本发明涉及一种经遗传修饰以用于分泌细胞因子的浆细胞样树突状细胞(pdc)细胞系、及其在免疫疗法中用于增加抗原特异性细胞的扩增的用途。
背景技术：
寻求促进抗原特异性细胞产生的免疫疗法方法是已知的。发明人已经开发了使用浆细胞样树突状细胞(pdc)细胞系(称为“pdc*细胞系(pdc*line)”)来从供体单核细胞(mnc)、特别是外周血单核细胞(pbmc)诱导抗原特异性细胞毒性细胞的方法(wo2009/138489)。这种方法包括在经辐照和负载抗原的“pdc*细胞系”的存在下培养mnc，所述单核细胞与“pdc*细胞系”共享至少一种hla分子(例如，hla-a2)。
申请人所进行的工作已经显示出这种治疗方法的吸引力及其在诸如黑色素瘤或肺癌等癌症的免疫疗法治疗中的相当大的潜力(aspord等人,2012，未公开的数据)。
诱导抗原特异性细胞扩增的能力是实施这些新治疗方法的决定因素。特别是从申请wo2009/138489中已知，细胞因子的存在对于这种扩增是必需的。所描述的实验方案包括，第一周，在没有细胞因子的情况下共培养经辐照和负载抗原的pdc*细胞系与mnc；然后，第二周，用经辐照的负载抗原的pdc*细胞系和il-2进行新刺激。
细胞因子在各种免疫反应的产生机制中的重要性是本领域技术人员熟知的，特别是对于il-2和il15(waldmann,natrev2006)。il-2主要由激活的t细胞产生，而il-15及其相关受体il-15ra(dubois等人,2002)由单核细胞或髓样树突状细胞(mdc)产生(jakobisiak等人,2011)。为了在诱导抗肿瘤反应(nk、抗体或抗原特异性t)中增强细胞功能的目的，已经描述了对体外产生的mdc的瞬时或永久修饰以产生il15(vandenbergh等人,2015，steel等人(2010)或zhang等人(2014))。
即使mdc和pdc两者都是抗原呈递细胞，它们也是能够诱导不同类型的免疫反应的两种不同的细胞类型，这取决于病原体或抗原的起源和一般的环境背景，由许多特征进行区分：起源、组织定位、toll样受体表达、细胞因子产生等。这些关于经修饰以表达il15的mdc的论文都没有提到使用pdc的可能性，甚至没有考虑il15或甚至il2对pdc的至少等同的作用。
虽然在wo2009/138489中描述的常规激活和扩增方法已经实现了特别高水平的扩增(aspord等人,2010)，但在抗原特异性细胞扩增水平上改善这种新的治疗方法仍然是有利的。
技术实现要素：
因此，本发明涉及一种新的经遗传修饰以表达选自白介素15(il15)和白介素2(il2)的细胞因子的pdc细胞系。
特别地，根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞负载有呈肽形式的一种或多种抗原。
本发明还涉及所述新的经遗传修饰的pdc细胞系用于扩增抗原特异性细胞、特别是单核细胞(mnc)、更特别是外周血单核细胞(pbmc)的用途。
本发明还涉及一种组合产品或试剂盒，其一方面包含根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞系，并且另一方面包含单核细胞(mnc)，特别是用于在通过免疫疗法治疗疾病中同时使用。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其包含根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞系和用于其施用的合适的媒介物。
附图说明
图1描绘了cd34分子在未经转导的pdc*细胞系(左)或用编码il-2或il-15的逆转录病毒上清液转导的pdc*细胞系上的表达的测量。
图2描绘了用il2或il15逆转录病毒上清液转导的pdc*细胞系的il2或il15表达。在信使rna的水平上(a，针对g6pdh归一化)或在经转导的细胞的上清液中(b，以pg/ml计)检测细胞因子。
图3描绘了在将pdc细胞系(未经修饰或经il2或il15遗传修饰，负载有黑色素a抗原)与来自3个健康供体的单核细胞共培养14天后抗黑色素acd8 t细胞的扩增。使用hla-a2/黑色素a多聚体通过流式细胞术检测抗黑色素acd8 t细胞。在a中，显示了代表性实验；在b中，描绘了3个实验的结果(％cd8 多聚体细胞)。
图4描绘了来自14天共培养的cd8 细胞的功能。细胞毒性细胞的功能是通过在用负载有所使用的黑色素a衍生肽的靶细胞系(t2)刺激后检测胞浆内ifnγ来具体化的。在a中，对用不同细胞系获得的所有特异性和非特异性cd8 细胞进行细胞因子胞浆内检测的图示。在b中，用每种细胞系产生的非特异性(多聚体-)和特异性(多聚体 )细胞中ifnγ阳性cd8 细胞的百分比。
具体实施方式
因此，本发明涉及新的经遗传修饰以表达选自il15和il2的细胞因子的pdc细胞系。
根据本发明的可用于进行遗传修饰的pdc细胞系(也称为初始pdc细胞系)是技术人员熟知的，特别是在ep1572989和wo2009/138489中所描述的。特别地，这些是从pdc白血病细胞获得的细胞。可以特别提及以编号2938和3110保藏在cncm(国家微生物培养物保藏中心(collectionnationaledeculturesdemicroorganismes)，巴斯德研究所(institutpasteur)，25ruedudocteurroux，75015巴黎)的gen2.2和gen3细胞系以及衍生自pdc白血病细胞的所有细胞系。
“衍生自pdc白血病细胞的细胞系”意指在将pdc白血病细胞注射到免疫缺陷小鼠中之后衍生自肿瘤结节的细胞系，将这些结节撕开以获得在促进所述细胞系生长的合成培养基中培养的细胞悬浮液。
根据本发明，“选自il15和il2的细胞因子的表达”意指经遗传修饰的细胞系分泌细胞因子。
所述细胞因子的序列是技术人员熟知的。对于il2，可以特别提及在uniprotkb条目p60568下标识的蛋白质序列和在ensembl条目ensg00000109471下标识的编码序列，并且对于il-15，可以特别提及在uniprotkb条目p40933下标识的蛋白质序列和在ensembl条目ensg00000164136下标识的编码序列。具有与上述序列相同活性的这些细胞因子的变体或片段也是本发明的一部分。优选地，所述细胞因子是上文标识的人细胞因子。
根据本发明，“经遗传修饰的pdc细胞系”意指用允许将基因整合到细胞系的基因组中的病毒颗粒转导的任何细胞系，所述病毒可以是腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。优选地，使用莫洛尼鼠白血病病毒(mo-mlv)类型的逆转录病毒。由hek293t胶囊化细胞系产生的这些逆转录病毒颗粒天然地或在转染后表达逆转录病毒gag/pol和env序列。
本领域技术人员将知道如何制备包含一种或多种目的基因的编码序列和调控元件、特别是用于允许在经遗传修饰的哺乳动物细胞中表达细胞因子的序列的病毒颗粒。可以特别提及允许病毒进入细胞的病毒包膜序列，如4070a、mk-g、ha、lcmv、rd114、hiv、vsv、mlv、galv、baev)；允许启动目的基因的转录的启动子序列，如长末端重复(ltr)序列(无论修饰与否)、pgk、ef-1、cmv、sffv、rsv或sv40；增强转导效率的序列，如cppt；促进或启动翻译的序列，如内部核糖体进入位点(ires)序列(pelletier,nature1988)或kozak序列(kozak,nuclacidres1991)；促进蛋白质表达的序列，如wpre序列(donello等人,j.virol1998)。优选地，将使用ltr、ires、kozak和wpre序列。
用病毒颗粒转导pdc细胞以获得新的经遗传修饰以表达选自il15和il2的细胞因子的pdc细胞系的方法也是技术人员已知的。可以特别提及使用聚阳离子试剂，如聚凝胺或dogs(二十八烷基酰胺基甘氨酸精胺)；或促进病毒与目的细胞之间的接触的试剂，如纤连蛋白片段(retronectin)。优选地，使用使用retronectin的方法。
优选地，仅表达所述细胞因子。在某些情况下，特别是对于il15，所述pdc细胞系还表达细胞因子受体，特别是il15ra受体。il15ra受体、特别是其蛋白质序列是技术人员熟知的。
在根据本发明的经修饰的pdc细胞系不表达所述受体的情况下，也可以根据本领域的常用方法将所述pdc细胞系修饰为表达所述受体。
根据本发明的经修饰的pdc特别可用于抗原特异性细胞、特别是单核细胞(mnc)、更特别是外周血单核细胞(pbmc)的扩增。
尽管它们可以直接使用，但根据本发明的经修饰的pdc细胞优选地与抗原、特别是肽抗原相关联。
在本发明的上下文中，术语“抗原”定义了由免疫系统的细胞识别并能够触发细胞介导的免疫反应的分子或分子的一部分。根据本发明的抗原可以是天然的或经修饰的肿瘤或微生物(特别是细菌或病毒)抗原，如肽、蛋白质、糖肽、糖蛋白、磷酸化蛋白。
技术人员将根据要治疗的疾病选择要与经修饰的pdc细胞系相关联的一种或多种抗原。
在本发明的优选实施方式中，所述抗原是可从肿瘤或病毒起源的抗原蛋白获得的肽。这些肽是技术人员熟知的，特别是在许多专利申请或专利中所描述的，特别是ep1485719、ep2113253、us7,087,712、us7,528,224、wo94/020127、wo95/02553、wo98/22589、wo2000/003693、wo2000/020445、wo2000/052163、wo2000/078806、wo2004/067023、wo2007/036638、wo2007/039192、wo2008/045286、wo2011/012720、wo2015/0965572和wo2016/179573。
可以使用的许多肿瘤抗原也在在线(例如像在地址http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/或https://docs.google.com/spreadsheets/u/1/d/1bfn5_mu7oguh35nsluozj9eb2rbltj7xjmyt7boynxg/pubhtml？widget＝true&headers＝false#gid＝1609210712)可获得的数据库中或在出版物如djureinovic等人(jciinsight.2016；1(10):e86837)中有描述。
类似地，可以使用的许多病毒抗原也在在线(例如像在地址https://www.iedb.org/或http://crdd.osdd.net/raghava/antigendb/)可获得的数据库中有描述。
根据本发明的具体实施方案，可从肿瘤抗原获得的肽可以单独地或组合地选自以下抗原的序列中所包括的肽，无论修饰与否：cea、ny-br1、her-2/neu、psa、rage-1、prame、trp-2、mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a9、mage-a10、mage-c1、mage-c2、多聚mage、muc-1、p53、htert、存活蛋白、黑色素a/mart-1、gp100、酪氨酸酶、camel或ny-eso1。类似地，选自突变蛋白或由核酸序列的新阅读框(新抗原)产生的信使rna转录得到的蛋白质的任何抗原。
根据本发明的另一个实施方案，可从病毒抗原获得的肽可以单独地或组合地选自以下抗原的序列中所包括的肽，无论修饰与否：hiv病毒的env、nef、gp41、gp120、gag或pol；hbv病毒的hbc或hbs；hcv病毒的核心、ns3或ns5；流感病毒的flum1；cmv病毒的cmvpp65；ebv病毒的bmlf1、lmp2、ebna-2或ebna-3a；bkv病毒的lta或vop1；汉坦病毒(hatanvirus)的核蛋白；登革热病毒的ns3；hpv病毒的e6和e7；西尼罗河病毒的蛋白e、ns3或bs4b。
可以优先提及黑色素a、gp100、酪氨酸酶、mage-a3、mage-a4、mage-a10、多聚mage、ctag2、ctag1、存活蛋白、her-2/neu、htert和muc1。
根据本发明的第一优选实施方案，所述经遗传修饰的pdc细胞负载有一种或多种抗原。也将它们说成用一种或多种抗原脉冲(即，与其一起孵育)。
因此，本发明涉及如上文和在实施例中所定义的负载有上文列出的一种抗原的经遗传修饰的pdc细胞系。
根据本发明的另一个实施方案，所述细胞也经遗传修饰以表达所述抗原。遗传修饰工具与用于修饰pdc细胞以表达细胞因子的工具相同。在抗原的情况下，技术人员还将选择允许抗原在细胞水平上表达的遗传元件，使得它们在体外或在体内转化为表位并由hla分子呈现。此类元件也是技术人员熟知的(hu,immunologicalreview2011)。
对于治疗用途，如上文和下文所定义的，根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞系是经辐照的细胞系。
用于抑制根据本发明的经转化的pdc细胞系的生长和增殖能力的辐照方法和条件是技术人员熟知的，特别是在wo2009/138489中所描述的。
本发明还涉及所述新的经遗传修饰的pdc细胞系用于扩增抗原特异性细胞、特别是单核细胞(mnc)、更特别是外周血单核细胞(pbmc)的用途。
本发明还涉及用于在疗法中使用、特别是用于通过免疫疗法治疗疾病的所述新的经遗传修饰的pdc细胞系。
本发明还涉及组合产品或试剂盒，其一方面包含根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞系，并且另一方面包含单核细胞(mnc)，特别是用于在通过免疫疗法治疗疾病中同时使用。
所治疗的疾病将本质上取决于与根据本发明的细胞系相关联的抗原，例如用于治疗癌症的肿瘤抗原和用于治疗病毒感染的病毒抗原。
本发明还涉及疫苗组合物，其包含根据本发明的经遗传修饰的pdc细胞系和用于其施用的合适的媒介物。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症和/或感染性疾病的方法，其中将根据本发明的经辐照和脉冲的经遗传修饰的pdc细胞系注射到需要所述治疗的患者体内，所述患者的抗原特异性细胞和所述pdc共享至少一个主要组织相容性复合物(mhc)等位基因。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症和/或感染性疾病的方法，其中将通过将根据本发明的pdc细胞系与至少一种抗原一起孵育而获得的特定效应物注射到需要所述治疗的患者体内，然后使所述经脉冲的pdc(可能也经照射)与所述患者的抗原特异性细胞接触并培养，所述pdc和所述抗原特异性细胞共享至少一个主要组织相容性复合物(mhc)等位基因。
根据本发明，“特定效应物”意指能够识别特定抗原或衍生自这种抗原的产物的免疫细胞，特别是细胞毒性效应物，更特别是对所使用的抗原具有特异性的t细胞，特别是cd8 。
这些方法特别是在wo2009/138489中有描述。
实施例
实施例1：经遗传修饰以表达il-2或il15的pdc*line细胞系的产生。
编码il2(seqidno1)和il15(seqidno2)的目的基因序列由thermofischer(https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis.html)合成并提供在质粒中，所述质粒允许质粒在转化dh5α细菌(neb)后进行扩增。然后使用gibson组装技术(neb)将目的序列(il2或il15)在sal-i与mul-i限制位点之间亚克隆到质粒sfgδcd34(quintarelli,blood2007，由m.pule博士慷慨地提供)中。经截短的cd34序列(没有胞浆内结构域)在sfgδcd34质粒中的存在允许选择表达目的基因的细胞。然后通过在genejuice(vwr)的存在下用sfgδcd34-il2或sfgδcd34-il15质粒以及momlvgag-polpeq-pam3(-e)和rd114env表达质粒(由m.pule博士和m.collins博士慷慨地提供(cosset,jvirol1995))三重转染hek-293t细胞系来获得逆转录病毒悬浮液。
随后在retronectin(takara)的存在下用对应于il2或il15的逆转录病毒上清液转导pdc细胞系的细胞，并且测量cd34表达，从而反映转导效率。这种细胞系衍生自pdc白血病患者的细胞(chaperot,blood2001)，所述患者是衍生出gen2.2和gen3细胞系的患者。
如图1所示，转导了超过90％的pdc*细胞系。
这种cd34表达与il2或il15基因的表达相关。实际上，rt-qpcr分析(taqman技术，roche)显示出高的相对表达，对于il2或il15，与g6pdh基因相比，分别是20或30多倍(图2a)。此外，使用cba(bd)或elisa(r&d)技术，发现两种细胞因子在相应的经遗传修饰的细胞系的上清液中以可溶形式产生，对于il2和il15，浓度分别为20000pg/ml和2500pg/ml(图2b)。
实施例2：在将mnc与负载有肿瘤肽的经转导的细胞系共培养后cd8 淋巴细胞的扩增。
然后使用与hla-a2 健康供体单核细胞(mnc)进行共培养来评估经修饰的细胞系的能力。简而言之，为来自经遗传修饰的和未经修饰的pdc细胞系的细胞负载上黑色素a26l-35肽，辐照，然后在24孔板中与mnc一起培养14天。添加不同量的pdc细胞系细胞，至每孔200万个mnc(10/1或20/1)。在d7，在可溶性il-2的存在下，用负载黑色素a的pdc细胞系重新刺激细胞。在d14，使用荧光标记的黑色素a/a2dextramer(多聚体)以及抗cd3和cd8抗体(beckmancoulter)测量抗黑色素acd8 淋巴细胞的扩增。
图3中呈现的结果表明，pdc细胞系的il2或il15表达允许比未经修饰的细胞系更强的扩增。这种增加平均大于或等于3.7倍。
实施例3：用通过il2或il15修饰或未修饰的pdc细胞系产生的效应物的功能：胞浆内ifnγ表达。
将在负载黑色素a的pdc细胞系(通过il-2或il15转导或未转导)的存在下共培养14天后扩增的t细胞用黑色素a/a2dextramer(多聚体)标记，并且在脱颗粒抑制剂golgistop(becktondickinson)的存在下用负载黑色素a的t2靶细胞系重新刺激4h。然后用抗ifnγ抗体(bectondickinson)以及抗cd3和cd8抗体标记细胞。图4a描绘了根据经多聚体标记的细胞获得的表示ifnγ阳性细胞的信息的表型分型。图4b显示，当用t2/黑色素a谱系刺激时，只有黑色素a特异性细胞(多聚体 )产生ifnγ。结果表明，与用未经修饰的细胞系扩增的黑色素a特异性淋巴细胞相比，在经修饰以表达il2或il15的pdc细胞系的存在下扩增的黑色素a特异性淋巴细胞所分泌的ifnγ是1.8至2.1倍。
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序列表
<110>pdc细胞系制药
法国血液机构
<120>用于分泌细胞因子的经修饰的pdc细胞系
<130>p100031pc01
<150>fr1859773
<151>2018-10-23
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<170>bissap1.3.6
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<213>智人(homosapiens)
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