本发明涉及了一种同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，属于食品检测
技术领域：
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背景技术：
：风味是奶酪产品最重要的品质特征之一，直接影响着消费者的最直观感受。奶酪中风味物质众多，目前已鉴定出数百种香气化合物，主要包括脂肪酸、醇、醛、酮、酯、内酯、吡嗪、含硫化合物、胺等。其中，内酯类化合物是奶酪风味中一类重要的香气化合物，其能赋予奶酪以水果香味和甜味，同时还可调和其他挥发性成分使得整体风味更加柔和，在奶酪整体风味形成过程中发挥着重要作用。奶酪中的内酯类物质主要包括γ-内酯和δ-内酯两大类，它们分别是具有五元环和六元环的稳定结构。奶酪中常见的内酯包括γ-辛内酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯和δ-辛内酯、δ-癸内酯、δ-十二内酯等。作为奶酪中一类微量风味组分，内酯类物质含量通常不是很高，但由于其阈值相对较低，它们在很多奶酪中均具有较强的风味贡献，通常赋予奶酪以椰子味、杏子味、桃子味等水果香气和甜味。目前，对于内酯类化合物的检测主要采用气相色谱、高效液相、色谱和质谱等方法，常用的前处理方式主要包括顶空固相微萃取、液液萃取和溶剂辅助风味蒸发等。其中，溶剂辅助风味蒸发是近年来发展的风味提取新技术，其基于低温、高真空条件，能从复杂食品基质中抽提得到真正、可靠的风味提取物，尤其适于奶酪等脂肪含量较高的食品基质。此外，与许多其它成熟的现代风味分离方法相比，该方法对食品中微量风味组分的定量测定更为可靠。切达奶酪是以牛奶为原料，经浓缩、发酵、成熟等工序制成的具有较高营养价值的发酵乳制品，长时间的发酵过程(9-24个月)使其具有了复杂的风味组分以及独特的风味特征。目前，国内对内酯类化合物检测的对象主要包括白酒、香烟、化妆品等，对于切达酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物检测的报道较少，也缺乏相关研究及检测标准。因此，研究切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物定性、定量检测方法，对于明晰内酯类物质在切达奶酪中的具体组成以及实现对其的准确检测具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便、准确度高的检测切达奶酪中的γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，包括以下步骤：步骤1：对奶酪样品进行有机溶剂萃取，萃取完成后通过离心、分液处理得澄清样液；步骤2：将步骤1得到的澄清样液进行溶剂辅助风味蒸发提取，提取所得馏出液进行氮吹浓缩，得到浓缩液；步骤3：取浓缩液进行gc-ms测定，对测定结果进行定性及定量分析。优选地，所述步骤1中的有机溶剂为二氯甲烷和乙醚中的至少一种。优选地，所述步骤1中的奶酪样品的质量与有机溶剂的体积之比为1：2～5g/ml。优选地，所述步骤1的具体过程包括：首先将有机溶剂加入到切碎的奶酪样品中进行萃取，在4-10℃、150r/min下摇床振荡3-4h，得萃取液；然后将所得萃取液在4℃、6000rpm下离心5min，通过分液漏斗对两相进行分离得澄清样液。优选地，所述步骤2中safe处理的条件为：真空度10-5torr，恒温50℃。优选地，所述步骤2中氮吹浓缩的温度为15-20℃，压力为5-10pa。优选地，所述步骤3中gc-ms测定的条件包括：色谱柱：hp-innowax毛细管柱，规格：60m×0.25mm×0.25μm；载气：氦气，流速：1ml/min；传输线温度：280℃，进样口温度：250℃；进样方式：液体进样，进样量：1μl；电离方式：ei电子轰击电离，电离能量：70ev；扫描方式：scan全扫描和sim选择离子扫描；升温程序：柱初温40℃，保持4min，以5℃/min的速率升温至100℃，保持2min，最后以3℃/min升至200℃，保持15min，总分析时长66.3min。优选地，所述步骤3中γ-内酯和δ-内酯类化合物的定性分析具体为：将gc-ms检测结果与nist17谱库进行比较，相应内酯类化合物与其标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处出现，同时对应质谱碎片离子的质荷比一致，则认为该物质为相应的γ-内酯或δ-内酯。优选地，所述步骤3中γ-内酯和δ-内酯类化合物的定量分析具体为：配置标准工作溶液，以标准工作溶液中内酯类化合物与内标的浓度之比为横坐标，以色谱图中内酯类化合物与内标的峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准曲线回归方程；将相同条件下测得的奶酪样品浓缩液中内酯类化合物与内标的色谱峰面积比，代入标准曲线回归方程计算相应内酯类化合物的含量。更优选地，所述的内标为2-辛醇。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1.本发明的方法采用溶剂辅助风味蒸发(safe)对样品进行前处理，能够有效提高内酯类化合物的提取率及回收率且操作简便、重复性好；本发明弥补了切达奶酪中内酯类化合物检测方法的缺失，能够同时、准确、快速定性定量测定切达奶酪中11种γ-内酯和δ-内酯类化合物；2.本发明的方法定量测定切达奶酪中11种γ-内酯和δ-内酯类化合物，平均回收率为89.3～112.1％，选择性强；相对标准偏差(rsd)在1.9～3.5％之间，重复性好；各物质检出限为10.2～25.8μg/kg，定量限为30.1～72.2μg/kg，满足痕量分析检测要求。附图说明图1为混合基质标准工作溶液的色谱图；图2为10种切达奶酪样品中γ-内酯和δ-内酯的检测结果。具体实施方式为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例1：十一种内酯类化合物gc-ms检测方法的确定(1)内标溶液的制备：准确称取0.22g2-辛醇于100ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度。内标溶液于4℃下保存，有效期3个月；(2)11种γ-内酯和δ-内酯混合标准溶液a的制备：分别称取0.1g(精确至0.1mg)11种γ-内酯和δ-内酯标准品，用二氯甲烷作溶剂定容至100ml容量瓶中，配制浓度为1mg/ml的混合标准溶液a。混合标准溶液a于4℃下保存，有效期3个月。(3)11种γ-内酯和δ-内酯混合标准溶液b的制备：准确移取5ml混合标准溶液a，置于50ml容量瓶中，以二氯甲烷定容至刻度，配制浓度为100μg/ml的混合标准溶液b。混合标准溶液b于4℃下保存，有效期3个月。(4)混合基质标准工作溶液配置：为避免基质效应，配置基质标准工作溶液作为定量依据。准确移取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml和2ml混合标准溶液b，置于25ml离心管中，加入20μl内标溶液，以二氯甲烷定容至刻度，制备标准工作溶液，其浓度分别为：0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。选用新鲜制作的切达奶酪作为空白基质，在空白基质中加入不同浓度标准工作溶液，通过safe处理后得到混合基质标准工作溶液。混合基质标准工作溶液于4℃下保存，有效期3个月。(5)gc-ms分析：具体分析条件为：色谱柱：hp-innowax毛细管柱，规格：60m×0.25mm×0.25μm；载气：氦气，流速：110ml/min；传输线温度：280℃，进样口温度：250℃；进样方式：不分流、液体进样，进样量：1μl；电离方式：ei电子轰击电离，电离能量：70ev；扫描方式：scan全扫描和sim选择离子扫描，全质量扫描范围m/z30～450；升温程序：柱初温40℃，保持4min，以5℃/min的速率升温至100℃，保持2min，最后以3℃/min升至200℃，保持15min。11种γ-内酯和δ-内酯定量和定性选择离子见表1，混合基质标准工作溶液的色谱图如图1所示。结果显示，以该方法检测混合基质标准工作溶液，γ-内酯和δ-内酯类化合物色谱峰分离度高，谱峰对称性好，峰形尖锐，基线分离，无拖尾及峰重叠、干扰现象。表1十一种γ-内酯和δ-内酯类化合物定量和定性选择离子表实施例2：十一种内酯类化合物标准工作曲线确定选用新鲜制作的切达奶酪作为空白基质，在空白基质中加入不同浓度标准工作溶液以及20μl2-辛醇(浓度为220mg/l)，通过safe处理后得到混合基质标准工作溶液进行分析，以混合基质标准工作溶液中11种γ-内酯和δ-内酯类化合物和内标物2-辛醇的色谱峰面积为纵坐标(y)，对应的质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，进行回归分析，得到回归方程及相关系数如表2所示。表2各内酯化合物的标准工作曲线及相关系数内酯化合物标准工作曲线相关系数γ-丁内酯y＝0.2655x 0.02180.9921γ-辛内酯y＝0.2163x 0.23130.9903γ-壬内酯y＝0.1635x 0.65020.9953γ-癸内酯y＝0.2325x 0.15140.9905γ-十一内酯y＝0.2401x 0.19260.9909γ-十二内酯y＝0.2031x 0.01550.9976δ-己内酯y＝0.105x 0.07110.9914δ-辛内酯y＝0.2972x 0.14530.9923δ-壬内酯y＝0.1923x 0.06850.9941δ-癸内酯y＝0.2832x 0.11460.9952δ-十二内酯y＝0.2252x 0.14430.9946实施例3：待测奶酪中内酯类化合物的测定称取30g切碎的切达奶酪样品于250ml锥形瓶中，加入60ml二氯甲烷，用纱布及棉绳扎紧瓶口，在4℃、150r/min摇床中震荡3h得萃取液；将所得萃取液在4℃、6000rpm下离心5min，通过分液漏斗对两相进行分离得澄清样液。对所得澄清样液在真空度为10-5torr，循环水浴保持恒温50℃时进行溶剂辅助风味蒸发(safe)处理。处理完成后对收集瓶中液体进行氮吹浓缩，氮吹温度设定为15℃，氮吹压力维持在5pa。氮吹完成后取浓缩液用于gc-ms分析。待测样品中11种内酯类化合物的检测方法如实施例1所示，经过上述预处理方法和检测方法，能够检测出待测样品中的11种γ-内酯和δ-内酯类物质。实施例4：待测奶酪中内酯类化合物的测定称取30g切碎的切达奶酪样品于250ml锥形瓶中，加入100ml二氯甲烷，用纱布及棉绳扎紧瓶口，在7℃、150r/min摇床中震荡3.5h得萃取液；将所得萃取液在4℃、6000rpm下离心5min，通过分液漏斗对两相进行分离得澄清样液。对所得澄清样液在真空度为10-5torr，循环水浴保持恒温50℃时进行溶剂辅助风味蒸发(safe)处理。处理完成后对收集瓶中液体进行氮吹浓缩，氮吹温度设定为18℃，氮吹压力维持在8pa。氮吹完成后取浓缩液用于gc-ms分析。待测样品中11种内酯类化合物的检测方法如实施例1所示，经过上述预处理方法和检测方法，能够检测出待测样品中的11种γ-内酯和δ-内酯类物质。实施例5：待测奶酪中内酯类化合物的测定称取30g切碎的切达奶酪样品于250ml锥形瓶中，加入150ml二氯甲烷，用纱布及棉绳扎紧瓶口，在10℃、150r/min摇床中震荡4h得萃取液；将所得萃取液在4℃、6000rpm下离心5min，通过分液漏斗对两相进行分离得澄清样液。对所得澄清样液在真空度为10-5torr，循环水浴保持恒温50℃时进行溶剂辅助风味蒸发(safe)处理。处理完成后对收集瓶中液体进行氮吹浓缩，氮吹温度设定为20℃，氮吹压力维持在10pa。氮吹完成后取浓缩液用于gc-ms分析。待测样品中11种内酯类化合物的检测方法如实施例1所示，经过上述预处理方法和检测方法，能够检测出待测样品中的11种γ-内酯和δ-内酯类物质。效果例1：11种内酯类化合物检出限的确定以gc-ms分析信噪比s/n＝3时所测浓度作为检出限，信噪比s/n＝10时所测浓度作为定量限。11种γ-内酯和δ-内酯类化合物检出限和定量限如表3所示。表3各内酯化合物的检出限和定量限化合物名称检出限(μg/kg)定量限(μg/kg)γ-丁内酯15.846.3γ-辛内酯12.335.5γ-壬内酯16.549.0γ-癸内酯12.132.6γ-十一内酯10.533.3γ-十二内酯21.260.5δ-己内酯13.642.1δ-辛内酯10.230.1δ-壬内酯25.872.2δ-癸内酯17.954.8δ-十二内酯14.944.9效果例2：精密度及加标回收率实验为验证方法的准确性，在没有被测物质的空白基质中分别添加低、中、高三种浓度水平的混合标准溶液，在标准加入量分别为0.5、5、10mg/kg水平下进行加标回收率实验，每个浓度做6次平行，并根据测定结果计算11种γ-内酯和δ-内酯类化合物的平均回收率及相对标准偏差(rsd％)，结果详见表4。由表4数据可知，采用实施例1的检测方法，11种γ-内酯和δ-内酯的平均回收率在89.3～112.1％范围内，相对标准偏差(rsd)在1.9～3.5％之间，说明本方法的准确性高，重复性好，回收率与精密度均符合γ-内酯和δ-内酯的分析要求，适合这类物质的准确定量，可应用于实际切达奶酪样品的测定。表4各内酯化合物平均回收率及相对标准偏差效果例3市售切达样品中11种γ-内酯和δ-内酯的检测应用所建立的方法对国内市场上购买的10种切达奶酪样品(编号为1～10)中11种γ-内酯和δ-内酯进行检测，每个样品平行测定3次，计算样品中所含内酯类化合物的含量。10种切达奶酪样品信息如表5所示。表5十种切达奶酪样品信息样品编号产地名称成熟时间1爱尔兰金凯利早期2爱尔兰金凯利成熟3英国酷币城堡早期4英国酷币城堡成熟5英国威客农场早期6英国威客农场成熟7美国水晶农场早期8美国水晶农场成熟9美国荷氏农场早期10美国荷氏农场成熟样品1-3采用实施例3所述方法进行预处理，样品4-6采用实施例4所述进行方法预处理，样品7-10采用实施例5所述方法进行预处理。检测方法同实施例1，并采用实施例2的标准工作曲线进行定量，定量结果如图2所示。由图2可知，在10个样品中共检出9种内酯，分别为γ-丁内酯、γ-辛内酯、γ-十一内酯、γ-十二内酯、δ-己内酯、δ-辛内酯、δ-壬内酯、δ-癸内酯、δ-十二内酯。结果表明，本发明提供的方法能够同时、快速、准确对切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物进行定性、定量分析。上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：对奶酪样品进行有机溶剂萃取，萃取完成后通过离心、分液处理得澄清样液；
步骤2：将步骤1得到的澄清样液进行溶剂辅助风味蒸发提取，提取所得馏出液进行氮吹浓缩，得到浓缩液；
步骤3：取浓缩液进行gc-ms测定，对测定结果进行定性及定量分析。
2.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤1中的有机溶剂为二氯甲烷和乙醚中的至少一种。
3.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤1中的奶酪样品的质量与有机溶剂的体积之比为1：2～5g/ml。
4.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤1的具体过程包括：首先将有机溶剂加入到切碎的奶酪样品中进行萃取，在4-10℃、150r/min下摇床振荡3-4h，得萃取液；然后将所得萃取液在4℃、6000rpm下离心5min，通过分液漏斗对两相进行分离得澄清样液。
5.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤2中safe处理的条件为：真空度10-5torr，恒温50℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中氮吹浓缩的温度为15-20℃，压力为5-10pa。
7.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤3中gc-ms测定的条件包括：
色谱柱：hp-innowax毛细管柱，规格：60m×0.25mm×0.25μm；
载气：氦气，流速：1ml/min；
传输线温度：280℃，进样口温度：250℃；
进样方式：液体进样，进样量：1μl；
电离方式：ei电子轰击电离，电离能量：70ev；
扫描方式：scan全扫描和sim选择离子扫描；
升温程序：柱初温40℃，保持4min，以5℃/min的速率升温至100℃，保持2min，最后以3℃/min升至200℃，保持15min，总分析时长66.3min。
8.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤3中γ-内酯和δ-内酯类化合物的定性分析具体为：将gc-ms检测结果与nist17谱库进行比较，相应内酯类化合物与其标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处出现，同时对应质谱碎片离子的质荷比一致，则认为该物质为相应的γ-内酯或δ-内酯。
9.如权利要求1所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述步骤3中γ-内酯和δ-内酯类化合物的定量分析具体为：配置标准工作溶液，以标准工作溶液中内酯类化合物与内标的浓度之比为横坐标，以色谱图中内酯类化合物与内标的峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准曲线回归方程；将相同条件下测得的奶酪样品浓缩液中内酯类化合物与内标的色谱峰面积比，代入标准曲线回归方程计算相应内酯类化合物的含量。
10.如权利要求9所述的同时检测切达奶酪中γ-内酯和δ-内酯类化合物的方法，其特征在于，所述的内标为2-辛醇。
技术总结本发明公开了一种同时检测切达奶酪中γ‑内酯和δ‑内酯类化合物的方法。本发明的方法采用溶剂辅助风味蒸发法对切达奶酪样品进行前处理后再进行GC‑MS测定，包括以下步骤：1)对奶酪样品进行溶剂萃取，萃取完成后通过离心、分液处理得澄清样液；2)将步骤1)得到的澄清样液进行SAFE处理，处理完成后对所得馏出液进行氮吹浓缩；3)取浓缩液进行GC‑MS测定，对奶酪样品中所含γ‑内酯和δ‑内酯类化合物进行定性及定量分析。该方法操作简便、选择性好、灵敏度高，能够同时准确、快速的测定切达奶酪中所含γ‑内酯和δ‑内酯类化合物种类及含量，对研究切达奶酪中γ‑内酯和δ‑内酯类化合物的具体组成及其形成机理具有重要意义。
技术研发人员：陈臣;刘政;田怀香;于海燕;黄娟;袁海彬;张晓丛;刘瑶
受保护的技术使用者：上海应用技术大学
技术研发日：2021.05.17
技术公布日：2021.08.03
