本发明涉及一种荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的方法及检测试剂盒，属于食品检测技术领域。
背景技术：
敌敌畏(ddvp)，学名o,o-二甲基-o-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，是一种高效的有机磷杀虫剂，广泛应用于农业生产中。然而由于不合理的使用以及滥用，在降雨等作用的影响下导致水体中敌敌畏的残留量增加，并在水生生物体内不断富集，对水环境以及水生生物造成严重的影响。人们食用含有敌敌畏的水产品后，敌敌畏会在体内不断蓄积，从而对人体产生毒害作用。敌敌畏与人体内的胆碱酯酶结合，使胆碱酯酶丧失了水解乙酰胆碱的功能，导致胆碱能神经递质大量积聚，造成严重的神经功能紊乱，特别是呼吸功能障碍，从而影响生命活动，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。重度中毒者还会发生迟发性猝死。因此，需要建立敌敌畏的快速便捷检测方法来监测水产品中的残留量。
国内外检测敌敌畏残留量的方法有很多，如气相色谱法、薄层色谱扫描法、气相色谱-质谱联用分析法、免疫传感器法等。虽然上述方法检测效率高、选择性好、应用范围广，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员、复杂的程序、繁琐的样品处理过程，以及合成的材料不稳定等缺点，极大地限制了其在现场检验中的应用。因此，需要建立一种检测结果准确、仪器操作简单、高效环保的提取检测方法，普通实验室就可达到检测条件的仪器来测定水产品中敌敌畏的残留量。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的方法及检测试剂盒，具体是涉及水产品中敌敌畏残留的快速准确便捷的荧光分析检测方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的方法，其包括如下步骤：
s1、样品预处理：将水产品样品粉碎，准确称取粉碎后样品于离心管中，加入乙腈溶液，涡旋后静置，上清液过滤膜后置于的离心管中；
s2、样品提取：取上述滤液于新的离心管中，加盐酸溶液、氯化钠和壬酸钠，待样品溶液分层后离心，冰浴固化，倒掉下层溶液，留取固相的上层提取液；
s3、样品检测：取融化后的上层提取液，加入氨水和间苯二酚溶液在水浴中进行反应，待颜色稳定后，用多功能酶标仪进行荧光检测；
s4、标曲制作：配置不同浓度的敌敌畏标准品，向离心管直接添加不同浓度的敌敌畏标准溶液，静置后有机溶剂挥发完全；加入乙腈，按步骤s1、s2和s3进行提取和荧光检测；以敌敌畏浓度为横坐标，荧光值为纵坐标绘制标准曲线；
s5、检测结果：将s3中所测样品的荧光值代入标准曲线中即可获得样品中敌敌畏的残留量。
如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，所述粉碎样品质量为1g，所述乙腈的体积为1ml；所述涡旋转速为2500r/min，涡旋时间为2～5min，所述静置时间为3～5min；所述滤膜为0.22μm的有机滤膜。
如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述滤液体积为0.5～0.9ml，所述盐酸溶液的浓度为0.1～0.7mol/l，体积为4.5ml；所述氯化钠用量为75～225mg；壬酸钠用量为100～200mg；所述离心条件为3000～8000r/min，离心时间为3～10min。
如上所述的方法，优选地，所述滤液体积为0.5ml，所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/l；所述氯化钠用量为150mg；壬酸钠用量为150mg；所述离心条件为5000r/min，离心时间为5min。
如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述上层提取液的体积为50μl；所述氨水的质量分数为15～25％，氨水体积为100μl；所述间苯二酚溶液的浓度为45～225mmol/l，用无水乙醇进行配置，间苯二酚溶液的体积为200μl。
如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述水浴的温度为25～35℃，水浴时间为5～15min。
如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述氨水的质量分数为25％，所述间苯二酚溶液的浓度为90mmol/l，用无水乙醇进行配置，水浴温度为25℃，水浴时间为10min。
如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，用多功能酶标仪测定荧光强度时，所用的激发波长为275nm，发射波长为315nm。
一种用于荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的试剂盒，其包括乙腈溶液、氯化钠、盐酸溶液、氨水和间苯二酚溶液。
进一步，优选地，盐酸溶液的浓度为0.1～0.7mol/l，氨水的质量分数为15～25％，间苯二酚溶液的浓度为45～225mmol/l。
本发明在研究中发现采用壬酸钠加入酸性的样品溶液中原位生成壬酸提取剂，与水相充分接触的过程中，以及盐析作用的辅助下完成敌敌畏的高效萃取，也就是说壬酸钠在酸性条件下转化为壬酸，壬酸萃取敌敌畏，壬酸与水溶液分层，有机相即含有敌敌畏地萃取剂位于上层，之后冰浴固化有机相，弃去下层水相；融化后的萃取剂加入碱性的氨水溶液后，壬酸转化成壬酸盐的形式与水相混溶成为均一地一相，便于后续的检测。而且，敌敌畏在碱性条件下水解成二氯乙醛，与后续加入的间苯二酚发生缩合反应产生具有荧光性的物质，实现敌敌畏的荧光定量检测。本发明中首次采用冰浴固化，因多次实验研究发现采用的提取剂的凝固点比样品溶液的凝固点要高，固化能收集到更多的提取剂，而且便于和样品溶液分离。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的一种荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的新的方法及检测试剂盒，使用可转换亲水性溶剂壬酸钠作为萃取剂提取目标分析物。壬酸钠具有绿色、无毒、对环境影响小的优点，符合绿色化学实验的要求；而且壬酸钠具有低密度、低熔点的性质，离心后冰浴时在离心管上端固化，降低收集难度，提高萃取效率，除此之外，本发明的方法中壬酸钠的使用量较少，就可实现高效提取。
本发明提供的荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的方法，其检测过程具有绿色环保、高效、提取效果好、提取效率快的优点，使用仪器操作简单，不需搭建复杂装置，而且检测过程中不需要合成任何物质，限制作用少，反应条件温和、操作简单快捷，灵敏度高，实验结果准确可靠，且重现性好，可以实现现场快速检测。
本发明提供的用于荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的检测试剂盒，试剂来源容易得到，没有毒性，绿色环保。
本发明基于可切换的中链脂肪酸，将高效绿色的微萃取前处理技术，与便捷的高通量荧光分析技术相结合，解决了有机提取剂与水相检测体系不相溶的难题，建立了一种高效提取和检测水产品中敌敌畏残留量的方法。
附图说明
图1为不同反应体系在紫外灯下的图片；
图2为不同反应体系的荧光光谱图；
图3为最终产物最佳激发波长(ex)和发射波长(em)下的荧光光谱图；
图4为提取剂种类对荧光强度的影响；
图5为提取剂用量对荧光强度的影响；
图6为hcl浓度对荧光强度的影响；
图7为nacl用量对荧光强度的影响；
图8为nh3·h2o浓度对荧光强度的影响；
图9为间苯二酚浓度对荧光强度的影响；
图10为加热温度对荧光强度的影响；
图11为加热时间对荧光强度的影响；
图12为敌敌畏的线性曲线。
具体实施方式
本发明中在前处理部分采用了有机溶剂去完成提取，而检测部分属于水相的体系。创新性的通过提取剂在酸碱条件下可以切换相的优点实现了在有机相的时候提取，在水相的时候可以与荧光的水相体系完成反应。解决了目前很多技术面临的前处理部分采用有机相与检测部分采用水相互不相容的问题。
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂可采用市售产品，采用的设备为spectramaxi3x多功能酶标仪(moleculardevices，中国)。
实施例1验证实验的可行性
实验方法：准备8个2ml的离心管，配置四种不同的反应体系a：敌敌畏 nh3·h2o 间苯二酚溶液；b：敌敌畏 nh3·h2o；c：nh3·h2o 间苯二酚溶液；d：敌敌畏 间苯二酚溶液。每种反应体系配置两组平行，均置于相同温度下反应相同时间。实验过程中所用试剂浓度分别为：敌敌畏浓度为0.1mg/kg(甲醇溶，购自南通江山化工农药股份有限公司)、nh3·h2o质量分数为25％、间苯二酚溶液的浓度为450mmol/l，用乙醇作为溶剂配制。每种试剂添加量为：敌敌畏为200μl、nh3·h2o为300μl、间苯二酚溶液为0.5ml，25℃下水浴反应10min后在紫外灯下观察其是否有荧光，实验结果如图1所示。结果表明在紫外灯下只有反应体系a有较强的荧光。说明只有三种反应物质同时存在于同一体系中才能产生肉眼可见的颜色变化，在紫外灯下可明显观察到该物质有很强的荧光，即敌敌畏在碱性条件水解生成二氯乙醛，二氯乙醛与间苯二酚发生缩合反应生成红色物质，并且该物质具有很强的荧光，验证了本发明方法用于测定敌敌畏含量的可行性。
此外，还试验过与间苯二酚的结构类似的化合物，如：1,2,3,5-苯四酚，2,5-二氯苯酚，间甲酚，苯酚，对甲苯酚，亚硝基苯酚；但这些物质不与二氯乙醛发生缩合反应，没有荧光产生。
实施例2确定最终产物的最佳激发波长(ex)和发射波长(em)以及不同反应体系的荧光光谱图
将实施例1中反应完成后的体系a取200μl置于96孔板中，采用多功能酶标仪，将激发波长(ex)在可用范围内调至最低，在此基础上扫发射光谱，光谱上的最高点即发射波长，然后发射波长(em)不变，扫激发光谱，光谱上的最高点就是激发波长，以此类推，当激发光谱图与发射光谱图呈轴对称图形时，即固定某一激发波长扫描得到的发射图谱中最佳发射波长与固定某一发射波长扫描得到的激发图谱中最佳激发波长一致时，即确定了该物质的最佳激发波长(ex)和发射波长(em)。在最佳激发波长下扫描不同反应体系的发射光谱图如图2、图3所示。
结果表明，反应体系a的终产物的最佳激发波长(ex)为275nm，最佳发射波长(em)为315nm。四个反应体系中只有反应体系a在315nm处产生强烈的荧光强度，表明了敌敌畏只有在碱性条件水解生成二氯乙醛，二氯乙醛与间苯二酚发生缩合反应产生具有荧光性的物质，证实了此方法用于检测水产品中敌敌畏含量是可行的。
实施例3反应条件的优化
a.提取剂的种类
(1)实验方法：称取1g粉碎样品(海参、草鱼、或鲍鱼)，加入100μl敌敌畏(0.1mg/kg，甲醇溶)放置20min，然后加入1ml乙腈溶液，2500r/min的条件下涡旋提取3min，将提取液过有机滤膜(0.22μm)。取500μl样品滤液并加4.5ml浓度为0.5mol/l的盐酸水溶液至10ml离心管中。接着加入150mg氯化钠，待氯化钠完全溶解后加入150mg中链脂肪酸的钠盐(戊酸钠、己酸钠、辛酸钠、壬酸钠和癸酸钠)。中链脂肪酸的钠盐在酸性条件下原为生成中链脂肪酸作为提取剂(戊酸、己酸、辛酸、壬酸和癸酸)均匀地分散到样品溶液中实现了待测物地高效萃取。在5000r/min的条件下离心5min，中链脂肪酸与水溶液不相溶，发生了分层，敌敌畏溶于中链脂肪酸层中，有机相位于离心管上层，冰浴固化后，弃去下层水相。取上述提取液50μl置于2ml的离心管中，然后加入100μl质量分数为25％的氨水。最后加入200μl浓度为90mmol/l的间苯二酚(用无水乙醇(ar)进行配置)。25℃下水浴反应10min后吸取200μl置于96孔板中，最佳激发波长(ex)为275nm，最佳发射波长(em)为315nm下测定荧光强度。
(2)实验结果：如图4所示。
(3)结果分析：提取剂在提取过程中起着决定性作用。在相同的萃取条件下，考察了戊酸钠、己酸钠、辛酸钠、壬酸钠和癸酸钠五种提取剂对提取效果的影响。图4的结果表明壬酸钠的荧光强度最高，说明其提取效果最好。癸酸钠凝固点较高，易受室温变化的影响，造成提取剂回收体积不稳定。因此选择壬酸钠作为提取剂。
b.提取剂的用量
(1)实验方法：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于分别加入不同量的壬酸钠，分别是50mg、100mg、150mg、200mg、300mg。其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，氯化钠150mg，氨水的质量分数为25％，间苯二酚浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图5所示。
(3)结果分析：当壬酸钠用量在50～150mg范围时，荧光值随壬酸钠含量的增加逐渐增大，用量在150～300mg范围时，荧光值随壬酸钠含量的增加逐渐降低。壬酸钠含量在150mg时达到最大，这是因为提取剂用量较少时无法完全回收待测物质，随着提取剂用量增加目标分析物萃取完全，荧光强度逐渐增加，进一步增加提取剂用量，荧光强度反而下降。所以，优选100～200mg的壬酸钠进行提取，最优选为150mg的壬酸钠进行提取。
c.hcl浓度
(1)实验条件：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于分别加入不同浓度的盐酸溶液，分别是0.1mol/l、0.5mol/l、1mol/l，其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，氯化钠150mg，壬酸钠150mg，氨水的质量分数为25％，间苯二酚浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图6所示。
(3)结果分析：当盐酸浓度在0.1～0.5mol/l范围内，荧光值随盐酸浓度的降低逐渐升高显著增大，当盐酸浓度在0.5～1mol/l范围内，荧光值随盐酸浓度的升高显著降低。这是由于盐酸浓度过低，壬酸钠不能完全转化为壬酸提取剂，从而导致萃取效率下降；盐酸浓度过高时，给敌敌畏营造充足的碱性环境时会消耗过多氨水，浪费试剂。盐酸浓度过大或过低都会对实验后续操作造成影响，所以需严格控制hcl浓度，优选0.1～0.7mol/l，最优选为0.5mol/l盐酸溶液。
d.nacl用量
(1)反应条件：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于分别加入不同含量的氯化钠，分别为50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、275mg、300mg。其他反应条件为：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，壬酸钠150mg，氨水的质量分数为25％，间苯二酚溶液浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图7所示。
(3)结果分析：当氯化钠用量在50～150mg范围时，荧光值随氯化钠用量的增多逐渐增大，当氯化钠用量在150～300mg范围时，荧光值随氯化钠用量的增加而逐渐递减。当氯化钠用量不足时，无法将溶液中的有机成分(即敌敌畏和壬酸)完全从混合溶液中析出，盐析不充分会降低敌敌畏回收率，对最终产物的荧光造成影响；氯化钠用量过多，会增加溶液的离子黏度，在一定程度上降低敌敌畏的回收率。所以nacl的使用量优选为75～225mg，nacl最优选的使用量为150mg。
e.nh3·h2o浓度
(1)实验方法：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于分别加入不同质量分数的氨水，具体为：25％、20％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、2.5％、1.25％，其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，氯化钠150mg，壬酸钠150mg，间苯二酚溶液浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图8所示。
(3)结果分析：氨水在本实验中的作用有两个：第一个是为敌敌畏水解生成二氯乙醛创造碱性条件，二氯乙醛与间苯二酚发生缩合反应生成红色荧光物质；第二个是与有机相中的壬酸反应生成水溶性物质，便于检测结果。由图像可知荧光值随氨水质量分数的降低而依次下降，这是因为氨水浓度降低时，碱性环境越来越弱，因而敌敌畏水解不完全，从而导致最终反应的荧光性产物的减少，所以氨水溶液优选15～25％，最优选用质量分数为25％的氨水溶液。
f.间苯二酚溶液的浓度
(1)反应条件：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于分别加入不同浓度的间苯二酚溶液，具体为：4.5mmol/l、15mmol/l、45mmol/l、90mmol/l、225mmol/l、450mmol/l，其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，氯化钠150mg，壬酸钠150mg，氨水的质量分数为25％。
(2)实验结果如图9所示。
(3)结果分析：敌敌畏只有在碱性条件下水解生成二氯乙醛，其水解产物二氯乙醛和间苯二酚溶液发生缩合反应生成红色荧光物质。当间苯二酚浓度在15～90mmol/l时，荧光值随间苯二酚浓度的升高而增大，当浓度在90～450mmol/l时，荧光值随间苯二酚浓度的升高而逐渐递减。因此，优选间苯二酚溶液的浓度为45～225mmol/l，最优选为90mmol/l。
g.加热温度
(1)实验方法：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于反应温度，分别按照在25℃、35℃、45℃、55℃下水浴反应20min。其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，氯化钠150mg，壬酸钠150mg，氨水的质量分数为25％，间苯二酚浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图10所示。
(3)结果分析：由验证实验可知，该实验在加热条件下效果更可观，由此可知温度会影响产物的生成速度，当温度过高时反应体系中的物质会被分解，造成损失；温度过低时反应速度慢。因此须严格控制加热温度，优选恒温温度为25～35℃，最优选为25℃下加热，效果最好。
h.加热时间
(1)实验方法：与实施例3中a的实验方法相同，不同之处在于25℃下水浴反应的时间，分别为5min、10min、15min、20min；其他反应条件：敌敌畏浓度0.1mg/kg，盐酸浓度为0.5mol/l，氯化钠150mg，壬酸钠150mg，氨水的质量分数为25％，间苯二酚浓度为90mmol/l。
(2)实验结果：如图11所示。
(3)结果分析：温度会影响产物的合成，结果表明在恒温25℃下加热10min效果最好，当加热时间过长，反应体系中的物质会被分解，造成损失；温度过低，反应速度慢。因此加热时间优选为5～15min，最优选为10min。
实施例4
敌敌畏浓度标准曲线的制作实验方法：100μl不同浓度的敌敌畏加入10ml离心管中，分别为0.04mg/kg、0.08mg/kg、0.12mg/kg、0.16mg/kg、0.20mg/kg、0.24mg/kg、0.28mg/kg，静置20min后有机溶剂挥发完全。然后加入1ml乙腈溶液，2500r/min的条件下涡旋提取3min，提取液过有机滤膜(0.22μm)。取500μl滤液并加4.5ml浓度为0.5mol/l的盐酸水溶液至10ml离心管中。接着加入150mg氯化钠，待氯化钠完全溶解后加入150mg壬酸钠。壬酸钠在酸性条件下，原为生成壬酸提取剂均匀地分散到样品溶液中，实现了待测物地高效萃取。待样品溶液分层后，在5000r/min的条件下离心5min，有机相位于离心管上层，冰浴固化(将提取完成后的离心管方在冰箱的冷冻层进行固化；或者将冰块放置在隔热的容器中，放入离心管进行固化)后弃去下层水相。取上述提取液50μl置于2ml的离心管中，然后加入100μl质量分数为25％的氨水，在碱性条件下疏水性的中链脂肪酸转化为亲水性的脂肪酸盐，并且敌敌畏水解成二氯乙醛后可与间苯二酚发生缩合反应。最后加入200μl浓度为90mmol/l的间苯二酚(用无水乙醇(ar)进行配置)。25℃下水浴反应10min后吸取200μl置于96孔板中，最佳激发波长(ex)为275nm，最佳发射波长(em)为315nm下测定荧光强度。每种基质做10个空白计算其标准偏差，根据定量限(loq)的计算公式：loq＝10σ/k和检出限(lod)的计算公式：lod＝3σ/k(σ为空白样的标准偏差；k工作曲线的斜率)计算出此优化条件下的定量限和检出限。
以敌敌畏浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图12所示。结果表明，敌敌畏浓度在0.04mg/kg～0.28mg/kg范围内呈现良好的线性：y＝12.1339x 8.7186，r2＝0.9904。定量限(loq)为8.1μg/kg，检出限(lod)为2.4μg/kg，表明本发明方法具有较高的灵敏度。
实施例5模拟样品检测
(1)模拟样品处理：将水产品样品粉碎，准确称取1g粉碎后的实际样品(海参、草鱼、鲍鱼)于10ml离心管中，进行实际样本检测以及加标回收实验。当在实际样品检测时，直接进行后续步骤；进行加标回收实验时在样品中各加入100μl不同浓度的敌敌畏(40μg/kg、160μg/kg、280μg/kg)放置20min后进行后续步骤。后续步骤为：向准备好的样品中加入1ml乙腈溶液，2500r/min的条件下涡旋提取3min，提取液过有机滤膜(0.22μm)后置于2ml离心管。取500μl样品滤液并加4.5ml浓度为0.5mol/l的盐酸水溶液至10ml离心管中。接着加入150mg氯化钠，待氯化钠完全溶解后加入150mg壬酸钠。待样品溶液分层后，在5000r/min的条件下离心5min，有机相位于离心管上层，冰浴固化后弃去下层水相。取上述提取液50μl置于2ml的离心管中，然后加入100μl质量分数为25％的氨水，最后加入200μl浓度为90mmol/l的间苯二酚溶液(用无水乙醇(ar)进行配置)。置于25℃下水浴反应10min后吸取200μl置于96孔板中，最佳激发波长(ex)为275nm，最佳发射波长(em)为315nm下测定荧光强度。根据实施例4制备的标准浓度曲线，计算实际样品中的敌敌畏浓度以及加标回收率。按下列公式计算回收率：
cfound：表示在实际水产品样品中加入已知浓度的敌敌畏后，测得的敌敌畏总浓度；creal：表示实际水产品样品中敌敌畏的初始浓度；cadded：表示实际添加敌敌畏的浓度。
(2)实验结果：如表1所示。
表1测定实际水产品样品中敌敌畏的浓度
结果表明实际样品(添加浓度为0)中敌敌畏的含量未见检测出，为了验证本发明方法的可行性进行了添加回收实验(按添加敌敌畏的终浓度为40μg/kg、160μg/kg、280μg/kg进行)，结果表明添加回收率为97.23％～107.25％，相对标准偏差(rsd≤4.06％)。结果表明本发明方法检测结果准确可靠、精密度高，可以广泛用于水产品样品中敌敌畏含量的快速检测。
1.一种荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
s1、样品预处理：将水产品样品粉碎，准确称取粉碎后样品于离心管中，加入乙腈溶液，涡旋后静置，上清液过滤膜后置于的离心管中；
s2、样品提取：取上述滤液于新的离心管中，加盐酸溶液、氯化钠和壬酸钠，待样品溶液分层后离心，冰浴固化，倒掉下层溶液，留取上层提取液；
s3、样品检测：取融化后的上层提取液，加入氨水和间苯二酚溶液在水浴中进行反应，待颜色稳定后，用多功能酶标仪进行荧光检测；
s4、标曲制作：配置不同浓度的敌敌畏标准品，向离心管直接添加不同浓度的敌敌畏标准溶液，静置后有机溶剂挥发完全；加入乙腈，按步骤s1、s2和s3进行提取和荧光检测；以敌敌畏浓度为横坐标，荧光值为纵坐标绘制标准曲线；
s5、检测结果：将步骤s3中所测样品的荧光值代入标准曲线中即可获得样品中敌敌畏的残留量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述粉碎样品质量为1g，所述乙腈的体积为1ml；所述涡旋转速为2500r/min，涡旋时间为2～5min，所述静置时间为3～5min；所述滤膜为0.22μm的有机滤膜。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述滤液体积为0.5～0.9ml，所述盐酸溶液的浓度为0.1～0.7mol/l，体积为4.5ml；所述氯化钠用量为75～225mg；壬酸钠用量为100～200mg；所述离心条件为3000～8000r/min，离心时间为3～10min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滤液体积为0.5ml，所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/l；所述氯化钠用量为150mg；壬酸钠用量为150mg；所述离心条件为5000r/min，离心时间为5min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述上层提取液的体积为50μl；所述氨水的质量分数为15～25％，氨水体积为100μl；所述间苯二酚溶液的浓度为45～225mmol/l，用无水乙醇进行配置，间苯二酚溶液的体积为200μl。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述水浴的温度为25～35℃，水浴时间为5～15min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨水的质量分数为25％，所述间苯二酚溶液的浓度为90mmol/l，水浴的温度为25℃，水浴的时间为10min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s3中，用多功能酶标仪测定荧光强度时，所用的激发波长为275nm，发射波长为315nm。
9.一种用于荧光分析法检测水产品中敌敌畏残留量的试剂盒，其包括乙腈溶液、氯化钠、盐酸溶液、氨水和间苯二酚溶液。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，盐酸溶液的浓度为0.1～0.7mol/l，氨水的质量分数为15～25％，间苯二酚溶液的浓度为45～225mmol/l。
技术总结