本发明属于环境污染物毒性评估技术领域，具体是一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法。
背景技术：
污染物在环境中通常以各种形式和浓度共存，各组分间会产生联合毒性作用，从而构成潜在的环境风险。尤其在科学家发现多种污染物以无效应浓度混合仍可能产生明显毒性后，污染物的联合毒性研究引起广泛重视。关于污染物联合毒性作用评估的方法有多种，但要准确全面评估混合物体系的联合毒性效应，则必须选择合适的评估模型。目前在混合物毒性研究中常用的评估模型是浓度加和(concentrationaddition,ca)模型，其具有评估风险较为保守的优点。联合作用中的协同作用即为混合物毒性大于各组分单独作用毒性总和，拮抗作用则相反。浓度加和模型评估中，如果混合物观测毒性偏离预测毒性，则认为该混合物具有毒性相互作用，当高于预测毒性时为协同作用，低于预测毒性时为拮抗作用。
大量研究发现混合物组分毒性相互作用具有浓度比依赖性，这就需要合理的方法来对联合毒性进行表征，以保障评价结果的可靠性。然而，传统浓度加和模型评估联合毒性中，无法给出预测毒性与观测毒性的偏离程度，必须依赖主观判断来确定毒性相互作用强度，评估结果缺乏说服力。此外，不同污染物对受试生物的毒性作用机理不同，因而毒性作用范围有所差异，基于主观判断的传统浓度加和模型则无法合理比较不同混合物的毒性相互作用强度。
在现有技术中均未涉及如本发明所示的定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有毒性评估中的缺陷，提供一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，可使评估结果更具说服力，且便于技术人员用于后续分析。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，具体步骤如下：
(s1)、确定混合物不同组分对受试生物的实验浓度范围；
(s2)、进行二元及二元以上组分混合物浓度的优化设计；
(s3)、测定混合物毒性效应，并使用浓度加和模型评估联合毒性；
(s4)、计算混合物对应浓度范围内联合毒性面积均值。
混合物浓度设计包含多种组分浓度组成，对于每个混合物的联合毒性评估，分别以其中一种浓度组成为示例。
优选的，所述步骤(s1)中确定混合物不同组分对受试生物实验浓度范围的具体步骤如下：
(s1.1)、应用微板毒性分析法(袁静,刘树深,王丽娟,等.蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)微板毒性分析方法优化[j].环境科学研究,2011,24(5):553-558)进行混合物各组分对蛋白核小球藻的初步毒性实验，确定最高效应浓度和最低效应浓度；
(s1.2)、计算稀释因子设置12个浓度梯度，得到不同组分的浓度-效应数据；
(s1.3)、使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘s型函数(weibull或logit函数)拟合，均方根误差最小者为最优拟合函数；
(s1.4)、根据各组分浓度-效应关系最优模型，在商业化软件excel中计算各组分在不同效应点的效应浓度(ec10、ec20、ec30、ec40和ec50)。
优选的，所述步骤(s2)中进行二元及二元以上组分混合物浓度优化设计的具体步骤如下：
(s2.1)、根据步骤(s1)中确定的各组分不同效应浓度，利用直接均分射线法(dou,r.n.,liu,s.s.,mo,l.y.,liu,h.l.,deng,f.c.anoveldirectequipartitionraydesign(equray)procedurefortoxicityinteractionbetweenionicliquidanddichlorvos.environ.sci.pollut.res.int.2010,18,734-742)从二元混合物体系中选择具有代表性的混合物基本浓度组成；
(s2.2)、根据步骤(s1)中的不同效应浓度，通过均匀设计射线法(liu,s.s.,xiao,q.f.,zhang,j.,yu,m.uniformdesignrayintheassessmentofcombinedtoxicitiesofmulti-componentmixtures.sci.bull.2015,61,52-58)，结合均匀设计表，确定三元混合物体系中具有代表性的混合物基本浓度组成；
(s2.3)、将代表性混合物点扩展成多条梯度射线(r1、r2、r3、r4和r5)，每条射线中混合物组分间浓度分数固定不变，从而形成优化设计的二元和三元混合物体系，以其中一条射线为例进行混合毒性实验和联合毒性相互作用定量表征。
优选的，所述步骤(s3)中测定混合物毒性效应，并使用浓度加和模型评估联合毒性的具体步骤如下：
(s3.1)、以步骤(s2)中构建的二元和三元混合物体系为基础，应用微板毒性分析法进行蛋白核小球藻的混合毒性实验，测定混合物体系的浓度-效应数据，并使用商业化软件origin或matlab进行非线性最小二乘s型函数拟合；
(s3.2)、在已知单个组分的不同效应浓度，并确定混合物总浓度及各组分浓度分数后，根据浓度加和模型计算混合物体系的不同效应浓度，从而得到预测毒性的浓度-效应曲线；
(s3.3)、将实验观测毒性与模型预测毒性的浓度-效应曲线进行比较，预测曲线在观测曲线上方时，则属于拮抗作用区，反之则为协同作用区；
(s3.4)、通过直观判断区域面积大小，面积越大则说明组分间毒性相互作用越强(具体见图1)。
式中ci表示混合物产生效应x％时组分i的浓度，ecx,i表示混合物第i个组分单独存在时所产生的效应x％与混合物总效应相同时的浓度。
优选的，所述步骤(s4)中计算混合物对应浓度范围内联合毒性面积均值的具体步骤如下：
(s4.1)、根据步骤(s3)中浓度加和模型的评估结果，确定毒性相互作用区对应的浓度范围；
(s4.2)、使用商业化软件origin对各区域面积进行积分，协同作用区积分结果为正值，拮抗作用区积分结果为负值；
(s4.3)、将积分结果的绝对值分别除以对应的浓度范围即为面积均值(areaofthemean,am)，从而得到毒性相互作用强度，面积均值越大，则说明毒性相互作用越强。
优选的，还包括以下步骤：
(s5.1)、以步骤(s4)中混合物联合毒性相互作用定量表征结果为基础，探究联合毒性的组分浓度比依赖性；
(s5.2)、结合混合物体系不同射线的各组分浓度比和毒性相互作用面积均值，使用商业化软件origin对两者进行线性拟合，并筛选出具有强相关性(r>0.8)的结果。
优选的，所述受试生物为蛋白核小球藻，毒性暴露时间为96h。
优选的，所述相互作用区面积积分绝对值除以对应浓度范围，得到面积均值。
本发明提供一种传统评估模型与面积积分相结合，定量表征多元混合物联合毒性相互作用的面积均值法，该方法可得到多元混合物对应浓度范围内联合毒性相互作用的面积均值，有利于客观评估联合毒性类型和毒性相互作用强度，便于比较混合物多种浓度比例下的毒性相互作用；
本发明方法对评估模型中预测毒性与观测毒性的偏离程度进行定量表征，摒弃了传统的主观判断方法，使得联合毒性评估更加客观准确；
本发明方法将毒性相互作用强度统一用am值表示，便于不同污染物的联合毒性相互作用比较，还为联合毒性的浓度比依赖性研究提供可靠方法。
附图说明
图1是本发明中基于面积均值法定量表征复合污染物联合毒性相互作用示意图；
图2是本发明中二元抗生素混合物毒性相互作用图；
图3是本发明中抗生素与重金属三元混合物毒性相互作用图。
具体实施方式
以下结合附图1-3，进一步说明本发明一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法的具体实施方式。本发明一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法不限于以下实施例的描述。
实施例1：
利用面积均值法定量表征硫酸巴龙霉素(paromomycinsulfate,par)和妥布霉素(tobramycin,tob)二元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用，包括以下步骤：
(1)利用微板毒性分析法(袁静,刘树深,王丽娟,等.蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)微板毒性分析方法优化[j].环境科学研究,2011,24(5):553-558)进行混合物各组分对蛋白核小球藻的初步毒性实验，确定各组分溶液最高浓度和稀释因子，据此得到硫酸巴龙霉素和妥布霉素储备液浓度分别为1.15e-02mol/l、2.20e-02mol/l，稀释因子为0.65，通过微板毒性实验测定各组分对蛋白核小球藻的浓度-效应数据。使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到最优拟合结果。硫酸巴龙霉素和妥布霉素最优拟合函数为logit函数，拟合均方根误差分别为0.030、0.023。在商业化软件excel中计算各组分的ec50效应浓度，分别为8.91e-06mol/l、4.67e-03mol/l。
(2)根据上述硫酸巴龙霉素和妥布霉素的不同效应浓度，利用直接均分射线法(dou,r.n.,liu,s.s.,mo,l.y.,liu,h.l.,deng,f.c.anoveldirectequipartitionraydesign(equray)procedurefortoxicityinteractionbetweenionicliquidanddichlorvos.environ.sci.pollut.res.int.2010,18,734-742)设计五条有代表性的混合物射线(r1、r2、r3、r4和r5)，各条射线的混合物浓度(单位：mol/l)分别为：2.180e-02、2.191e-02、2.195e-02、2.197e-02和2.198e-02，其中每条射线的固定浓度比例分别为：9.466e-03:9.905e-01、3.808e-03:9.962e-01、1.908e-03:9.981e-01、9.548e-04:9.990e-01和3.821e-04:9.996e-01，以其中一条射线r2为例进行混合毒性实验和联合毒性相互作用定量表征。
(3)利用微板毒性分析法(袁静,刘树深,王丽娟,等.蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)微板毒性分析方法优化[j].环境科学研究,2011,24(5):553-558)进行二元混合物联合毒性实验，得到混合物对蛋白核小球藻的浓度-效应数据。使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到最优拟合结果，拟合均方根误差为0.011。在已知硫酸巴龙霉素和妥布霉素的不同效应浓度，并确定二元混合物总浓度及各组分浓度分数后，根据浓度加和模型计算混合物体系的不同效应浓度，从而得到预测毒性的浓度-效应曲线，具体见图2。比较实验观测毒性与模型预测毒性的浓度-效应曲线，发现低浓度区域预测毒性低于观测毒性，组分间相互作用为协同作用，高浓度区域则为拮抗作用。
(4)根据浓度加和模型的评估结果，确定协同作用区对应的浓度范围为1.62e-03，拮抗作用区对应的浓度范围为9.30e-03。使用商业化软件origin对各区域面积进行积分，协同作用区积分结果为1.03e-04，拮抗作用区积分结果为-9.51e-04。将积分结果分别除以对应的浓度范围得到面积均值，即为毒性相互作用强度，协同作用强度为6.38e-02，拮抗作用强度为-1.02e-01。
(5)以二元混合物联合毒性定量表征结果为基础，探究联合毒性的组分浓度比依赖性。结合混合物体系不同射线的各组分浓度比和毒性相互作用面积均值，使用商业化软件origin对两者进行线性拟合，并筛选出具有强相关性的结果。如表1所示，硫酸巴龙霉素组分浓度减少和妥布霉素组分浓度增加会使得组分间协同作用增强，而拮抗作用则无此相关关系。
表1.二元混合物联合毒性相互作用定量表征及线性拟合结果
实施例2
利用面积均值法定量表征硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate,kan)、妥布霉素(tobramycin,tob)和重金属铜三元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用，包括以下步骤：
(1)利用微板毒性分析法(袁静,刘树深,王丽娟,等.蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)微板毒性分析方法优化[j].环境科学研究,2011,24(5):553-558)进行混合物各组分对蛋白核小球藻的初步毒性实验，确定各组分溶液最高浓度和稀释因子。据此得到硫酸卡那霉素、妥布霉素中重金属铜储备液浓度分别为3.48e-02mol/l、2.20e-02mol/l和6.41e-04mol/l，稀释因子为0.65。通过微板毒性实验测定各组分对蛋白核小球藻的浓度-效应数据。使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到最优拟合结果。硫酸卡那霉素、妥布霉素中重金属铜最优拟合函数为logit函数，拟合均方根误差分别为0.027、0.023和0.043。在商业化软件excel中计算各组分的ec50效应浓度，分别为5.75e-03mol/l、4.67e-03mol/l和1.26e-05mol/l。
(2)根据上述硫酸卡那霉素、妥布霉素中重金属铜的不同效应浓度，利用均匀设计射线法(liu,s.s.,xiao,q.f.,zhang,j.,yu,m.uniformdesignrayintheassessmentofcombinedtoxicitiesofmulti-componentmixtures.sci.bull.2015,61,52-58)设计五条有代表性的混合物射线(r1、r2、r3、r4和r5)，各条射线的混合物浓度(单位：mol/l)分别为：2.274e-02、2.738e-02、1.908e-02、2.528e-02和2.837e-02，其中每条射线的固定浓度比例分别为：2.734e-01:7.246e-01:2.030e-03、5.555e-01:4.443e-01:2.311e-04、1.221e-01:8.719e-01:5.920e-03、4.213e-01:5.780e-01:7.480e-04和6.719e-01:3.274e-01:6.752e-04。以其中一条射线r2为例进行混合毒性实验和联合毒性相互作用定量表征。
(3)利用微板毒性分析法(袁静,刘树深,王丽娟,等.蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)微板毒性分析方法优化[j].环境科学研究,2011,24(5):553-558)进行三元混合物联合毒性实验，得到混合物对蛋白核小球藻的浓度-效应数据。使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到最优拟合结果，拟合均方根误差为0.052。在已知硫酸卡那霉素、妥布霉素中重金属铜的不同效应浓度，并确定三元混合物总浓度及各组分浓度分数后，根据浓度加和模型计算混合物体系的不同效应浓度，从而得到预测毒性的浓度-效应曲线，具体见图3。比较实验观测毒性与模型预测毒性的浓度-效应曲线，发现低浓度区域预测毒性高于观测毒性，组分间相互作用为拮抗作用，高浓度区域则为协同作用。
(4)根据浓度加和模型的评估结果，确定拮抗作用区对应的浓度范围为2.60e-03，协同作用区对应的浓度范围为1.09e-02。使用商业化软件origin对各区域面积进行积分，协同作用区积分结果为1.36e-03，拮抗作用区积分结果为-1.57e-04。将积分结果分别除以对应的浓度范围得到面积均值，即为毒性相互作用强度，协同作用强度为1.24e-01，拮抗作用强度为-6.03e-02。
(5)以三元混合物联合毒性相互作用定量表征结果为基础，探究联合毒性的组分浓度比依赖性。结合混合物体系不同射线的各组分浓度比和毒性相互作用面积均值，使用商业化软件origin对两者进行线性拟合，并筛选出具有强相关性的结果。如表2所示，铜组分浓度增加会使得组分间拮抗作用增强，而协同作用则无此相关关系。
表2.三元混合物联合毒性相互作用定量表征及线性拟合结果
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
1.一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：具体步骤如下：
(s1)、确定混合物不同组分对受试生物的实验浓度范围；
(s2)、进行二元及二元以上组分混合物浓度的优化设计；
(s3)、测定混合物毒性效应，并使用浓度加和模型评估联合毒性；
(s4)、计算混合物对应浓度范围内联合毒性面积均值；
(s5)、组分间毒性相互作用特征分析。
2.如权利要求1所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述步骤(s1)中确定混合物不同组分对受试生物实验浓度范围的具体步骤如下：
(s1.1)、应用微板毒性分析法进行混合物各组分对蛋白核小球藻的初步毒性实验，确定最高效应浓度和最低效应浓度；
(s1.2)、计算稀释因子设置12个浓度梯度，得到不同组分的浓度-效应数据；
(s1.3)、使用商业化软件origin或matlab对浓度-效应数据进行非线性最小二乘s型函数拟合，均方根误差最小者为最优拟合函数；
(s1.4)、根据各组分浓度-效应关系最优模型，在商业化软件excel中计算各组分在不同效应点的效应浓度。
3.如权利要求1所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述步骤(s2)中进行二元及二元以上组分混合物浓度优化设计的具体步骤如下：
(s2.1)、根据步骤(s1)中确定的各组分不同效应浓度，利用直接均分射线法从二元混合物体系中选择具有代表性的混合物基本浓度组成；
(s2.2)、根据步骤(s1)中的不同效应浓度，通过均匀设计射线法，结合均匀设计表，确定三元混合物体系中具有代表性的混合物基本浓度组成；
(s2.3)、将代表性混合物点扩展成多条梯度射线，每条射线中混合物组分间浓度分数固定不变，从而形成优化设计的二元和三元混合物体系，以其中一条射线为例进行混合毒性实验和联合毒性相互作用定量表征。
4.如权利要求3所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述步骤(s3)中测定混合物毒性效应，并使用浓度加和模型评估联合毒性的具体步骤如下：
(s3.1)、以步骤(s2)中构建的二元和三元混合物体系为基础，应用微板毒性分析法进行蛋白核小球藻的混合毒性实验，测定混合物体系的浓度-效应数据，并使用商业化软件origin或matlab进行非线性最小二乘s型函数拟合；
(s3.2)、在已知单个组分的不同效应浓度，并确定混合物总浓度及各组分浓度分数后，根据浓度加和模型计算混合物体系的不同效应浓度，从而得到预测毒性的浓度-效应曲线；
(s3.3)、将实验观测毒性与模型预测毒性的浓度-效应曲线进行比较，预测曲线在观测曲线上方时，则属于拮抗作用区，反之则为协同作用区；
(s3.4)、通过直观判断区域面积大小，面积越大则说明组分间毒性相互作用越强。
5.如权利要求1所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述步骤(s4)中计算混合物对应浓度范围内联合毒性面积均值的具体步骤如下：
(s4.1)、根据步骤(s3)中浓度加和模型的评估结果，确定毒性相互作用区对应的浓度范围；
(s4.2)、使用商业化软件origin对各区域面积进行积分，协同作用区积分结果为正值，拮抗作用区积分结果为负值；
(s4.3)、将积分结果的绝对值分别除以对应的浓度范围即为面积均值，从而得到毒性相互作用强度，面积均值越大，则说明毒性相互作用越强。
6.如权利要求1所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述步骤(s5)中组分间毒性相互作用特征分析的具体步骤如下：
(s5.1)、以步骤(s4)中混合物联合毒性相互作用定量表征结果为基础，探究联合毒性的组分浓度比依赖性；
(s5.2)、结合混合物体系不同射线的各组分浓度比和毒性相互作用面积均值，使用商业化软件origin对两者进行线性拟合，并筛选出具有强相关性的结果。
7.如权利要求1-6中任一所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述受试生物为蛋白核小球藻，毒性暴露时间为96h。
8.如权利要求1-6中任一所述的一种用于定量表征复合污染物联合毒性相互作用的面积均值法，其特征在于：所述相互作用区面积积分绝对值除以对应浓度范围，得到面积均值。
技术总结