多重基因破坏曲霉属微生物及其制造方法与流程

专利2022-05-09  108



1.本发明涉及一种染色体上的至少两种基因被破坏的转化曲霉属微生物及其制造方法。


背景技术:

2.曲霉属(aspergillus)微生物是在酱油或味噌等发酵食品的制造步骤之一的制麹步骤中所使用的麹菌,另外还被用于各种各样的物质生产。因此,需要一种改变曲霉属微生物的技术以便对位于染色体上的靶基因加以破坏等而表现出所期望的性状。
3.作为将位于宿主染色体上的靶基因加以破坏的方法,有标记循环法(也被称为maker recycling法。)。标记循环法是如下的方法:在利用同源重组将靶基因置换成选择标记基因之后,去除选择标记基因,使得转化体的染色体上不残留选择标记基因,再将选择标记基因进行再利用。
4.作为标记循环法中所使用的选择标记基因,要求具备可以容易地确认选择标记基因的置换及选择标记基因的去除的系统。作为这种可用于标记循环法的选择标记基因,在曲霉属微生物中是使用pyrg基因。
5.曲霉属微生物由于在染色体上具有pyrg基因,因而即使不添加尿苷和/或尿嘧啶(以下有时也表示为尿苷/尿嘧啶)也可以生长,但其会将作为尿苷单磷酸的生物合成中间体的乳清苷5
’‑
单磷酸的类似物即5

氟乳清酸(5

foa)加以代谢而合成出有毒性的5

氟尿嘧啶(5

fu)。因此,染色体上有pyrg基因的曲霉属微生物即使在5

foa存在的条件下进行培养也不能生长。而染色体上没有pyrg基因的曲霉属微生物不能将5

foa加以代谢,因此,虽然在5

foa存在的条件下也能生长,但构成尿苷/尿嘧啶的缺陷型。
6.作为像pyrg基因这样的可用于标记循环法的选择标记基因,需要是在利用由于其基因表达因而在含有特定药物(5

foa等)的环境中不能生长这一特性的、在反选择中可用的选择标记基因。换句话说,如果找不到在反选择中可以使用的药物,则该选择标记基因不能应用于标记循环法。
7.利用该性质,用不含有尿苷/尿嘧啶的培养基,对将pyrg基因缺失曲霉属微生物染色体上的靶基因用pyrg基因加以置换后的转化体进行筛选,接着用含有5

foa的培养基对所筛选的转化体进行反选择,由此可以获得作为5

foa耐药株的靶基因和pyrg基因发生缺失的转化体。
8.但是,作为将曲霉属微生物作为对象的标记循环法中所使用的选择标记基因,现状是仅使用上述的pyrg基因。此外,在使用药物的niad缺失株的反选择或sc缺失株的反选择中,药物的选择压均较弱,因而可见非缺失株的背景生长,因而现状是实际上在标记循环法中几乎不被使用。
9.另一方面,在下述专利文献1(该文献的全部公开内容并入本文中。)中,关于将戴尔根霉(rhizopusdelemar)作为宿主的转化体的描述有:通过确认在5

氟邻氨基苯甲酸(5

faa)存在的条件下有无生长,而对参与色氨酸生物合成的基因即trpc基因有无缺失进行评
价。此外,在下述非专利文献1(该文献的全部公开内容并入本文中。)中,作为选择标记基因,描述有使pyrg基因和精氨酸的生物合成基因即argb基因发生缺失的转化棘孢曲霉。在非专利文献2(该文献的全部公开内容并入本中文中。)中,描述有使黑曲霉(aspergillusniger)的trpc基因不可逆地发生缺失。在非专利文献3(该文献的全部公开内容并入本文中。)中,描述有关于与曲霉属微生物完全不同的酵母(saccharomycescerevisiae)中的trp1标记基因的反选择的使用。
10.现有技术文献
11.专利文献
12.专利文献1:国际公开第2017/135317号
13.非专利文献
14.非专利文献1:tani等人,amb express,2013,3:4,https://amb

express.springeropen.com/articles/10.1186/2191

0855
‑3‑415.非专利文献2:goosen等人,《分子和普通遗传学(molecular and general genetics)》,1989年,219卷,第282

288页
16.非专利文献3:toyn等人,《酵母菌(yeast)》,2000年,16卷,第553

560页


技术实现要素:

17.发明要解决的课题
18.在专利文献1中,根据在5

faa存在的条件下的有无生长,对trpc基因缺失株进行筛选。但是,在专利文献1中,没有关于可以将trpc基因作为在标记循环法中使用的能够循环的选择标记基因加以使用的描述。
19.此外,关于非专利文献1中所描述的转化棘孢曲霉,发生缺失的argb基因不是可用于标记循环法的选择标记基因。此外,在非专利文献1中,代替argb基因而应用另外的选择标记基因,例如,在参与有许多氨基酸的生物合成的基因中,关于对特定选择标记基因的应用没有任何描述。
20.进而,在利用标记循环法将作为宿主生物的曲霉属微生物进行转化时,与pyrg基因相同程度的循环是可能的,关于代替pyrg基因的可用的选择标记基因到目前为止几乎是未知的。特别是,关于将曲霉属微生物作为对象,从而可以容易地确认能够与pyrg基因同时使用的可用于标记循环法的选择标记基因的置换和去除的系统,至今为止也几乎未知。关于这些在非专利文献2和3中并没有描述。特别是,根据本发明人的调查,与酵母的trp1标记基因相当的基因在曲霉属微生物中并未发现。
21.因此,本发明要解决的第一课题在于,提供可用于标记循环法的至少两种选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物及其制造方法。
22.本发明要解决的第二课题在于,提供使用含有包括选择标记基因的核酸片段的至少两种的组合物,利用标记循环法使位于转化曲霉属微生物染色体上的至少两种靶基因发生缺失的方法。
23.用于解决课题的手段
24.本发明人为解决上述课题而进行努力研究,在设想有应用可能性的各种基因中,最终着眼于参与色氨酸生物合成的基因。于是,发现了:在将该色氨酸生物合成基因发生缺
失的转化曲霉属微生物作为宿主并将包括环出区域和色氨酸生物合成基因的核酸片段导入到靶基因的基因座时,能够利用在色氨酸不存在的条件下的生长来确认靶基因与色氨酸生物合成基因的置换,进而能够利用5

faa存在的条件下的生长来确认色氨酸生物合成基因的通过环出的去除。
25.于是,出人意料地,本发明人通过将5

foa和5

faa的存在量设定为特定的浓度,而成功地制造并筛选出使作为选择标记基因的色氨酸生物合成基因和pyrg基因发生缺失的双重破坏转化曲霉属微生物。已知酱油曲霉、米曲霉这类曲霉属微生物对药物的耐性较高。因此,对于曲霉属微生物,至今为止尚无对是否可以将5

faa用于色氨酸生物合成系统基因缺失株的反选择、即使可以使用但可将5

faa的浓度设定为何种程度等的认识。除此之外,因为选择压较弱,即感受性与耐性之间的差较小,所以也想到设定合适的药物浓度恐怕较为困难。尽管存在这样的技术背景,但本发明人通过制造并筛选出上述双重破坏转化曲霉属微生物,进而使用该双重破坏转化曲霉属微生物,而成功在短时间内高效率地使存在于染色体上的两种靶核酸发生缺失。本发明是基于这种知识、成功例而最终完成的发明。
26.因此,根据本发明的一个方面,提供以下的转化曲霉属微生物、组合物及方法。
27.[1]一种转化曲霉属微生物,其是染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(aspergillus)微生物,所述选择标记基因包括色氨酸生物合成基因和与色氨酸生物合成基因不同的基因。
[0028]
[2]一种组合物,其是包含至少两种在同源重组区域中包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的曲霉属微生物转化用组合物;所述核酸片段包括所述选择标记基因是色氨酸生物合成基因的核酸片段和所述选择标记基因是与色氨酸生物合成基因不同的基因的核酸片段。
[0029]
[3]如[1]~[2]中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)以外的曲霉属微生物。
[0030]
[4]如[1]~[3]中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因。
[0031]
[5]如[1]~[4]中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自尿嘧啶生物合成基因、硫酸盐代谢基因和硝酸盐代谢基因的选择标记基因。
[0032]
[6]如[1]~[5]中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述色氨酸生物合成基因是trpc基因,并且与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自pyrg基因、niad基因和sc基因中的至少一种基因。
[0033]
[7]一种包括下述步骤(1)~步骤(3)的、染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物的制造方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因:
[0034]
(1)用在同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的核酸片段,将染色体上的第二选择标记基因作为靶,将染色体上的第一选择标记基因发生缺失的转化曲霉属
微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;
[0035]
(2)在与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(1)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因并且染色体上的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤;以及
[0036]
(3)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(2)中被筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0037]
[8]一种包括下述步骤(a)~步骤(b)的、利用可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因的、转化曲霉属微生物的染色体上的两种靶基因的缺失方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因:
[0038]
(a)用在针对第一靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的第一核酸片段及在针对第二靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第二选择标记基因的第二核酸片段,将该第一靶基因和该第二靶基因作为靶,将染色体上的第一选择标记基因和第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;以及
[0039]
(b)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质不存在的条件下,将在所述步骤(a)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0040]
[9]如[8]所述的方法,其还包括下述的步骤(c):
[0041]
(c)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物存在的条件下,将在所述步骤(b)中所筛选的转化曲霉属微生物在进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因、所述第二选择标记基因、所述第一靶基因和所述第二靶基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0042]
[10]如[9]中所述的方法,其中,所述第一选择标记基因是色氨酸生物合成基因,与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

faa,且该5

faa的浓度为0.005%(w/v)~0.02%(w/v),并且
[0043]
所述第二选择标记基因是pyrg基因,与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

foa,且该5

foa的浓度为0.05%(w/v)~0.15%(w/v)。
[0044]
[11]如[7]~[10]的任一项所述的方法,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉以外的曲霉属微生物。
[0045]
[101]一种转化曲霉属微生物,其是染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(aspergillus)微生物,所述选择标记基因包括trpc基因和pyrg基因。
[0046]
[102]一种组合物,其是包含至少两种在同源重组区域中包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的、曲霉属微生物转化用组合物,所述核酸片段包括所述选择标记基因为trpc基因的核酸片段和所述选择标记基因为pyrg基因的核酸片段。
[0047]
[103]如[101]~[102]中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)以外的曲霉属微生物,优选地,宿主生物是酱油曲霉(aspergillus sojae)、米曲霉(aspergillus oryzae)、溜曲霉(aspergillus tamarii)、琉球曲霉(aspergillus luchuensis)、宇佐美曲霉(aspergillusus usamii)或斋藤曲霉(aspergillus saitoi)。
[0048]
[104]一种包括下述步骤(1)~步骤(3)的、染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物的制造方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是trpc基因,另一个是pyrg基因,与trpc基因相对应的营养性物质是色氨酸,色氨酸的类似物是5

faa,与pyrg基因相对应的营养性物质是尿嘧啶和/或尿苷,尿嘧啶和/或尿苷的类似物是5

foa:
[0049]
(1)用在同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的核酸片段,将染色体上的第二选择标记基因作为靶,将染色体上的第一选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;
[0050]
(2)在与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(1)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因并且染色体上的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤;以及
[0051]
(3)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(2)中所筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0052]
[105]一种包括下述步骤(a)~步骤(b)的、应用可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因的、转化曲霉属微生物的染色体上的两种靶基因的缺失方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是trpc基因,另一个是pyrg基因,与trpc基因相对应的营养性物质是色氨酸,色氨酸的类似物是5

faa,与pyrg基因相对应的营养性物质是尿嘧啶和/或尿苷,尿嘧啶和/或尿苷的类似物是5

foa:
[0053]
(a)用在针对第一靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的第一核酸片段及在针对第二靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第二选择标记基因的第二核酸片段,将该第一靶基因和该第二靶基因作为靶,将染色体上的第一选择标记基因和第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;
[0054]
(b)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质不存在的条件下,将在所述步骤(a)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0055]
[106]如[105]所述的方法,还包括下述的步骤(c):
[0056]
(c)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物存在的条件下,将在所述步骤(b)中所筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因、所述第二选择标记基因、所述第一靶基因和所述第二靶基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0057]
[107]如[106]所述的方法,其中,所述5

faa的浓度为0.005%(w/v)~0.02%(w/v),并且所述5

foa的浓为0.05%(w/v)~0.15%(w/v)。
[0058]
[108]如[104]~[107]中任一项所述的方法,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)以外的曲霉属微生物,优选地,宿主生物是酱油曲霉(aspergillus sojae)、米曲霉(aspergillus oryzae)、溜曲霉(aspergillus tamarii)、琉球曲霉(aspergillus luchuensis)、宇佐美曲霉(aspergillus usamii)或斋藤曲霉(aspergillus saitoi)。
[0059]
发明效果
[0060]
根据作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物及方法,可以在短时间内高效率地利用标记循环法使位于转化曲霉属微生物染色体上的至少两种靶核酸发生缺失。根据作为本发明一个方面的组合物及方法,可以制造可用于标记循环法的至少两种选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物。通过应用作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物、组合物及方法,可以期待迅速地对结构或功能类似或相关的基因的同时破坏产生的新表型进行检测。
附图说明
[0061]
图1是表示酵母的色氨酸生物合成路径的概要的图。
[0062]
图2是表示如下述实施例中所描述的、使用astrpc破坏用组件的酱油曲霉kp

del株转化的概要的图。
[0063]
图3是表示如下述实施例中所描述的、使用asparp1破坏用组件的astrpc破坏株转化的概要的图。
[0064]
图4a是表示如下述实施例中所描述的、用于asparp1破坏株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0065]
图4b是表示如下述实施例中所描述的、用于asparp1破坏株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0066]
图5是表示如下述实施例中所描述的、利用环出将导入asparp1破坏株中的trpc基因去除的、trpc基因和parp1基因被去除的株的筛选程序的概要及5

faa耐药株的出现频率的图。
[0067]
图6a是表示如下述实施例中所描述的、用于astrpc去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0068]
图6b是表示如下述实施例中所描述的、用于astrpc去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0069]
图7是表示如下述实施例中所描述的、使用aohypg破坏用组件的aotrpc破坏株转化的概要的图。
[0070]
图8是表示如下述实施例中所描述的、利用环出将导入aohypg破坏株中的trpc基因去除的、trpc基因和hypg基因被去除的株的筛选程序的概要的图。
[0071]
图9a是表示如下述实施例中所描述的、用于aotrpc去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0072]
图9b是表示如下述实施例中所描述的、用于aotrpc去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0073]
图10是表示如下述实施例中所描述的、aspyrg/astrpc双重破坏株的制作程序的概要的图。
[0074]
图11是表示如下述实施例中所描述的、从asparp1/asnph双重破坏株的制作到aspyrg/astrpc双重去除株的制作的程序的概要的图。
[0075]
图12是表示如下述实施例中所描述的、用于asparp1/asnph双重破坏株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0076]
图13a是表示如下述实施例中所描述的、用于aspyrg/astrpc双重去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0077]
图13b是表示如下述实施例中所描述的、用于aspyrg/astrpc双重去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[0078]
图13c是表示如下述实施例中所描述的、用于aspyrg/astrpc双重去除株的筛选的琼脂糖凝胶电泳的结果图。
具体实施方式
[0079]
下面对作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物、组合物及方法的详细内容进行说明,但本发明的技术范围不仅限定于本项目的事项,本发明只要能够达成其的目的便可以采用各种方式。
[0080]
除非特别规定,本说明书中的各术语是以本领域技术人员通常使用的意思而使用,不应不当地解释为具有限定的含义。
[0081]
例如,所谓“和/或”意指所列举的多个相关项目中的任一个、或者2个以上的任意组合或全部的组合。
[0082]
所谓“基因缺失”意指通过使基因的一部分或全部发生缺失,而使基因不被正常地转录、所转录的蛋白质不能发挥原来蛋白质的功能等那样,在基因不能正常发挥作用的情况下基因表达受到妨碍。在本说明书中,基因缺失与基因的破坏是以相同的意思而使用。
[0083]
所谓“基因表达”意指经由转录或翻译等,基因编码的蛋白质以具有原来的结构或活性的方式被生产。
[0084]
所谓“选择标记基因”是指带来作为转化体的筛选手段而使用的性状的基因,是指能够在相对应的筛选性物质存在或不存在的条件下,使得转化体被特异性地筛选或不筛选的基因。所谓“选择标记基因的功能”是指能够在相对应的筛选性物质存在或不存在的条件下,使得转化体被特异性地筛选的基因。例如,在选择标记基因是耐药性基因的情况下,通过发挥选择标记基因的功能,而在药物存在的条件下特异性地筛选转化体。此外,在选择标记基因是营养缺陷型基因的情况下,通过发挥选择标记基因的功能,而在营养物质不存在的条件下特异性地筛选转化体。在选择标记基因中,所谓“可用于标记循环法的选择标记基
因”是指可用于反选择的选择标记基因,反选择利用的是通过该基因的表达而在含有特定药物的环境中不能生长这一特性。
[0085]
所谓“同源重组区域”是指分别与位于染色体上的作为靶的基因(靶基因)的两侧(即,上游(5’末端侧)和下游(3’末端侧))的区域相同的核酸序列。在“同源重组区域”中,将位于靶基因上游侧的区域称为“同源重组上游区域”,将位于靶基因下游侧的区域称为“同源重组下游区域”。
[0086]
所谓“环出”是指位于同一染色体上的相同核酸序列之间发生重组,位于它们之间的核酸序列发生脱落的现象。“环出区域”是指使环出成为可能的区域,例如用于利用环出将与环出区域一起导入的选择标记基因加以去除的区域。
[0087]
所谓“生物合成基因”意指表达在作为对象的物质的生物合成路径中发挥作用的蛋白质的一种或两种以上的基因,例如可列举表达催化向作为对象的物质转化的反应的酶的基因等。
[0088]
所谓“代谢基因”意指表达在作为对象的物质的代谢路径中发挥作用的蛋白质的一种或两种以上的基因,例如可列举表达催化作为对象的物质向另外的物质转化的反应的酶的基因等。
[0089]
(转化曲霉属微生物及组合物的概要)
[0090]
作为本发明一个方面的转化曲霉属(aspergillus)微生物是以使位于作为宿主生物的曲霉属微生物的染色体上的两种或两种以上的可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的方式,将宿主生物进行转化的曲霉属微生物。此外,作为本发明一个方面的组合物是用于将作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物中的靶基因加以破坏,在同源重组区域间至少包含两种或两种以上的包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段。
[0091]
在本发明一个方面的转化曲霉属微生物和组合物中,可用于标记循环法的选择标记基因的一种或两种以上是色氨酸生物合成基因,可用于标记循环法的选择标记基因的另外的一种或两种以上是与色氨酸生物合成基因不同的基因。
[0092]
(可用于标记循环法的选择标记基因)
[0093]
将酵母的色氨酸生物合成路径的概要示于图1中。如图1中所示,在酵母中,在色氨酸的生物合成中有trp4(邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶)、trp1(磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶)、trp3(吲哚
‑3‑
甘油磷酸合酶)和trp5(色氨酸合成酶)四种酶参与。另外,trp2(邻氨基苯甲酸合成酶)催化从分支酸盐向邻氨基苯甲酸盐的反应。
[0094]
对此,本发明人根据酱油曲霉(a.sojae)nbrc4239株的公开基因组数据库(bioproject accession:prjda60265),预测对与trp4相当的酶进行编码的基因是位于支架(scaffold)00063的1554760

1553403区域。于是,在尝试将该区域破坏时,只能获得将该区域破坏的染色体与非破坏的染色体混在一起的株,结果就是不能获得将该区域破坏的株。
[0095]
此外,预测对与trp5相当的酶进行编码的基因是位于支架00060的1470936

1473260区域、支架00036的917953

920152区域、支架00057的350582

352846区域和支架00011的662605

659898区域。这样,预测对与trp5相当的酶进行编码的基因有4个,将它们全部破坏是非常困难的,因此放弃。
[0096]
进而,在酱油曲霉nbrc4239株中,未发现有对与trp1和trp3各个酶相当的酶进行编码的基因。另一方面,预测对兼具trp1和trp3的功能的酶进行编码的基因是位于支架00048(df093577.1)的1213700

1211376区域,并将该区域命名为astrpc基因。于是,在酱油曲霉中,通过将astrpc基因加以破坏,而成功地获得不能由邻氨基苯甲酸生物合成色氨酸的转化曲霉属微生物。
[0097]
基于上述原因,作为可用于标记循环法的选择标记基因的色氨酸生物合成基因,优选的是对兼具酵母的trp1和trp3的功能的酶进行编码的基因,即trpc基因,但也可以是对与酵母的trp4、trp5或trp2相当的酶进行编码的基因。色氨酸生物合成基因可以单独地使用上述基因中的任一种,或者将两种以上组合使用。
[0098]
与色氨酸生物合成基因不同的基因只要是与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因,则没有特别限定,例如可列举:耐药性基因、营养缺陷型基因等。营养缺陷型基因只要是补充宿主生物的营养缺陷型的基因,则没有特别限定,例如可列举pyrg基因、niad基因、sc基因等。与色氨酸生物合成基因不同的基因可以单独使用上述基因中的一种,或者将两种以上组合使用。另外,显示niad基因发生缺失的株对于氯酸盐具有耐性,sc基因发生缺失的株对于硒酸具有耐性的性状。
[0099]
pyrg基因、trpc基因、niad基因和sc基因分别根据来源生物而注册于ncbi genbank([url]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。例如,将酱油曲霉、米曲霉和黑曲霉的pyrg基因、trpc基因、niad基因和sc基因的基因库登记号示于表1中。另外,在酱油曲霉中,显示染色体上的支架。本领域技术人员可以通过参考ncbi genbank获得曲霉属微生物的这些基因的碱基序列。酱油曲霉的支架00028的版本为df093570.1,酱油曲霉的支架00009的版本为df093562.1。
[0100]
[表1]
[0101]
基因名来源生物基因库登记号pyrg酱油曲霉支架00028的1770366

1771264niad酱油曲霉支架00048的1091779

1088819sc酱油曲霉支架00009的866277

868468pyrg米曲霉y13811.1trpc米曲霉xm_001727522.2niad米曲霉d49701.1sc米曲霉ab078786.1pyrg黑曲霉x06626.1trpc黑曲霉x07071.1niad黑曲霉m77022.1sc黑曲霉af538692.1
[0102]
在上述的基因中,从转化体的筛选容易性的观点来看,与色氨酸生物合成基因不同的基因优选营养缺陷型基因。营养缺陷型基因包括生物合成基因和代谢基因。在营养缺陷型基因中,优选的是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因,更优选的是尿嘧啶生物合成基因、硫酸盐代谢基因和硝酸盐代谢基因,进一步优选的是pyrg基因、niad基因和sc基因。
[0103]
可用于标记循环法的选择标记基因可与具有可用于标记循环法的选择标记基因的来源生物原来所拥有的基因(即,野生型基因)不完全相同,只要是表达至少与野生型基因所表达的蛋白质(即,野生型蛋白质)具有相同或近似酶学性质的蛋白质的基因,便可以是具有与野生型基因的碱基序列为互补的碱基序列和在严紧条件下进行杂交的碱基序列的dna等。
[0104]
本说明书中的所谓“在严紧条件下进行杂交的碱基序列”意指将具有野生型基因碱基序列的dna作为探针使用,利用集落杂交法、噬菌斑杂交法、southern印迹杂交法等所获得的dna的碱基序列。
[0105]
本说明书中的“严紧条件”是指明确地将特异性杂交体的信号与非特异性杂交体的信号加以识别的条件,根据所使用的杂交系统、及探针的种类、序列和长度而不同。这种条件能够通过改变杂交的温度、以及改变洗涤的温度和盐浓度而确定。例如,在强烈地检测出非特异性杂交体的信号的情况下,通过提高杂交和洗涤的温度同时根据需要降低洗涤的盐浓度,可以提高特异性。此外,在特异性杂交体的信号也没检测出的情况下,通过降低杂交和洗涤的温度同时根据需要提高洗涤的盐浓度,可以使杂交体稳定化。
[0106]
作为严紧条件的具体例,例如,使用dna探针作为探针,使用5
×
ssc、1.0%(w/v)核酸杂交用封闭试剂(罗氏诊断公司)、0.1%(w/v)n

月桂酰肌氨酸、0.02%(w/v)sds,过夜(8~16小时左右)进行杂交。使用0.1~0.5
×
ssc、0.1%(w/v)sds,优选地0.1
×
ssc、0.1%(w/v)sds,用时15分钟进行2次洗涤。进行杂交和洗涤的温度为65℃以上,优选68℃以上。
[0107]
此外,作为具有在严紧条件下进行杂交的碱基序列的dna,例如可以列举:使用将具有集落或噬菌斑来源的野生型基因的碱基序列的dna或该dna的片段加以固定化的过滤器,通过在上述严紧条件下进行杂交所获得的dna,或者,在0.5~2.0m的nacl存在的条件下,在40~75℃下实施杂交,优选地在0.7~1.0m的nacl存在的条件下,在65℃下实施杂交,然后使用0.1~1
×
ssc溶液(1
×
ssc溶液是150mm氯化钠、15mm柠檬酸钠),在65℃条件下洗涤过滤器,由此可以鉴定的dna等。探针的制备或杂交的方法可以按照《molecular cloning:a laboratory manual》,第2版,cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,ny.,1989年,《current protocols in molecular biology》,supplement1

38,john wiley&sons,1987

1997年(下面会将这些文献称为参考技术文献;该文献的全部公开内容并入本文中。)等中所描述的方法而实施。另外,本领域技术人员除了这种缓冲液的盐浓度或温度等条件以外,还可以考虑其他的探针浓度、探针长度、反应时间等诸条件,而适当地设定条件用以获得具有与野生型基因的碱基序列为互补的碱基序列在严紧条件下进行杂交的碱基序列的dna。
[0108]
作为包括在严紧条件下进行杂交的碱基序列的dna,可列举与具有作为探针使用的野生型基因的碱基序列的dna的碱基序列有一定以上的序列一致性的dna,例如可列举:与野生型基因的碱基序列有80%以上、优选地85%以上、更优选地90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、进一步优选地99.5%以上的序列一致性的dna。该序列一致性的上限不受到特别限制,典型地为100%。
[0109]
作为在严紧条件下与野生型基因的碱基序列为互补的碱基序列进行杂交的碱基序列,例如,若将碱基序列中的碱基数100个作为一个单位,则在野生型基因的碱基序列中
包括每一个该单位具有一个至数个,优选地1至20个,更优选地1至15个,进一步优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的缺失、置换、添加等的碱基序列。这里,所谓“碱基的缺失”意指序列中的碱基中有脱落或消失;“碱基的置换”意指序列中的碱基被置换成另外的碱基;所谓“碱基的添加”意指以插入新碱基的方式而添加。
[0110]
虽然存在由在严紧条件下和与野生型基因的碱基序列为互补的碱基序列进行杂交的碱基序列所编码的蛋白质是具有在由野生型基因的碱基序列所编码的蛋白质所具有的氨基酸序列中具有一个至数个氨基酸的缺失、置换、添加等的氨基酸序列的蛋白质的可能性,但与由野生型基因的碱基序列所编码蛋白质具有相同的酶活性。
[0111]
与野生型蛋白质具有相同或近似酶学性质的蛋白质可以是其氨基酸序列是由在野生型蛋白质所具有的氨基酸序列中有一个至数个氨基酸发生缺失、置换、添加等的氨基酸序列所构成。这里,氨基酸序列的“一个至数个氨基酸发生缺失、置换、添加”中的“一个至数个”的范围不受到特别限制,例如若将氨基酸序列中的氨基酸数100个作为一个单位,则意指每个该单位为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个左右,优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个左右,更优选地1、2、3、4或5个左右。此外,所谓“氨基酸的缺失”意指序列中的氨基酸残基的脱落或消失,“氨基酸的置换”意指序列中的氨基酸残基被置换成另外的氨基酸残基,所谓“氨基酸的添加”意指以向序列插入新氨基酸残基的方式而添加。
[0112]
作为“一个至数个氨基酸发生缺失、置换、添加”的具体方式,有一个至数个氨基酸被与另外的化学性质类似的氨基酸置换的方式。例如可以列举:将某疏水性的氨基酸置换成另外的疏水性氨基酸的情况、将某极性氨基酸置换成具有相同电荷的另外的极性氨基酸的情况等。就这种化学性质类似的氨基酸而言,每个氨基酸在本技术领域中是已知的。若举出具体例,作为非极性(疏水性)氨基酸,可列举:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸,可列举:甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的碱基性氨基酸,可列举:精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外,作为带负电荷的酸性氨基酸,可列举:天冬酰胺酸、谷氨酰胺酸等。
[0113]
作为在野生型蛋白质所具有的氨基酸序列中具有一个至数个氨基酸的缺失、置换、添加等的氨基酸序列,可列举与野生型蛋白质所具有的氨基酸序列具有一定以上的序列一致性的氨基酸序列,例如可列举:与野生型蛋白质所具有的氨基酸序列具有80%以上、优选地85%以上,更优选地90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上,进一步优选地99.5%以上的序列一致性的氨基酸序列等。该序列一致性的上限不受到特别限制,典型地为100%。
[0114]
(用于计算序列一致性的手段)
[0115]
获得碱基序列、氨基酸序列的序列一致性的方法没有特别限定,例如,通过利用通常已知的方法,将野生型基因或野生型基因所表达的野生型蛋白质的氨基酸序列与作为对象的碱基序列或氨基酸序列进行比对,使用用于计算两者的序列一致率的程序而获得。
[0116]
作为计算2个碱基序列或氨基酸序列的一致率的程序,例如已知有karlin和altschul的算法(《proc.natl.acad.sci.usa》87:2264

2268,1990年;《proc.natl.acad.sci.usa》90:5873

5877,1993年;这些文献的全部公开内容并入本文
中。),使用该算法的blast程序是由altschul等人开发(《j.mol.biol.》215:403

410页,1990年;该文献的全部公开内容并入本文中。)。而且,用blast灵敏地确定序列一致性的程序即gapped blast也是已知的(《nucleic acids res.》25:3389

3402,1997年;该文献的全部公开内容并入本文中。)。因此,本领域技术人员例如可以利用上述程序从数据库中检索出相对于所给予的序列显示较高序列一致性的序列。这些能够例如从美国国家生物技术信息中心的互联网上的网址(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中加以利用。
[0117]
上述的各方法通常可用于从数据库中检索出显示序列一致性的序列,作为确定个别序列的序列一致性的手段,也可以应用genetyx网络版版本12.0.1(遗传学公司)的同源性分析。该方法是基于lipman

pearson法(《science》227:1435

1441,1985年;该文献的全部公开内容并入本文中。)。在对碱基序列的序列一致性进行分析时,若有可能,使用对蛋白质进行编码的区域(cds或orf)。
[0118]
(可用于标记循环法的选择标记基因的来源)
[0119]
可用于标记循环法的选择标记基因例如来源于可确认可用于标记循环法的选择标记基因的表达或者可确认作为可用于标记循环法的选择标记基因发挥功能的生物种等。作为可用于标记循环法的选择标记基因的来源生物,例如可列举微生物等,优选的是与宿主生物相同或近缘种的曲霉属微生物。作为曲霉属微生物的具体例,可列举:酱油曲霉(aspergillus sojae)、米曲霉(aspergillus oryzae)、黑曲霉(aspergillus niger)、溜曲霉(aspergillus tamarii)、琉球曲霉(aspergillus luchuensis)、宇佐美曲霉(aspergillus usamii)、棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)、斋藤曲霉(aspergillus saitoi)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)等。
[0120]
在所列举的上述曲霉属微生物的具体例中,酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、琉球曲霉、宇佐美曲霉、棘孢曲霉和斋藤曲霉在味噌、酱油、日本酒、烧酒等酿造食品的制造、柠檬酸制造、淀粉酶等酶制剂的制造中,使用实际成果丰富,从高酶生产率和基于长年使用安全性的高可靠性方面来看,它们是工业上可用的微生物。
[0121]
通过将可用于标记循环法的选择标记基因导入宿主生物进行转化,由此可用于标记循环法的选择标记基因的蛋白质得到表达,从而转化体呈现与宿主生物不同的表型性状。因此,在转化体中所表达的可用于标记循环法的选择标记基因的蛋白质不因宿主生物的生长条件而失活,为了发挥选择标记功能,可用于标记循环法的选择标记基因的来源生物优选是与要进行转化的宿主生物的生长条件近似的曲霉属微生物。
[0122]
(宿主生物)
[0123]
作为宿主生物,如果是染色体上具有可用于标记循环法的选择标记基因并通过使该选择标记基因发生缺失而能够发挥该选择标记基因的功能的曲霉属微生物,则没有特别限定。其中,曲霉属微生物优选的是除棘孢曲霉以外的曲霉属微生物,如果同时考虑安全性或培养的容易性,则优选的是酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、琉球曲霉、宇佐美曲霉、斋藤曲霉、构巢曲霉等的曲霉属微生物。
[0124]
宿主生物可以是野生株,但也可以是预先将野生株进行转化后的转化体。用作宿主生物的预先将野生株进行转化后的转化体不受到特别限定。
[0125]
例如,曲霉属微生物存在同源重组频率较低的倾向,因此在利用同源重组制作转化体的情况下,优选的是使用对参与非同源重组机制的ku70、ku80等蛋白质进行编码的ku
基因被抑制的转化曲霉属微生物。
[0126]
这种ku基因的抑制,可以用对于本领域技术人员为公知的任意方法而实施,例如,能够利用使用ku基因破坏载体将ku基因加以破坏或利用ku基因的反义表达载体的反义rna法使ku基因失活等而实现。此外,也可以通过应用cas核酸酶和将ku基因作为靶的导向rna的基因组编辑方法将ku基因加以破坏。如此获得的转化曲霉属微生物和施行与ku基因抑制相关的基因操作之前的原曲霉属微生物相比,同源重组频率显著地上升。具体地,上升至少2倍、优选地至少5倍、更优选地至少10倍、进一步优选地至少约50倍。
[0127]
(转化体的一个实施方式)
[0128]
转化体的一个实施方式是宿主生物为酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、琉球曲霉、宇佐美曲霉或斋藤曲霉的、染色体上的pyrg基因和trpc基因发生缺失的转化曲霉属微生物,但不限于此。
[0129]
(转化曲霉属微生物的制造方法)
[0130]
可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物的制作方法并无特别限定,例如可列举包括以下步骤的方法等:包括按照常用方法使位于宿主生物染色体上的可用于标记循环法的选择标记基因发生脱落,或者将外源核酸片段插入或置换到该选择标记基因的基因座,从而使可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失。该步骤优选的是利用同源重组进行实施。
[0131]
在利用同源重组的方法中,例如可列举以下方法等:在染色体上的与可用于标记循环法的选择标记基因的上游区域和下游区域相同的同源重组区域之间,将连接外源核酸片段的方式构建的核酸片段导入宿主生物中,利用同源重组,将染色体上的可用于标记循环法的选择标记基因与外源核酸片段进行置换。在本说明书中,有时将为了将宿主生物进行转化而制作的核酸片段称为转化用组件。外源核酸片段优选的是与应缺失的可用于标记循环法的选择标记基因所不同的可用于标记循环法的选择标记基因。
[0132]
转化用组件优选包括环出区域。在包括环出区域和外源核酸片段的转化用组件中,在具有与环出区域相同序列的区域位于宿主生物染色体上能够利用同源重组而导入的部位的上游或下游的情况下,利用同源重组将转化用组件导入宿主生物的染色体上,然后在位于环出区域的上游或下游的环出区域与同源性区域之间发生同源重组,由此可以利用环出将所导入的外源核酸片段去除。通过采取这种方式,将外源核酸片段导入选择标记基因的基因座,然后可以获得将外源核酸片段去除的转化体。
[0133]
转化用组件的一个方面例如是在同源重组区域间包括环出区域和外源核酸片段的核酸片段。该核酸片段可以通过如下方法获得:将曲霉属微生物的染色体dna作为模板,按照常用方法,利用聚合酶链反应(以下表示为“pcr”)分别获得同源重组上游区域、环出区域和同源重组下游区域的dna片段,然后制作在位于质粒puc19的多克隆位点的融合克隆部位按顺序连接有同源重组上游区域、环出区域、外源核酸(dna)片段和同源重组下游区域的构建用质粒,接着将所得的构建用质粒作为模板dna并利用pcr进行扩增。
[0134]
提取染色体dna的方法不受到特别限定,例如,将曲霉属微生物进行培养,从所得菌体中除去水分,一边在液氮中冷却一边用乳钵等进行物理性磨碎,由此制成细粉末状的菌体片,再利用通常方法从该菌体片中提取染色体dna部分。在染色体dna提取操作中,可以应用dneasy plant mini kit(qiagen公司)等市售的染色体dna提取试剂盒。
[0135]
作为曲霉属微生物的转化方法,可以适当地选择本领域技术人员已知的方法,例如,制备宿主生物的原生质体,然后应用使用聚乙二醇和氯化钙的原生质体peg法(例如,参照《mol.gen.genet.》218,99

104,1989年,日本发明专利特开2007

222055号公报等;这些文献的全部公开内容并入本文中。)。用于使曲霉属微生物再生的培养基是使用根据使所使用的宿主生物和发生缺失的选择标记基因或所导入的外源核酸片段较为适当的培养基。例如,在使用酱油曲霉作为宿主生物并且使用耐药性基因作为外源核酸片段的情况下,转化体的再生例如可以使用含有相对应药物的最低琼脂培养基而进行。
[0136]
可以通过如下方式来确认已制作出可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物:在已缺失的可用于标记循环法的选择标记基因的功能确认的条件下,对转化体进行培养,并确认有无生长。例如,在已缺失的可用于标记循环法的选择标记基因是trpc基因和pyrg基因的情况下,通过确认在5

氟邻氨基苯甲酸(5

faa)和5

氟乳清酸(5

foa)存在条件下的生长,可以确认已制作出转化曲霉属微生物。
[0137]
此外,也可以通过如下方式来确认已制作出转化曲霉属微生物:从转化体中提取染色体dna,将其作为模板执行pcr,在发生转化的情况下确认生成能够扩增的pcr产物。
[0138]
例如,优选的是,利用与位于与嵌入转化用组件中的同源重组上游区域相比更加上游的区域为互补的正向引物、和与位于与嵌入转化用组件中的同源重组下游区域相比更加下游的区域为互补的反向引物的组合执行pcr,在发生同源重组的情况下确认生成所设想长度的产物。
[0139]
对于可用于标记循环法的第一选择标记基因发生缺失的转化体,进一步使可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失,由此可以制作使两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化体。通过重复该程序,可以制作可用于标记循环法的选择标记基因多个发生缺失的转化体。
[0140]
例如,在可用于标记循环法的选择标记基因是trpc基因和pyrg基因的情况下,将使pyrg基因发生缺失的转化曲霉属微生物作为宿主生物,以利用在同源重组区域中包括环出区域和pyrg基因的转化用组件使trpc基因发生缺失的方式进行转化,进而利用环出将所导入的pyrg基因加以去除,由此获得trpc基因和pyrg基因发生缺失的转化曲霉属微生物。作为pyrg基因发生缺失的转化曲霉属微生物,例如可列举:日本发明专利第6261039号公报(该文献的全部公开内容并入本文中。)的实施例2中所描述的酱油曲霉kp

del株等。
[0141]
作为转化曲霉属微生物的制作方法的具体例,可列举日本发明专利第6261039号公报的实施例2中所描述的方法,但并不限定于此。根据该方法,取得通过由曲霉属微生物的野生株发生自然变异而使该营养缺陷型基因灭活的株。该营养缺陷型基因可以是应发生缺失的可用于标记循环法的选择标记基因,也可以不是,这两种情况均可。
[0142]
在营养缺陷型基因是应发生缺失的可用于标记循环法的选择标记基因的情况下,通过将该营养缺陷型基因导入色氨酸生物合成基因的基因座中,而使色氨酸生物合成基因发生缺失,接着利用环出将该营养缺陷型基因加以去除,由此获得染色体上的两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物。
[0143]
在营养缺陷型基因不是应发生缺失的可用于标记循环法的选择标记基因的情况下,例如,将该营养缺陷型基因导入与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因的基因座中,由此使与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标
记基因发生缺失,接着将与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因导入色氨酸生物合成基因的基因座中,由此使色氨酸生物合成基因发生缺失,接着利用环出将与所导入的色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因加以去除,由此可以获得染色体上的两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物。此外,例如,通过将上述营养缺陷型基因导入色氨酸生物合成基因的基因座中,而使色氨酸生物合成基因发生缺失,接着通过将色氨酸生物合成基因导入与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因的基因座中,而使与色氨酸生物合成基因不同的可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失,接着利用环出将所导入的色氨酸生物合成基因加以去除,由此可以获得使染色体上的两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物。
[0144]
本发明的另一个方面是作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物的制造方法。本发明的一个方面的制造方法至少包括下述的步骤。其中,在下述步骤中,可用于标记循环法的第一选择标记基因和第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因。
[0145]
(1)使用在同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的核酸片段,将染色体上的可用于标记循环法的第二选择标记基因作为靶,将染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤。
[0146]
(2)在与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(1)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因并且染色体上的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0147]
(3)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(2)中所筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0148]
(靶基因缺失方法)
[0149]
如果使用本发明的一个方面的转化曲霉属微生物,则可以同时地或者逐步地使转化曲霉属微生物染色体上的两种或两种以上的靶基因发生缺失。
[0150]
本发明的另一个方面是本发明的一个方面的转化曲霉属微生物的染色体上的两种靶基因缺失方法。本发明的一个方面的靶基因缺失方法至少包括下述的步骤(a)~(b)。其中,在下述步骤中,可用于标记循环法的第一选择标记基因和第二选择标记基因中的一个为色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因。
[0151]
(a)使用在针对第一靶基因的、同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的第一核酸片段及在针对第二靶基因的、同源重组区域中包括环出区域和第二选择标记基因的第二核酸片段,将该第一靶基因和该第二靶基因作为靶,将染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;以及
[0152]
(b)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和与所述第二选择标记基因
相对应的营养性物质不存在的条件下,将在所述步骤(a)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对在染色体上插入有所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0153]
本发明的一个方面的靶基因缺失方法优选地还包括下述的步骤(c):
[0154]
(c)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物存在的条件下,将在所述步骤(b)中所筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因、所述第二选择标记基因、所述第一靶基因和所述第二靶基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。
[0155]
如果逐步地使转化曲霉属微生物的染色体上的两种或两种以上的靶基因发生缺失,则使用针对第一靶基因的第一核酸片段、与可用于标记循环法的第一选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物、及与可用于标记循环法的第二选择标记基因相对应的营养性物质而实施上述步骤(a)~(c),然后使用针对第二靶基因的第二核酸片段、与第二选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物、及与第一选择标记基因相对应的营养性物质而实施上述步骤(a)~(c)等即可。此外,也可以将步骤(c)分成将第一选择标记基因加以去除的步骤与将第二选择标记基因加以去除的步骤而逐步地进行。这种逐步的靶基因缺失方法也包含于本发明的一个方面的靶基因缺失方法中。
[0156]
(方法的具体例)
[0157]
在本发明的一个方面的制造方法和本发明的一个方面的靶基因缺失方法的非限制性具体例中,可用于标记循环法的第一选择标记基因是pyrg基因,与第一选择标记基因相对应的营养性物质是尿嘧啶/尿苷,与第一选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

foa,可用于标记循环法的第二选择标记基因是trpc基因,与第二选择标记基因相对应的营养性物质是色氨酸,与第二选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

faa。
[0158]
在本发明一个方面的制造方法及本发明一个方面的靶基因缺失方法的另外的非限制性具体例中,可用于标记循环法的第一选择标记基因是trpc基因,与第一选择标记基因相对应的营养性物质是色氨酸,与第一选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

faa,可用于标记循环法的第二选择标记基因是pyrg基因,与第二选择标记基因相对应的营养性物质是尿嘧啶/尿苷,与第二选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

foa。
[0159]
在上述具体例中,对5

faa有耐性的株、对5

foa有耐性的株以及对5

faa和5

foa有耐性的株进行筛选时所用的5

faa和5

foa的浓度分别是不同的,这是由本发明人首次发现的见解。优选的是,对5

faa和5

foa有耐性的株进行筛选时所用的5

faa和5

foa的浓度是比单独使用它们的情况更小的浓度。在对5

faa有耐性的株的筛选中,优选使用0.03%(w/v)~0.05%(w/v)5

faa。在对5

foa有耐性的株的筛选中,优选使用0.2%(w/v)~0.4%(w/v)5

foa。在对5

faa和5

foa有耐性的株的筛选中,优选使用0.005%(w/v)~0.02%(w/v)5

faa和0.05%(w/v)~0.15%(w/v)5

foa。
[0160]
本发明一个方面的靶基因缺失方法中的靶基因不受到特别限制,根据研究或调査的目的进行适当设定即可。例如,如在下述的实施例中所描述,在宿主生物是酱油曲霉的情况下,将靶基因作为parp1基因和nph基因,可以获得这些基因被破坏的双重破坏株。
[0161]
此外,如果应用本发明的一个方面的靶基因缺失方法,仅使用一种可用于标记循
环法得基因无法实现的情形通过使用两种可用于标记循环法的基因可以实现。例如,使用pyrg基因和trpc基因发生缺失的转化曲霉属微生物,将trpc基因导入ku基因的基因座中而制作ku破坏株。此时,不仅可以使用在同源重组区域中包括trpc基因的核酸片段,而且也可以将以在trpc基因的中间相互部分地重复的方式制备该片段分割形式的两种核酸片段后混合得到的混合物使用于ku基因破坏。接着,将pyrg基因导入蛋白酶基因的基因座中作为靶基因并去除,然后根据需要进一步重复pyrg基因向另外的蛋白酶基因座的导入和去除,然后将所导入的trpc基因加以去除,同时使ku基因复活。此时,通过部分地使ku基因重复,能够利用环出将trpc基因加以去除同时使ku基因复活。对于所获得的蛋白酶基因破坏株,利用非同源重组随机地将表达所希望蛋白质的基因表达用组件进行多拷贝导入,从而可以在防止该蛋白质因蛋白酶分解的同时,获得高表达的株。
[0162]
在本发明一个方面的制造方法和本发明一个方面的靶基因缺失方法中,只要能够解决本发明的课题,便可以在上述步骤之前或之后或者步骤中加入各种步骤或操作。
[0163]
下面通过实施例来更详细地说明本发明,但本发明并不局限于这些实施例,只要能够解决本发明的课题,则本发明可以采用各种方式。
[0164]
实施例
[0165]
将本实施中所使用的引物示于表2a~表2b中。另外,在表中的序列中,小写字母的序列表示用于连接到邻接片段的附加序列。
[0166]
[表2a]
[0167][0168]
[表2b]
[0169][0170]
例1.trpc基因作为酱油曲霉中的可用于标记循环法的选择标记基因的应用
[0171]
1.astrpc破坏株的制作
[0172]
(1

1)染色体dna的提取
[0173]
在容量为150ml的锥形瓶中,用蒸馏水制备30ml聚蛋白胨糊精培养基(1%(w/v)聚蛋白胨、2%(w/v)糊精、0.5%(w/v)kh2po4、0.1%(w/v)nano3、0.05%(w/v)mgso4·
7h2o、0.1%(w/v)酪蛋白氨基酸;ph 6.0),将酱油曲霉nbrc4239株的分生孢子进行接种,在30℃下进行一夜振荡培养。
[0174]
通过过滤从所获得的培养液中回收菌体,夹在纸巾中去除水分,使用预先在液氮中冷却的乳钵和乳棒一边在液氮中冷却一边将菌体粉碎。使用dneasy plant mini kit(qiagen公司)从所获得的粉碎菌体中提取染色体dna。
[0175]
(1

2)包括astrpc破坏用组件的质粒的制作
[0176]
以如下方式制作质粒puc19上按顺序连接有用于同源重组的上游区域1(as上游区域1)、用于补充尿苷/尿嘧啶缺陷型的转化标记即pyrg基因、和用于同源重组的下游区域1(as下游区域1)的构建用质粒。
[0177]
为了将as上游区域1、aspyrg基因、和as下游区域1扩增,而使用在上述(1

1)中所获得的酱油曲霉nbrc4239株的染色体dna作为模板dna,使用q5热启动超保真2
×
master mix(new england biolabs公司)作为pcr的酶,使用t100热循环仪(bio rad公司)作为装
置,按照附到酶中的实验方案实施pcr。
[0178]
为了将as上游区域1、aspyrg基因和as下游区域1扩增,而使用引物序列号为1~6的引物。用qiaquick pcr purification kit(qiagen公司)对扩增的dna片段进行纯化。
[0179]
puc19是使用附属于融合hd克隆试剂盒(clontech公司)的puc19线性化载体。使用上述的融合hd克隆试剂盒,按照附到试剂盒中的实验方案,在位于puc19的多克隆位点的融合克隆部位将所扩增的三种dna片段加以连接,而获得构建用质粒。
[0180]
按照制造商的指示,利用所获得的构建用质粒,将作为感受态细胞的ecos感受态大肠杆菌jm109(nippon gene公司)进行转化,由此获得转化大肠杆菌。
[0181]
将所获得的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中在37℃下振荡一夜而进行培养。将培养后的培养液离心分离并将菌体回收。对于所获得的菌体,使用fastgene plasmid mini kit(日本遗传学公司),按照附到试剂盒中的实验方案提取质粒dna。
[0182]
获得在puc19的多克隆位点上按顺序连接有as上游区域1—aspyrg—as下游区域1的序列的质粒。将所获得的质粒作为ptrpc_hr。
[0183]
(1

3)astrpc破坏用组件的扩增
[0184]
使用在上述(1

2)中所获得的质粒ptrpc_hr作为模板dna,按照上述(1

2)的描述实施pcr和pcr产物的纯化,由此获得astrpc破坏用组件。所使用的引物是序列号为7~8的引物。
[0185]
以如上述的方式,获得按顺序连接有as上游区域1—aspyrg—as下游区域1的序列的astrpc破坏用组件。
[0186]
(1

4)酱油曲霉kp

del株的转化
[0187]
按照日本发明专利第6261039号公报的实施例2中的描述,为了提高酱油曲霉nbrc4239株染色体上的pyrg基因和基因靶向效率,而制作将参与非同源重组的基因即ku70基因加以破坏的酱油曲霉kp

del株,将其作为宿主。将使用astrpc破坏用组件的酱油曲霉kp

del株的转化的概要示于图2。如图2中所示,用astrpc破坏用组件进行转化,由此将pyrg基因导入在酱油曲霉kp

del株染色体上的trpc基因的基因座,制作trpc基因发生缺失并且有pyrg基因的astrpc破坏株。
[0188]
在容量为500ml的锥形瓶中,将酱油曲霉kp

del株的分生孢子接种于100ml含有20mm尿嘧啶和20mm尿苷的聚蛋白胨糊精液体培养基中,在30℃下进行约20小时振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的astrpc破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有1mm色氨酸、0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基(difco公司;ph6),在30℃下进行5天以上的培养,获得有集落形成能力的转化酱油曲霉。
[0189]
astrpc被破坏的转化酱油曲霉利用插入到astrpc基因位置的aspyrg基因补充了宿主的尿嘧啶缺陷型,取而代之成为色氨酸缺陷型。
[0190]
(1

5)astrpc破坏株的筛选
[0191]
将按照上述(1

2)提取的转化酱油曲霉的染色体dna作为模板,用pcr加以确认,由此对astrpc基因被破坏的株进行筛选。所使用的引物是序列号为9~12的引物。
[0192]
通过实施上述的pcr,利用琼脂糖电泳确认不生成astrpc基因来源的692bp的pcr
产物,而生成非破坏对象的aslig1基因来源的439bp的pcr产物,并对astrpc破坏株进行筛选。
[0193]
对于所筛选的astrpc破坏株,进行pcr及pcr产物的限制酶消化处理,由此确认利用同源重组将astrpc破坏用组件导入。所使用的引物是序列号为13~14的引物。
[0194]
在astrpc破坏株中,生成5.7kb的pcr产物,将其用kpni进行消化,由此生成2.4kb、2.1kb和1.2kb的片段。另外,在宿主中生成6.4kb的pcr产物,将其用kpni进行消化,由此生成3.5kb和2.9kb的片段。
[0195]
(1

6)色氨酸缺陷型的确认
[0196]
将确认利用同源重组导入了astrpc破坏用组件的astrpc破坏株分别接种于含有或不含1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养,确认该株仅在含有色氨酸的培养基中生长。
[0197]
(1

7)astrpc破坏株的5

faa耐性的确认
[0198]
将astrpc破坏株和作为对照的酱油曲霉nbrc4239株接种于含有0.04%(w/v)5

faa和1mm色氨酸的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(日水制药公司)的平板上,在30℃下进行4天培养。nbrc4239株完全不生长,而astrpc破坏株却生长。由此,确认astrpc破坏株对5

faa显示耐性。另外,5

faa(5

氟邻氨基苯甲酸;东京化成工业公司)是用乙醇制备10%溶液,并以最终浓度成为上述浓度的方式添加到培养基中而使用。
[0199]
在将5

faa浓度变为0.02%(w/v)而以同样的方式进行时,astrpc破坏株和nbrc4239株一同生长。因此可知,对于酱油曲霉,通过使用0.04%(w/v)5

faa,可以筛选astrpc破坏株。
[0200]
2.使用astrpc标记基因的基因破坏
[0201]
(2

1)破坏对象基因
[0202]
作为破坏对象基因,是根据酱油曲霉nbrc4239株的公开基因组数据库(bioproject登记:prjda60265),而预测在支架00063(df093585.1)的3347080

3344733的区域的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的基因作为对象。将该基因作为asparp1基因。
[0203]
(2

2)含有asparp1破坏用组件的质粒的制作
[0204]
按照上述(1

2)中所描述的方法,制作质粒puc19上按顺序连接有用于同源重组的上游区域2(as上游区域2)、用于环出的区域1(as环出区域1)、astrpc基因和用于同源重组的下游区域2(as下游区域2)的质粒pparp1_lo_trp。所使用的引物是序列号为15~22的引物。
[0205]
(2

3)asparp1破坏用组件的扩增
[0206]
使用在上述(2

2)中所获得的质粒pparp1_lo_trp作为模板dna,按照上述(1

3)的描述实施pcr及pcr产物的纯化,由此获得asparp1破坏用组件。所使用的引物是序列号为23~24的引物。
[0207]
以如上述的方式,获得按顺序连接有as上游区域2—as环出区域1—astrpc—as下游区域2的序列的asparp1破坏用组件。
[0208]
(2

4)asparp1破坏株的制作
[0209]
利用以下程序制作asparp1破坏株。另外,将使用asparp1破坏用组件的astrpc破坏株的转化的概要示于图3。如图3中所示,用asparp1破坏用组件进行转化,由此将trpc基
因导入astrpc破坏株染色体上的parp1基因的基因座,制作parp1基因发生缺失并且具有trpc基因的转化酱油曲霉。
[0210]
在容量为500ml的锥形瓶中,将astrpc破坏株的分生孢子接种于100ml含有1mm色氨酸的聚蛋白胨糊精液体培养基中,在30℃下进行约24小时振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的asparp1破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行5天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化酱油曲霉。
[0211]
对于asparp1被破坏的转化酱油曲霉,利用插入asparp1基因位置中的astrpc基因而补充了宿主的色氨酸缺陷型。
[0212]
(2

5)asparp1破坏株的筛选
[0213]
按照上述(1

5)的描述,从转化株中提取染色体dna再用pcr加以确认,由此对asparp1基因被破坏的株进行筛选。所使用的引物是序列号为25~28的引物。
[0214]
通过实施上述的pcr,而利用琼脂糖凝胶电泳确认不生成asparp1基因来源的460bp的pcr产物,而生成非破坏对象的asptef启动子来源的720bp的pcr产物。将琼脂糖凝胶电泳的结果示于图4a中。如图4a中所示,在转化株2、6和7中,不生成parp1基因的pcr产物(parp)。
[0215]
对于所筛选的asparp1破坏株,进行pcr,由此利用琼脂糖凝胶电泳确认利用同源重组导入了asparp1破坏用组件。所使用的引物是序列号为29~30的引物。
[0216]
将琼脂糖凝胶电泳的结果示于图4b中。如图4b中所示,在上述的转化株2、6和7中,在转化株2和7中生成9.6kb的pcr产物。另外,在宿主中生成5.3kb的pcr产物。由此,将转化株2和7(分别是parp_2和parp_7)制成asparp1破坏株。
[0217]
3.导入的astrpc标记基因的去除
[0218]
(3

1)astrpc去除株的确认
[0219]
如图5中的概要所示,通过以下的程序,对利用环出将导入asparp1破坏株中的trpc基因加以去除的、trpc基因和parp1基因被去除的株进行筛选。
[0220]
将asparp1破坏株的分生孢子涂抹于含有1mm色氨酸和0.04%(w/v)5

faa的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(日水制药公司)的平板上,在30℃下进行4天培养。图5中示出了将所涂抹的parp_2和parp_7的分生孢子数、出现的耐药株数和由它们所计算的耐药株出现频率。
[0221]
从生成的5

faa耐药株中提取染色体dna再利用序列号为29~30的引物进行pcr,由此利用琼脂糖凝胶电泳确认是发生环出而将astrpc去除的astrpc去除株。将从parp_7株中筛选的5

faa耐药株7个株作为对象的琼脂糖凝胶电泳的结果示于图6a。
[0222]
如图6a所示,通过发生环出,而如所设想地生成3.0kb的pcr产物。另外,在不发生环出的情况下,生成9.6kb的pcr产物。
[0223]
此外,从astrpc去除株中提取染色体dna,使用序列号为9~12的引物进行pcr,由此利用琼脂糖电泳确认不生成astrpc基因来源的692bp的pcr产物,生成非破坏对象的aslig1基因来源的439bp的pcr产物。将从parp_7株中所筛选的5

faa耐药株7个株作为对象的琼脂糖凝胶电泳的结果示于图6b。筛选这些的7个株作为astrpc去除株。
[0224]
(3

2)色氨酸缺陷型的确认
[0225]
将所筛选的astrpc去除株分别接种于含有或不含1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养,由此astrpc去除株仅在含有色氨酸的培养基中生长,即确认该株是色氨酸缺陷型。此外,显示通过使用5

faa可以去除astrpc。
[0226]
例2.trpc基因作为米曲霉中的可用于标记循环法的选择标记基因的应用
[0227]
1.aotrpc破坏株的制作
[0228]
以与例1同样的方式,将米曲霉rib40株的染色体dna作为模板,获得用于同源重组的上游区域1(ao上游区域1)和用于同源重组的下游区域1(ao下游区域1)的dna片段,然后制作质粒puc19上按顺序连接有ao上游区域1、aspyrg基因和ao下游区域1的构建用质粒paotrpc_hr。所使用的引物是序列号为31~34的引物。
[0229]
接着,以与例1同样的方式,使用质粒paotrpc_hr作为模板dna,将aotrpc破坏用组件扩增。所使用的引物是序列号为35~36的引物。
[0230]
以如上述的方式,获得按顺序连接有ao上游区域1—aspyrg—ao下游区域1的序列的aotrpc破坏用组件。
[0231]
如日本发明专利第5704609号公报中所描述的,使用米曲霉rkun16ptr1株(《mol.genet.genomics》,275:460,2006年,《biosci.biotechnol.biochem》,70:135,2006年;该文献的全部公开内容并入本文中。)作为用于制作aotrpc破坏株的宿主。另外,在rkun16ptr1株中,pyrg基因和ku70基因被破坏。
[0232]
在容量为500ml锥形瓶中,将米曲霉rkun16ptr1株的分生孢子接种于100ml含有10mm尿嘧啶的聚蛋白胨糊精液体培养基中,在30℃下进行约20小时振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的aotrpc破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有1mm色氨酸、0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行5天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化米曲霉。
[0233]
aotrpc被破坏的转化米曲霉,利用在aotrpc基因位置所插入的aspyrg基因而补充了宿主的尿嘧啶/尿苷缺陷型,取而代之地成为色氨酸缺陷型。
[0234]
接着,以与例1同样的方式,将转化米曲霉的染色体dna作为模板,利用pcr加以确认,由此筛选aotrpc基因被破坏的株。所使用的引物是序列号为9~10和37~38的引物。
[0235]
通过实施上述的pcr,而利用琼脂糖电泳确认不生成aotrpc基因来源的692bp的pcr产物,生成非破坏对象的aolig1基因来源的462bp的pcr产物,并筛选aotrpc破坏株。
[0236]
对于所筛选的aotrpc破坏株,通过进行pcr及pcr产物的限制酶消化处理,而确认利用同源重组将aotrpc破坏用组件导入。所使用的引物是序列号为14和39的引物。
[0237]
在aotrpc破坏株中,生成5.7kb的pcr产物,通过用kpni将其消化而生成2.5kb、2.1kb和1.2kb的片段。另外,在宿主中生成6.3kb的pcr产物,通过用kpni将其消化而生成3.5kb和2.8kb的片段。
[0238]
将确认利用同源重组而导入了aotrpc破坏用组件的aotrpc破坏株分别接种于含有或不含1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行5天培养,确认该株仅在含有色氨酸的培养基中生长。
[0239]
将aotrpc破坏株和作为对照的米曲霉rib40株接种于含有0.12%(w/v)5

faa和1mm色氨酸的沙氏葡萄糖琼脂培养基(bd公司)的平板上,在30℃下进行4天培养。rib40株完
全不生长,而aotrpc破坏株却生长。由此,确认aotrpc破坏株对5

faa显示耐性。
[0240]
此外,在将5

faa浓度改变为0.1%(w/v)并以同样的方式进行时,aotrpc破坏株与rib40株一同生长。因此可知,对于米曲霉使用0.12%(w/v)5

faa,由此可以筛选aotrpc破坏株。
[0241]
2.使用aotrpc标记基因的基因破坏
[0242]
作为破坏对象基因,根据米曲霉rib40株的公开基因组数据库(bioproject登记:prjna20809),使用位于sc102的1456616

1457378的区域的功能不明的预测基因。将该基因作为aohypg。
[0243]
以与例1同样的方式,将米曲霉rib40株的染色体dna作为模板,而获得用于同源重组的上游区域2(ao上游区域2)、aotrpc基因、用于环出的区域(ao环出区域1)和用于同源重组的下游区域2(ao下游区域2)的dna片段,然后制作质粒puc19上按顺序连接有ao上游区域2、aotrpc基因、ao环出区域1和ao下游区域2的构建用质粒paohypg_lo_trpc。所使用的引物是序列号为20和40~46的引物。
[0244]
以与例1同样的方式,使用上述所获得的质粒paohypg_lo_trpc作为模板dna,而获得aohypg破坏用组件。所使用的引物是序列号为47~48的引物。
[0245]
以如上述的方式,获得按顺序连接有ao上游区域2—aotrpc—ao环出区域1—ao下游区域2的序列的aohypg破坏用组件。
[0246]
利用以下的程序,制作aohypg破坏株。另外,将使用aohypg破坏用组件的aotrpc破坏株的转化的概要示于图7。如图7中所示,通过使用aohypg破坏用组件进行转化,而将trpc基因导入aotrpc破坏株的染色体上的hypg基因的基因座中,制作hypg基因发生缺失并且具有trpc基因的转化米曲霉。
[0247]
在容量为500ml的锥形瓶中,将米曲霉aotrpc破坏株的分生孢子接种于100ml含有1mm色氨酸的马铃薯葡萄糖液体培养基(bd公司)中,在30℃下进行约24小时的振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的aohypg破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行5天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化米曲霉。
[0248]
aohypg被破坏的转化米曲霉利用在aohypg基因位置所插入的aotrpc基因而补充了宿主的色氨酸缺陷型。
[0249]
以与例1同样的方式,从转化株中提取染色体dna再用pcr加以确认,由此筛选aohypg基因被破坏的株。所使用的引物是序列号为37~38和49~50的引物。
[0250]
通过实施上述的pcr,利用琼脂糖电泳确认不生成aohypg基因来源的702bp的pcr产物,而生成非破坏对象的aolig1来源的462bp的pcr产物,并筛选aohypg破坏株。
[0251]
对于所筛选的aohypg破坏株,通过进行pcr,而确认利用同源重组将aohypg破坏用组件导入。所使用的引物是序列号为51~52的引物。
[0252]
在aohypg破坏株中,生成8.6kb的pcr产物。另外,在宿主中生成4.3kb的pcr产物。
[0253]
3.导入的aotrpc标记基因的去除
[0254]
如图8中的概要所示,利用以下的程序,对利用环出将导入aohypg破坏株中的trpc基因加以去除的、trpc基因和hypg基因被去除的株进行筛选。
[0255]
将aohypg破坏株的分生孢子涂抹于含有1mm色氨酸和0.12%(w/v)5

faa的沙氏葡萄糖琼脂培养基(bd公司)的平板上,在30℃下进行5天以上的培养。
[0256]
从所生成的5

faa耐药株中提取染色体dna,使用序列号为51~52的引物进行pcr,由此利用琼脂糖凝胶电泳确认是发生环出而使aotrpc被去除的aotrpc去除株。将所生成的5

faa耐药株6个株作为对象的琼脂糖凝胶电泳的结果示于图9a。
[0257]
如图9a所示,在任一5

faa耐药株中,由于发生环出,而如所设想地生成2.7kb的产物。另外,在不发生环出的情况下,生成8.6kb的pcr产物。
[0258]
此外,从5

faa耐药株中提取染色体dna,使用序列号为9~10和37~38的引物进行pcr,由此利用琼脂糖电泳确认不生成aotrpc基因来源的692bp的pcr产物,而生成非破坏对象的aolig1基因来源的462bp的pcr产物。将5

faa耐药株6个株作为对象的琼脂糖凝胶电泳的结果示于图9b。筛选这些的6个株作为aotrpc去除株。
[0259]
此外,利用与例1同样的方法,确认aotrpc去除株仅在含有色氨酸的培养基中生长,即,是色氨酸缺陷型。此外,显示通过使用5

faa可以去除aotrpc。
[0260]
例3.trpc基因作为黑曲霉中的可用于标记循环法的选择标记基因的应用
[0261]
1.antrpc破坏株的制作
[0262]
以与例1同样的方式,将黑曲霉a1179株(δkusa、pyrg

;从真菌遗传学库存中心得到)的染色体dna作为模板,获得用于同源重组的上游区域1(an上游区域1)和用于同源重组的下游区域1(an下游区域1)的dna片段,然后制作质粒puc19上按顺序连接有an上游区域1、aspyrg基因和an下游区域1的构建用质粒pantrpc_hr。所使用的引物是序列号为53~56的引物。
[0263]
接着,以与例1同样的方式,使用质粒pantrpc_hr作为模板dna,将antrpc破坏用组件加以扩增。所使用的引物是序列号为57~58的引物。
[0264]
以如上述的方式,获得按顺序连接有an上游区域1—aspyrg—an下游区域1的序列的antrpc破坏用组件。
[0265]
在容量为500ml的锥形瓶中,将黑曲霉a1179株的分生孢子接种于100ml含有10mm尿嘧啶和10mm尿苷的马铃薯葡萄糖液体培养基(bd公司)中,在30℃下进行约16小时的振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的antrpc破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有1mm色氨酸、0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行4天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化黑曲霉。
[0266]
antrpc被破坏的转化黑曲霉,利用在antrpc基因位置所插入的aspyrg基因而补充了宿主的尿嘧啶缺陷型,取而代之地成为色氨酸缺陷型。
[0267]
接着,以与例1同样的方式,将转化黑曲霉的染色体dna作为模板,用pcr加以确认,由此筛选antrpc基因被破坏的株。所使用的引物是序列号为59~62的引物。
[0268]
通过实施上述的pcr,利用琼脂糖电泳确认不生成antrpc基因来源的420bp的pcr产物,而生成所导入的aspyrg基因来源的862bp的pcr产物,并筛选antrpc破坏株。
[0269]
对于所筛选的antrpc破坏株,进行pcr及pcr产物的限制酶消化处理,由此确认利用同源重组而导入了antrpc破坏用组件。所使用的引物是序列号为63~64的引物。
[0270]
在antrpc破坏株中,生成5.5kb的pcr产物,将其用kpni进行消化,由此生成2.4kb、
2.0kb和1.2kb的片段。另外,在宿主中,生成6.1kb的pcr产物,但该pcr产物不被kpni消化。
[0271]
将确认用同源重组而导入了antrpc破坏用组件的antrpc破坏株分别接种于含有或不含1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行7天培养,确认该株仅在含有色氨酸的培养基中生长。
[0272]
2.使用antrpc标记基因的基因破坏
[0273]
使用黑曲霉所具有的海藻糖
‑6‑
磷酸合成酶即tpsc的基因(bmc microbiol 14,90(2014年),参照网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3991884;该文献的全部公开内容并入本文中。)作为破坏对象基因。将该基因作为antpsc。
[0274]
以与例1同样的方式,将黑曲霉a1179株的染色体dna作为模板,获得用于同源重组的上游区域2(an上游区域2)、用于环出的区域(an环出区域1)、antrpc基因和用于同源重组的下游区域2(an下游区域2)的dna片段,然后制作质粒puc19上按顺序连接有an上游区域2、an环出区域1、antrpc基因和an下游区域2的构建用质粒pantpsc_lo_trpc。所使用的引物是序列号为65~72的引物。
[0275]
以与例1同样的方式,使用在上述中所获得的质粒pantpsc_lo_trpc作为模板dna,获得antpsc破坏用组件。所使用的引物是序列号为73~74的引物。
[0276]
以如上述的方式,获得按顺序连接有an上游区域2—an环出区域1—antrpc—an下游区域2的序列的antpsc破坏用组件。
[0277]
利用以下的程序,用antpsc破坏用组件对antrpc破坏株进行转化,由此制作antpsc破坏株。
[0278]
在容量为500ml的锥形瓶中,将黑曲霉antrpc破坏株的分生孢子接种于100ml含有1mm色氨酸的马铃薯葡萄糖液体培养基中,在30℃下进行约16小时的振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体和20μg的antpsc破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行4天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化黑曲霉。
[0279]
antpsc被破坏的转化黑曲霉,利用在antpsc基因位置所插入的antrpc基因而补充了宿主的色氨酸缺陷型。
[0280]
以与例1同样的方式,从转化株中提取染色体dna再用pcr加以确认,由此筛选antpsc基因被破坏的株。所使用的引物是序列号为61~62和75~76的引物。
[0281]
通过实施上述的pcr,而利用琼脂糖电泳确认不生成antpsc基因来源的430bp的pcr产物,而生成所导入的aspyrg基因来源的862bp的pcr产物,并筛选antpsc破坏株。
[0282]
对于所筛选的antpsc破坏株,通过进行pcr,而确认利用同源重组将antpsc破坏用组件导入。所使用的引物是序列号为77~78的引物。
[0283]
在antpsc破坏株中,生成9.1kb的pcr产物。另外,在宿主中,生成5.9kb的pcr产物。
[0284]
3.所导入antrpc标记基因的去除
[0285]
将antpsc破坏株的分生孢子涂抹于含有1mm色氨酸和0.015%(w/v)5

faa的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天以上的培养。
[0286]
使用从所生成的5

faa耐药株中提取染色体dna再用序列号为77~78的引物进行pcr,由此确认是发生环出而将antrpc去除的antrpc去除株。
[0287]
通过发生环出,而如设想的生成2.9kb的产物。另外,在不发生环出的情况下,生成
9.1kb的pcr产物。
[0288]
此外,利用与例1同样的方法,确认antrpc去除株仅在含有色氨酸的培养基中生长,即,是色氨酸缺陷型。此外,显示通过使用5

faa可以去除antrpc。
[0289]
例4.使aspyrg基因和astrpc基因缺失的双重破坏株的制作
[0290]
利用以下的程序,用aspyrg基因将酱油曲霉的aspyrg破坏株中的astrpc基因加以破坏,然后利用环出将所导入的aspyrg去除,由此制作aspyrg/astrpc双重破坏株。将aspyrg/astrpc双重破坏株的制作程序的概要示于图10。
[0291]
1.能够环出的astrpc破坏用组件的制作
[0292]
将例1中所制作的质粒ptrpc_hr作为模板,实施反向pcr及pcr产物的纯化,由此获得载体片段。所使用的引物是序列号为79~80的引物。
[0293]
将酱油曲霉nbrc4239株的染色体dna作为模板,实施pcr及pcr产物的纯化,由此获得用于环出的区域2(as环出区域2)。所使用的引物是序列号为81~82的引物。
[0294]
按照例1的(1

2)中描述的方法,将所获得的载体片段与as环出区域2加以连接,获得在puc19的多克隆位点按顺序连接有as上游区域1—as环出区域2—aspyrg—as下游区域1的序列的质粒。将所获得的质粒作为ptrpc_lo_pyrg。
[0295]
接着,以与例1的(1

3)同样的方式,使用质粒质粒ptrpc_lo_pyrg作为模板dna,将能够环出的astrpc破坏用组件加以扩增。所使用的引物是序列号为7~8的引物。
[0296]
以如上述的方式,获得按顺序连接有as上游区域1—as环出区域2—aspyrg—as下游区域1的序列的能够环出的astrpc破坏用组件。
[0297]
2.astrpc破坏株的制作
[0298]
按照例1的(1

4)中描述的方法,用能够环出的astrpc破坏用组件,对酱油曲霉kp

del株进行转化,由此获得转化酱油曲霉。
[0299]
astrpc被破坏的转化酱油曲霉,利用在astrpc基因的位置所插入的aspyrg基因补充了宿主的尿嘧啶/尿苷缺陷型,取而代之地成为色氨酸缺陷型。
[0300]
用0.01%(w/v)吐温80溶液,从生成转化酱油曲霉的平板中将分生孢子加以回收。将在相同溶液中适当稀释的分生孢子悬浮液涂抹于含有0.04%(w/v)5

faa和1mm色氨酸的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养。
[0301]
将所生成的5

faa耐药株分别接种于含有或不含1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养,对仅在含有色氨酸的培养基中生长的株,即,显示色氨酸缺陷型的株进行筛选。
[0302]
从色氨酸缺陷型的株中提取染色体dna,进行pcr及pcr产物的限制酶消化,由此利用琼脂糖凝胶电泳确认用同源重组而导入了能够环出的astrpc破坏用组件。所使用的引物是序列号为13和83的引物。
[0303]
在astrpc破坏株中生成8.8kb的pcr产物,即使将其用bamhi进行消化也不被切断。另外,在宿主中生成8.2kb的pcr产物,将其用bamhi进行消化,由此生成4.3kb和3.8kb的片段。
[0304]
3.aspyrg/astrpc双重破坏株的制作
[0305]
将在上述中所获得astrpc破坏株的分生孢子涂抹于含有1mm色氨酸、20mm尿嘧啶和0.3%(w/v)5

foa的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行5天以上的培
养,由此筛选5

foa耐药株。另外,5

foa(5

氟乳清酸;fluorochem公司)是将1.2%水溶液调节为ph 6,接着进行膜过滤灭菌,将其以最终浓度成为上述浓度的方式添加到培养基中而使用。
[0306]
从5

foa耐药株中提取染色体dna,使用序列号13和83的引物进行pcr,由此确认5

foa耐药株是通过发生环出而从astrpc破坏株中进一步去除了aspyrg基因的aspyrg/astrpc双重破坏株。即,利用该pcr,确认在环出后如所设想地生成3.9kb的pcr产物。另外,如上所述,在环出前所获得的pcr产物为8.8kb。
[0307]
4.色氨酸缺陷型和尿嘧啶缺陷型的确认
[0308]
将aspyrg/astrpc双重破坏株接种于下述(1)~(4)中所示的四种琼脂培养基的平板上,在30℃下进行5天以上的培养。
[0309]
(1)czapek

dox最低琼脂培养基
[0310]
(2)含有1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基
[0311]
(3)含有20mm尿嘧啶的czapek

dox最低琼脂培养基
[0312]
(4)含有1mm色氨酸和20mm尿嘧啶的czapek

dox最低琼脂培养基
[0313]
已确认,aspyrg/astrpc双重破坏株仅在含有上述(4)的色氨酸和尿嘧啶的培养基中生长,对于色氨酸和尿嘧啶的两者均显示缺陷型。
[0314]
5.5

foa耐性和5

faa耐性的确认
[0315]
使用非破坏株(酱油曲霉nbrc4239株)、aspyrg破坏株(酱油曲霉kp

del株)、astrpc破坏株(在例1中制作)和aspyrg/astrpc双重破坏株,利用以下的程序,对这些菌株的5

foa耐性和5

faa耐性进行了评价。
[0316]
将这些菌株接种于含有1mm色氨酸、20mm尿嘧啶以及表3所示浓度的5

foa和5

faa的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养。根据平板中有无集落的形成,确认各菌株的5

foa耐性和5

faa耐性。
[0317]
[表3]
[0318][0319]“ ”:生长,
“‑”
:不生长
[0320]
aspyrg破坏株和astrpc破坏株由于分别在培养基中存在5

faa和5

foa,因而不能生长。
[0321]
在例1中,在δtrpc株的筛选中使用了0.04%(w/v)5

faa。此外,在例4中,在δpyrg株的筛选中,使用了0.3%(w/v)5

foa。但是,如表3所示,在单独使用这些试剂时的药物浓度(0.3%(w/v)5

foa和0.04%(w/v)5

faa)下联用的情况下,任何菌株均不生长。
[0322]
另一方面,在将这两种药物的浓度降低至1/2,进而降低至1/4而使用时,仅有aspyrg/astrpc双重破坏株生长。即使将浓度降低至1/4也显示效果,因此可知5

foa与5

faa显示协同效果。已判明,通过使用这样的培养基,可以筛选aspyrg/astrpc双重破坏株。
[0323]
例5.作为可用于标记循环法的选择标记基因的pyrg基因与trpc基因的同时使用
[0324]
1.asnph破坏用组件的制作
[0325]
作为破坏对象基因,将根据酱油曲霉nbrc4239株的公开基因组数据库(bioproject登记:prjda60265),预测在支架00033(df093572.1)的1904082

1905244的区域的蛋白酶的基因作为对象。将该基因作为asnph基因。
[0326]
按照例1的(1

2)中描述的方法,制作质粒puc19上按顺序连接有用于同源重组的上游区域2(as上游区域3)、用于环出的区域3(as环出区域3)、aspyrg基因和用于同源重组的下游区域3(as下游区域3)的质粒pnph_lo_pyrg。所使用的引物是序列号为84~89的引物。另外,aspyrg基因的dna片段是使用在例1的(1

2)中所制作的dna片段。
[0327]
将所获得的质粒pnph_lo_pyrg用作模板dna,按照上述(1

3)的描述而实施pcr和pcr产物的纯化,由此获得asnph破坏用组件。所使用的引物是序列号为90~91的引物。
[0328]
以如上述的方式,获得按顺序连接有as上游区域3—as环出区域3—aspyrg—as下游区域3的序列的asnph破坏用组件。
[0329]
2.asparp1/asnph双重破坏株的制作
[0330]
将从使用asparp1破坏用组件和asnph破坏用组件的aspyrg/astrpc双重破坏株的转化的asparp1/asnph双重破坏株的制作到对aspyrg标记基因和astrpc标记基因进行环出所获得aspyrg/astrpc双重去除株的制作的程序的概要示于图11。
[0331]
在容量为500ml的锥形瓶中,将例4中所制作的酱油曲霉aspyrg/astrpc双重破坏株的分生孢子接种于100ml含有1mm色氨酸、20mm尿嘧啶和20mm尿苷的马铃薯葡萄糖液体培养基中,在30℃下进行约24小时的振荡培养,然后将菌体回收。由所回收的菌体制备原生质体。使用所获得的原生质体以及20μg的asparp1破坏用组件(在例1中制作)和20μg的asnph破坏用组件,利用原生质体peg法进行转化,接着使用含有0.5%(w/v)琼脂和1.2m山梨糖醇的czapek

dox最低培养基,在30℃下进行5天以上的培养,获得具有集落形成能力的转化酱油曲霉。
[0332]
作为宿主的aspyrg/astrpc双重破坏株的尿嘧啶缺陷型和色氨酸缺陷型,分别利用所导入的aspyrg基因和astrpc基因得到补充。另外,仅补充单方面缺陷型的株在上述培养基中不能生长。
[0333]
按照上述(1

5)的描述,从转化株中提取染色体dna再用pcr加以确认,由此筛选asparp1基因和asnph基因两者被破坏的株。所使用的引物是序列号为25~28和92~93的引物。
[0334]
通过实施上述的pcr,而利用琼脂糖电泳确认不生成asparp1基因来源的460bp的pcr产物和asnph来源的291bp的pcr产物,而生成非破坏对象的asptef启动子来源的720bp的pcr产物。将琼脂糖凝胶电泳的结果示于图12中。筛选图12中所示的转化株7、9和13作为asparp1/asnph双重破坏株。
[0335]
对于所筛选的asparp1/asnph双重破坏株,通过用pcr加以确认,而确认了共同地利用同源重组而导入asparp1破坏用组件和asnph破坏用组件。所使用的引物是序列号为29~30和94~95的引物。
[0336]
通过将asparp1基因加以破坏,而生成9.6kb的pcr产物。另外,在宿主中生成5.3kb的pcr产物。此外,通过将asnph基因加以破坏而生成8.5kb的pcr产物。另外,在宿主中生成
5.9kb的pcr产物。
[0337]
3.所导入aspyrg标记基因和astrpc标记基因的去除
[0338]
(3

1)同时环出
[0339]
将asparp1/asnph双重破坏株的分生孢子涂抹于含有1mm色氨酸、20mm尿嘧啶、0.08%(w/v)5

foa和0.01%(w/v)5

faa的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上,在30℃下进行10天以上的培养。
[0340]
已确认,通过将所生成的5

foa耐药/5

faa耐药株接种于相同组成的琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养而使其生长。
[0341]
从确认生长的株中提取染色体dna,使用序列号为29~30、94~95、9~10、11~12和61~62的引物进行pcr,由此利用琼脂糖凝胶电泳确认是aspyrg标记基因和astrpc标记基因被去除的株。在上述2中,将作为asparp1/asnph双重破坏株而筛选的转化株13的环出后的3个株作为对象的琼脂糖凝胶电泳的结果示于图13a~图13b。
[0342]
如图13a所示,通过在原来asparp1基因存在的区域附近发生环出,而如所设想地生成3.0kb的产物。另外,在不发生环出的情况下,生成9.6kb的pcr产物。
[0343]
如图13b所示,通过在原来asnph基因存在的区域附近发生环出,而如所设想地生成3.4kb的产物。另外,在不发生环出的情况下,生成8.5kb的pcr产物。
[0344]
利用琼脂糖电泳确认:不生成aspyrg基因来源的862bp的pcr产物和astrpc基因来源的692bp的pcr产物,而生成非破坏对象的aslig1基因来源的439bp的pcr产物。将结果示于图13c。基于这些结果,筛选上述转化株13的环出后的3个株作为aspyrg/astrpc双重去除株。
[0345]
将aspyrg/astrpc双重去除株接种于下述(1)~(4)中所示的四种琼脂培养基的平板上,在30℃下进行5天以上的培养。
[0346]
(1)czapek

dox最低琼脂培养基
[0347]
(2)含有1mm色氨酸的czapek

dox最低琼脂培养基
[0348]
(3)含有20mm尿嘧啶的czapek

dox最低琼脂培养基
[0349]
(4)含有1mm色氨酸和20mm尿嘧啶的czapek

dox最低琼脂培养基
[0350]
已确认:aspyrg/astrpc双重去除株仅在含有上述(4)的色氨酸和尿嘧啶的培养基中生长,对于色氨酸和尿嘧啶的两者显示缺陷型。由此确认,两种标记基因同时进行了环出。
[0351]
(3

2)二阶段环出
[0352]
将asparp1/asnph双重破坏株的分生孢子涂抹于含有20mm尿嘧啶和0.3%(w/v)5

foa的czapek

dox最低琼脂培养基的平板上,在30℃下进行5天以上的培养。从5

foa耐药株(aspyrg去除株)生成的平板中,使用0.01%(w/v)吐温80溶液将分生孢子加以回收,用相同溶液进行适当稀释,由此制备分生孢子悬浮液。
[0353]
将适量的所获得的分生孢子悬浮液涂抹于含有1mm色氨酸、20mm尿嘧啶、0.08%(w/v)5

foa和0.01%(w/v)5

faa的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养。
[0354]
已确认,通过将所生成的5

foa/5

faa耐药株接种于相同组成的琼脂培养基的平板上,在30℃下进行4天培养,由此使其生长。
[0355]
从确认生长的株中提取染色体dna,利用上述例5的(3

1)中所描述的方法进行pcr,由此确认是aspyrg标记基因和astrpc标记基因被去除的aspyrg/astrpc双重去除株。
[0356]
此外,利用上述例5的(3

1)中所描述的方法,确认了aspyrg/astrpc双重去除株对于尿嘧啶和色氨酸两者显示缺陷型。由此确认两种标记基因进行了2阶段环出。
[0357]
[产业上的可利用性]
[0358]
作为本发明一个方面的转化曲霉属微生物、组合物及方法,可以在食品工业中高效率地实施应用价值较高的曲霉属微生物的转化,进而能够迅速地对由于曲霉属微生物所具有的结构或功能上类似或相关的基因的同时破坏所形成的新表型进行检测。
[0359]
[相关申请的相互参照]
[0360]
本申请要求2018年11月5日提交的日本专利申请2018

208022号和2019年6月12日提交的日本专利申请2019

109602号的优先权,它们的全部公开内容被引用于本文中。

技术特征:
1.一种转化曲霉属微生物,其是染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(aspergillus)微生物,所述选择标记基因包括色氨酸生物合成基因及与色氨酸生物合成基因不同的基因。2.一种组合物,其是包含至少两种在同源重组区域中包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的曲霉属微生物转化用组合物,所述核酸片段包括所述选择标记基因是色氨酸生物合成基因的核酸片段及所述选择标记基因是与色氨酸生物合成基因不同的基因的核酸片段。3.根据权利要求1至2中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)以外的曲霉属微生物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因。5.根据权利要求1至4中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自尿嘧啶生物合成基因、硫酸盐代谢基因和硝酸盐代谢基因的选择标记基因。6.根据权利要求1至5中任一项所述的转化曲霉属微生物或组合物,其中,所述色氨酸生物合成基因是trpc基因,并且与色氨酸生物合成基因不同的基因是选自pyrg基因、niad基因和sc基因中的至少一种基因。7.一种包括下述步骤(1)~步骤(3)的、染色体上的可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物的制造方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因:(1)用在同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的核酸片段,将染色体上的第二选择标记基因作为靶,对染色体上的第一选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;(2)在与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(1)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因并且染色体上的第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤;以及(3)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质存在的条件下,将在所述步骤(2)中被筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。8.一种包括下述步骤(a)~步骤(b)的、利用可用于标记循环法的第一选择标记基因和可用于标记循环法的第二选择标记基因的、转化曲霉属微生物的染色体上的两种靶基因的缺失方法,该第一选择标记基因和该第二选择标记基因中的一个是色氨酸生物合成基因,另一个是补充营养性物质的缺陷型并且参与由该营养性物质的类似物向毒性物质的生物合成的基因:(a)用在针对第一靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第一选择标记基因的第一核酸片段及在针对第二靶基因的同源重组区域中包括环出区域和第二选择标记基因的第
二核酸片段,将该第一靶基因和该第二靶基因作为靶,将染色体上的第一选择标记基因和第二选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行同源重组,由此获得转化曲霉属微生物的步骤;以及(b)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质不存在的条件下,将在所述步骤(a)中所获得的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上插入有所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。9.根据权利要求8所述的方法,其还包括下述的步骤(c):(c)在与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物以及与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质和该营养性物质的类似物存在的条件下,将在所述步骤(b)中所筛选的转化曲霉属微生物进行培养,由此对染色体上的所述第一选择标记基因、所述第二选择标记基因、所述第一靶基因和所述第二靶基因发生缺失的转化曲霉属微生物进行筛选的步骤。10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述第一选择标记基因是色氨酸生物合成基因,与所述第一选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

faa,且该5

faa的浓度为0.005%(w/v)~0.02%(w/v),并且,所述第二选择标记基因是pyrg基因,与所述第二选择标记基因相对应的营养性物质的类似物是5

foa,且该5

foa的浓度为0.05%(w/v)~0.15%(w/v)。11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法,其中,所述转化曲霉属微生物是宿主生物为除棘孢曲霉以外的曲霉属微生物。
技术总结
本发明的目的在于提供一种至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属微生物、以及用于该转化曲霉属微生物的使用的组合物。上述目的是通过染色体上的至少两种可用于标记循环法的选择标记基因发生缺失的转化曲霉属(Aspergillus)微生物、以及包含至少两种在同源重组区域之间包括环出区域和可用于标记循环法的选择标记基因的核酸片段的曲霉属微生物转化用组合物而实现,其中所述选择标记基因包括色氨酸生物合成基因和与色氨酸生物合成基因不同的基因。色氨酸生物合成基因不同的基因。色氨酸生物合成基因不同的基因。


技术研发人员:原精一
受保护的技术使用者:龟甲万株式会社
技术研发日:2019.11.04
技术公布日:2021/6/29

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