq id no:3中所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性。18.如权利要求17所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。19.如权利要求18所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地棘孢曲
霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。20.如权利要求17
‑
19中任一项所述的方法，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α
‑
葡糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β
‑
木糖苷酶。21.如权利要求17
‑
20中任一项所述的方法，其中该柠檬酸盐转运蛋白多肽citt包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。22.如权利要求17
‑
21中任一项所述的方法，其中该citt基因或其同源物包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少80％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成；优选地包含与seq id no:1所示的基因组dna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性的基因组核苷酸序列或由其组成。23.如权利要求17
‑
22中任一项所述的方法，其中该citt基因或其同源物包含基因组核苷酸序列或由其组成，其cdna序列与seq id no:2所示的cdna序列具有至少80％同一性；优选地与seq id no:2所示的cdna序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％同一性。
技术总结
本发明涉及分泌目的多肽的丝状真菌细胞，其中与非突变的其他等基因或亲本细胞相比，citT基因的表达被改变、降低或消除，以及在所述细胞中产生分泌的目的多肽的方法，以及产生所述细胞的方法。所述细胞的方法。


技术研发人员：宇田川裕晃
受保护的技术使用者：诺维信公司
技术研发日：2019.10.08
技术公布日：2021/6/29