本发明属于mrna检测技术领域，具体涉及一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒及检测方法和应用。
背景技术：
mrna药物是近年来极具前景的分子治疗药物，在传染病预防、代谢性疾病、癌症和包括罕见病在内的多种疾病治疗领域均有巨大的应用潜力。mrna药物的原理是基于mrna指导蛋白合成的特性，经过必要化学修饰的mrna，经由不同的递送系统进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。由于mrna药物具有不进入细胞核、不改变基因组、有瞬时活性、能通过生理代谢降解等优点，且生产成本低、开发的周期短、安全性高使得mrna药物具有很大优势。但是至目前为止，尚未有mrna药物得以经过美国fda批准上市，多数mrna药物仍处于临床研究阶段，mrna药物的研发过程中，仍然需要建立系统的、完善的、稳定的检测分析和验证等技术方案，所使用的技术要求能特异性识别及检测不同来源的生物样本中mrna药物的序列，截止目前尚未有商业化的试剂盒得以实现。传统的mrna定量检测方法northernblot、原位杂交等技术，由于操作复杂、具有放射性污染的可能、耗时长、灵敏度较低等缺点，并不适用于mrna药物的定量检测。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒及检测方法和应用，可实现生物样本中mrna药物的快速、准确的定量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括：线性mrna标准品，样本rna提取试剂，线性mrna标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量pcr试剂。
优选的，所述反转录试剂的体系以10μl计，包括1μl10×rtmix，1μlsuperpuredntps，1μloligo-(dt)15，0.5μlquantreversetranscriptase，1μl待测样本总rna/线性mrna标准品和余量的nuclease-freewater；
所述实时荧光定量pcr试剂的体系以10μl计，包括：5μl2×sybrgreenmix，2μlrtasemix，0.2μl上游引物，0.2μl下游引物，1μl反转录产物和余量的nuclease-freewater。
本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mrna含量的工具中的应用。
优选的，利用所述工具检测机体中mrna含量的方法包括实时荧光定量pcr。
本发明还提供了一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr方法，包括以下步骤：利用nuclease-freewater稀释线性mrna标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mrna标准品cdna；
分别以所述系列mrna标准品cdna和机体样本提取的rna为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量pcr试剂进行实时荧光定量pcr，利用所述系列mrna标准品cdna的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mrna含量；
所述标准曲线以cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。
优选的，步骤(1)所述梯度浓度包括在0.01pg/μl～10000pg/μl的范围内设置梯度。
优选的，步骤(1)所述线性mrna标准品的核苷酸序列包括seqidno.1所示的序列；
所述线性mrna标准品的特异性引物包括mrna-f1和mrna-r1，所述mrna-f1的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述mrna-r1的核苷酸序列如seqidno.3所示。
优选的，步骤(3)所述实时荧光定量pcr的程序包括：预变性：95℃10min；
变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；
溶解曲线：95℃，15sec；70℃，30sec；95℃，保持。
优选的，步骤(4)所述机体样本包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。
本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：
(a)mrna类药物临床前药物生物分布研究的工具；
(b)临床研究生物样品检测的工具；
(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。
有益效果：本发明提供了一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒建立在rt-pcr基础上，以mrna作为标准品构建标准曲线，与常规质粒为标准品方法相比，稀释的系列标准品溶液通过与待测样本同样的反转录、qpcr过程，更好的模拟样本检测过程，直观展示mrna药物含量，减少质粒的构建工作，实现了生物样本中mrna药物的快速、准确的定量检测。
本发明还提供了定量检测机体中mrna含量的方法，2小时内快速检测生物样本mrna药物含量，具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽，特异性强等优点，可用于mrna类药物临床前药物生物分布研究、临床研究生物样品检测和临床上治疗患者上的药物分布监测。
附图说明
图1为定量pcr检测猴体内mrna药物浓度-cp值拟合标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒包括：线性mrna标准品，样本rna提取试剂，线性mrna标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量pcr试剂。
本发明所述线性mrna标准品的序列优选与mrna药物或mrna疫苗中的mrna序列相同。本发明对所述线性mrna标准品的合成方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法合成所述线性mrna即可；并基于所述线性mrna的序列设计特异性引物，用以rt-pcr。在本发明实施例中，优选以seqidno.1所示的线性mrna标准品为例，检测猴体内mrna的含量。
本发明所述样本rna提取试剂优选包括trizoluniversalrnareagent。本发明所述反转录试剂的体系以10μl计，优选包括1μl10×rtmix，1μlsuperpuredntps(2.5mmeach)，1μloligo-(dt)15，0.5μlquantreversetranscriptase，1μl待测样本总rna/线性mrna标准品和余量的nuclease-freewater；所述实时荧光定量pcr试剂的体系以10μl计，优选包括：5μl2×sybrgreenmix，2μlrtasemix，0.2μl上游引物，0.2μl下游引物，1μl反转录产物和余量的nuclease-freewater。
在本发明中，线性mrna标准品的特异性引物在配制实时荧光定量pcr试剂的体系时，其上游引物和下游引物分别使用nuclease-freewater溶解至浓度为5nm储备液，再按10倍稀释后使用。
本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mrna含量的工具中的应用。本发明利用所述工具检测机体中mrna含量的方法优选包括实时荧光定量pcr，且所述实时荧光定量pcr的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr方法，包括以下步骤：利用nuclease-freewater稀释线性mrna标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mrna标准品cdna；
分别以所述系列mrna标准品cdna和机体样本提取的rna为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量pcr试剂进行实时荧光定量pcr，利用所述系列mrna标准品cdna的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mrna含量；
所述标准曲线以cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。
本发明利用nuclease-freewater稀释线性mrna标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液。本发明所述梯度浓度优选包括在0.01pg/μl～10000pg/μl的浓度范围内设置梯度，如在本发明实施例中，其设置梯度分别为0.01pg/μl、0.1pg/μl、1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1000pg/μl和10000pg/μl。本发明以核苷酸序列为seqidno.1的线性mrna为标准品为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的保护范围。本发明还针对所述线性mrna标准品设计特异性引物，包括mrna-f1和mrna-r1，所述mrna-f1的核苷酸序列优选如seqidno.2所示(gcaacagtgtgcggacctaa)，所述mrna-r1的核苷酸序列优选如seqidno.3所示(cgtccgtcgtgtcagctatg)。
得系列线性工作液后，本发明以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mrna标准品cdna。本发明利用上述反转录体系进行反转录时，所述反转录体系优选为10μl，包括：1μl10×rtmix，1μlsuperpuredntps(2.5mmeach)，1μloligo-(dt)15，0.5μlquantreversetranscriptase；检测未知样本时加入1μl待测样本总rna，用nuclease-freewater补足至10μl，标曲构建时则加入1μlmrna标准品，1μl空白食蟹猴全血rna基质，用nuclease-freewater补足至10μl。本发明所述反转录优选为在37℃反应60min。本发明优选以oligo-dt为反转录引物对稀释好的系列线性工作液、待测样品总rna反转录，得到的cdna使用lightcycler480型实时荧光定量pcr仪进行qpcr检测。
得系列mrna标准品cdna后，本发明以所述系列mrna标准品cdna为模板，利用上述试剂盒中的实时荧光定量pcr试剂进行实时荧光定量pcr，以cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。本发明所述实时荧光定量pcr的反应体系优选为10μl体系，包括5μl2×sybrgreenmix，2μlrtasemix，0.2μl上游引物，0.2μl下游引物，1μl反转录产物，用nuclease-freewater补足至10μl。本发明所述实时荧光定量pcr的程序优选包括：预变性：95℃10min；
变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；
溶解曲线：95℃15sec，70℃30sec，95℃保持。
在本发明中，优选用移液器移取适量mrna标准品用nuclease-freewater配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μl的线性工作液，以cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(r2)不小于0.99，pcr整体扩增效率在90％～110％之间，pcr整体扩增效率＝10-1/k-1，k为斜率。
得标准曲线后，本发明以机体样本提取的rna为模板，依次进行步骤(2)所述反转录和步骤(3)所述实时荧光定量pcr，利用所述标准曲线定量检测机体中mrna含量。
本发明所述反转录的体系和程序以及实时荧光定量pcr的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述机体样本优选包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。
本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：
(a)mrna类药物临床前药物生物分布研究的工具；
(b)临床研究生物样品检测的工具；
(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。
本发明所述试剂盒在所述应用中的方法优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒及检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)本发明所需要试剂包括mrna标准品(seqidno.1)、qpcr上下游引物(seqidno.2～seqidno.3)、trizoluniversalrnareagent、quantscriptrtkitquantcdna第一链合成试剂盒、氯仿、异丙醇、nuclease-freewater。
2)本发明的检测仪器为lightcycler480型实时荧光定量pcr仪，型号为lightcycler480；基因扩增仪，型号为life-eco。
3)主要试剂配制：引物(5nm)使用nuclease-freewater溶解引物粉末至浓度为5nm储备液，再按10倍稀释后使用。
4)线性工作液及质控工作液配制：分别用移液器移取适量mrna标准品用nuclease-freewater配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μl的线性工作液；用移液器移取适量mrna标准品用nuclease-freewater配制qch、qcm、qcl、lloq浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μl的质控工作液。
5)建立反转录体系：反应体系为10μl，包括1μl10×rtmix，1μlsuperpuredntps(2.5mmeach)，1μloligo-(dt)15，0.5μlquantreversetranscriptase；检测未知样本时加入1μl待测样本总rna，用nuclease-freewater补足至10μl，标曲构建时则加入1μlmrna标准品，1μl空白食蟹猴全血rna基质，用nuclease-freewater补足至10μl。
6)建立qpcr反应体系：反应体系为10μl，包括5μl2×sybrgreenmix，2μlrtasemix，0.2μl上游引物，0.2μl下游引物，1μl反转录产物，用nuclease-freewater补足至10μl。
7)方法学验证：标准曲线：用移液器移取适量mrna标准品用nuclease-freewater配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μl的线性工作液，以cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(r2)不小于0.99，pcr整体扩增效率在90％～110％之间，pcr整体扩增效率＝10-1/k-1，k为斜率。
精密度与准确度：用移液器移取适量mrna标准品用nuclease-freewater配制qch、qcm、qcl、lloq浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μl的质控工作液，在6个分析批中运行质控样本，每批4个浓度水平(qch，qcm，qcl和lloq)，每浓度水平各5个质控样本。6个分析批由至少2人于多日内完成。要求低、中、高浓度质控样本批内及批间的变异系数(cv％)小于10％，定量下限样本cv％小于15％，计算各样本准确度(实测值的平均值/理论值×100％)，准确度在50～200％合格。
耐用性：提取空白食蟹猴肝脏总rna，稀释为50ng/μl作为空白肝脏rna基质。另使用nuclease-freewater作为0μg/μl基质。分别将阳性对照样本(qch、qcl)、阴性对照样本(nuclease-freewater)与不同基质混合进行反转录，然后进行荧光定量pcr检测，样本准确度在50～200％内，阴性对照cp值大于lloq或无cp值，视为基质浓度对检测方法无影响。
特异性：①：空白食蟹猴全血rna与75pg/μl的标准品；②：空白食蟹猴全血rna中加入与标准品等体积nuclease-freewater。对①②进行反转录，然后进行qpcr检测。考察该方法对质粒标准品的特异性。要求反应①的cp值小于定量检测下限(lloq)的cp值，反应②的cp值大于标准曲线的lloq的cp值或无cp值。
稳定性：提取空白食蟹猴全血、肝脏rna并稀释为50ng/μl，将空白食蟹猴全血、肝脏rna与低、高浓度mrna标准品(qch、qcl)混合进行反转录，得到的cdna作为稳定性样本1、2、3、4，每个样本3个平行，保存于-60℃以下，并按每次使用量进行分装，样本回收率在50～200％视为稳定。
由表1及图1可知，标准曲线pcr整体扩增效率在99.81～106.28％之间，各检测批次的标准曲线相关系数(r2)均不小于0.9961，符合接受标准。
表1标准曲线验证结果
注：na表示无结果
精密度与准确度结果见表2，在6个分析批中运行质控样本qch、qcm、qcl、lloq，对于批内变异系数(cv％)，6个批次样本cv％均不大于3.72％，各质控样品批内精密度符合接受标准。对于批间变异系数(cv％)，4个浓度cv％均不大于9.49％，各质控样品批间精密度符合接收标准。
对于准确度，6个批次样本准确度在69.59％～183.79％之间，各质控样品符合接受标准。
表2精密度与准确度验证结果
耐用性结果见表3，以nuclease-freewater(0μg/μl)作为基质的耐用性样本qch-1、qcl-1、ntc-1，阴性对照ntc-1无cp值，提示nuclease-freewater对检测方法无影响，qch-1、qcl-1准确度在89.83％～123.06％之间，符合接受标准。以空白食蟹猴肝脏rna作为基质耐用性样本qch-2、qcl-2、ntc-2，阴性对照ntc-2无cp值，提示空白食蟹猴肝脏rna对检测方法无影响，qch-2、qcl-2准确度在112.43％～130.60％之间，符合接受标准。
表3耐用性验证结果
注：na表示无结果。
特异性结果见表4，样本1、2分别为空白食蟹猴全血rna与75pg/μl的标准品混合、空白食蟹猴全血rna与nuclease-freewater混合，结果显示样本1反应cp值小于特异性标准曲线定量检测下限std1cp值，样本2反应cp值高于std1cp值，提示本试验方法对质粒标准品具有特异性。
表4特异性验证结果
稳定性样本验证结果见表5，稳定性样本1、2、3、4分别为空白食蟹猴全血、肝脏的rna与低、高浓度标准品(qch、qcl)混合进行反转录得到的cdna，样本于配制后立即进行qpcr检测，回收率在99.09％～157.03％之间，符合接受标准；于2～8℃下放置4小时后进行qpcr检测，回收率在85.17％～162.63之间，符合接受标准；于-60℃下放置一周后进行qpcr检测，回收率在56.99％～129.62％之间，符合接受标准。提示样本于2～8℃下放置4小时；-60℃及以下放置一周稳定性良好。
表5稳定性验证结果
方法学验证结果显示，方法标准曲线、精密度和准确度、耐用性、特异性、稳定性均符合接受标准。经验证后，由本方法能成功检测组织中如脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉及全血中mrna疫苗浓度，在腹股沟淋巴结中检测到mrna疫苗浓度最高为1.49pg/μl。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广东莱恩医药研究院有限公司
<120>一种定量检测机体中mrna含量的实时荧光定量pcr试剂盒及检测方法和应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1521
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aagcacaaggaccacgacgacggggaccacucgucggucacgcacuuggacuggugggcc60
ugggucgacggggggcggaugugguugucgaagugggccccgcacaugauggggcuguuc120
cacaaggccucgucgcacgacgugucguggguccuggacaaggacgggaagaagucguug180
cacuggaccaaggugcgguaggugcacucgccgugguugccgugguucgccaagcuguug240
gggcacgacgggaaguugcugccgcacaugaagcggucguggcucuucucguuguaguag300
gccccgaccuagaagccguggugggaccugucguucugggucucggacgacuagcacuug360
uugcggugguugcaccacuaguuccacacgcucaaggucaagacguugcuggggaaggac420
ccgcacaugaugguguucuuguuguucucgaccuaccucucgcucaaggcccacaugucg480
ucgcgguuguugacguggaagcucaugcacucggucgggaaggacuaccuggaccucccg540
uucgucccguugaaguucuuggacgcccucaagcacaaguucuuguagcugccgaugaag600
uucuagaugucguucguguggggguaguuggaccacgcccuggacggggucccgaagucg660
cgggaccucggggaccaccuggacggguagccguaguuguagugggccaaggucugggac720
gaccgggacguggccucgauggacugggggccgcugucgucgucgccgaccuggcggccg780
cggcggcggaugaugcacccgauggacgucggggccuggaaggacgacuucauguugcuc840
uugccgugguaguggcugcggcaccugacgcgggaccugggggacucgcucugguucacg900
ugggacuucucgaaguggcaccucuucccguagauggucuggucguugaaggcccacguc960
ggguggcucucguagcacgccaagggguuguagugguuggacacggggaagccgcuccac1020
aaguugcggugggccaagcggucgcacaugcggaccuuggccuucgccuagucguugacg1080
caccggcugaugucgcacgacauguugucgcggucgaagucguggaaguucacgaugccg1140
cacucggggugguucgacuugcuggacacgaagugguugcacaugcggcugucgaagcac1200
uaggccccgcugcuccacgccgucuagcgggggccggucuggccguucuagcggcugaug1260
uugauguucgacgggcugcugaaguggccgacgcacuagcggaccuugucguuguuggac1320
cugucguuccacccgccguugauguugauggacauggccgacaaggccuucucguuggac1380
uucgggaagcucgcccuguagucguggcucuagaugguccggccgucgugggggacguug1440
ccgcaccucccgaaguugacgaugaagggggacgucucgaugccgaaggucgggugguug1500
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<210>2
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cgtccgtcgtgtcagctatg20
