本发明属于植物技术领域，具体涉及控制番茄开花早晚的基因及应用。
背景技术：
番茄是重要的蔬菜作物，为人类和许多动物提供了营养来源(consortium,2012)，也是果实发育研究、花期早晚研究的模式植物(shalitetal.,2009；soyketal.,2017；zhangetal.,2018)。番茄开花的早晚对番茄产量、果实成熟期和栽培管理有非常重要作用。
现今，对番茄开花早晚的调控主要是采用种植管理的方法，如温度管理、肥水管理等，但是种植管理的方法调控效果有限且存在不确定性。而基因定点改良植物，则可以大幅度提高调控的成功率及效果。
目前研究表明，番茄是日中性植物，目前克隆的调控番茄花期的基因有sft(lifschitzetal.,2006；shalitetal.,2009；lifschitzetal.,2014)、sp(pnuelietal.,1998；pnuelietal.,2001)、sp5g(soyketal.,2017；zhangetal.,2018；songetal.,2020)等。随着研究的深入，发现番茄开花是由多基因的同时控制的结果。而迄今为止，仍有许多关于番茄开花早晚的调控基因未被发现，番茄开花早晚的基因调控网络不够完善，基因工程定点改良番茄花期的靶向基因还十分有限。因此挖掘新的调控番茄开花的基因具有重要的理论意义和生产实际应用价值，是番茄育种研究的重要领域之一。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供控制番茄开花早晚的基因及应用。
具体技术方案如下：
一种控制番茄开花早晚的基因，其不同之处在于，所述基因的cdna核苷酸序列如seq.no.1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：提供了如seq.no.1所示的新的用于控制番茄开花早晚的基因，该基因可以控制番茄开花的早晚，通过基因调控技术控制番茄不同开花期以及后续不同开花期品种的培育。
一种上述控制番茄开花早晚的基因编码的蛋白，其不同之处在于，所述氨基酸序列为如seq.no.2所示。
一种含上述基因的超量表达载体。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于：包含如seq.no.1所示的基因序列的超表达载体可以提高该基因的表达量，进而将番茄的开花时间提早10天左右。
进一步，所述超量表达载体的启动子为camv35s。
进一步，所述超量表达载体的骨架载体为phellsgate8载体。
一种构建上述超量表达载体的方法，其不同之处在于，包括以下步骤：
步骤s1：以番茄各个组织的cdna为模板，采用如seq.no.3～seq.no.4的引物，pcr扩增得到目的片段；
步骤s2：将所述目的片段插入线性化的载体；
步骤s3：将插入目的片段的载体转化至大肠杆菌，并进行抽提，得到所述超量表达载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过上述构建方法可以获得控制番茄开花早晚的超量表达载体。
上述控制番茄开花早晚的基因、上述控制番茄开花早晚的基因编码的蛋白、上述超量表达载体在控制番茄开花早晚或改良番茄品种上的应用。
一种含上述超量表达载体的生物材料，其不同之处在于，所述生物材料为重组微生物或转基因植物细胞系或转基因植物组织或转基因植物器官。
一种获得提早开花番茄品种的方法，其不同之处在于，将包含如seq.no.1所示的基因序列的超表达载体转入农杆菌再侵染番茄外植体，进行培育后，得到所述提早开花的番茄品种。
一种克隆上述基因的方法，其不同之处在于，将提早开花的突变体进行tail-pcr检测，锁定突变位点，并采用seq.no.11～seq.no.14的分子标记引物进一步验证，确认突变位点后获得包括solyc09g065140在内的多个与突变位点关联的基因；采用rt-pcr对突变位点关联基因进行相对表达量检测，最终锁定solyc09g065140为控制番茄花期的基因。
进一步，扩增solyc09g065140基因的引物如seq.no.17～seq.no.18所示。
附图说明
图1为wt与早花(earlyflower,ef)突变体开花表型对比图；
图2为wt与ef突变体开花表型对比图；
图3为wt与ef开花统计结果；
图4为t-dna突变体中t-dna插入位置示意图；
图5为突变体中t-dna扩增引物位置示意图；
图6为t-dna检测引物检测跑胶结果；
图7为突变位点相关基因相对表达量检测结果；
图8为solyc09g065140基因信息示意图；
图9为solyc09g065140基因在wt中的表达情况；
图10为solyc09g065140基因超量表达植株组织中solyc09g065140基因表达情况；
图11为solyc09g065140基因超量表达植株开花情况。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中，涉及的开花时间的统计方法有2种：(1)番茄从播种到第一穗花序长到2cm时需要的天数(时间)；(2)番茄从播种到第一穗花序长到2cm时花序下面的叶片数；具体参详molinero-rosalesn等在falsiflora,thetomatoorthologueoffloricaulaandleafy,controlsfloweringtimeandfloralmeristemidentity.plantjournal20(6):685-693中的报道。
本发明实施例中，ac即ailsacraig，种质来源tgrc。
实施例1
本实施例提供提早开花番茄植株的突变体获得方法，突变体由基因编辑载体进行对ac种质的grf6基因进行敲除后进行遗传转化后获得，具体步骤为：
a，基因编辑载体构建。基因编辑载体为ptx(yej,wangx,hutx,zhangfx,wangb,licx,yangtx,lihx,luyg,giovannonijj,etal.2017.anindelinthepromoterofal-activatedmalatetransporter9selectedduringtomatodomesticationdeterminesfruitmalatecontentsandaluminumtolerance.plantcell29(9):2249-2268.)。该载体来源于pbin9，该载体的靶序列为番茄u6启动子驱动，靶点序列1为：atcttctctataccatcaga；靶序列2：atttacaagtacatggtctc；cas9序列为2个串联的35s启动子驱动，其具体操作方法为本领域常规技术；
b，遗传转化。采用欧阳波等报道的农杆菌介导法(2002)将基因编辑载体对ac种质进行遗传转化，在后续培养的f1代植株中，发现了一株提早开花的番茄突变体，本发明命名为ef(earlyflower)。
实施例2
本实施例提供一种控制番茄开花早晚突变基因的克隆方法。
包括如下步骤：
(1)ef突变体性状分析。将ef与wt(野生型，种质为ac)的开花情况进行比较，其比对情况如图1～图3所示，图1中，箭头指示的地方为开花的地方；图2中，箭头指示的地方为开花的地方，数字标明的地方为叶片生长的地方；图1及图2共同表明，ef相较于wt，第一花序下的叶片数没有显著差异，但从播种到开花的时间显著缩短，开花时间显著提早，同一时间段的开花数量较多。
图3中，将wt及ef的开花情况作更为细致的统计，图3a中，统计了两者随时间的叶片数量变化情况，图3b中，统计了开花前两者第一花序下的叶片总数，图3c中，统计了两者叶片与叶片的距离。
从图3可以看出，ef突变体相较wt而言，第一穗花序下的叶片数目与wt没有差异，突变体叶片与叶片的距离比wt明显变短，叶片变简单，叶片生长速度变快，开花时间较wt时间提早了至少10天。
(2)ef基因的克隆及序列分析：结合实施例1中突变体的获得过程，番茄提早开花的原因很可能是引入基因敲除载体的外源dna片段插入发生基因突变，本发明中，将此段序列命名为t-dna序列，其长度约为10092bp。
使用tail-pcr方法对ef突变体gdna中t-dna的插入位点进行检测，根据t-dna左右两端的引物序列，我们设计了tail-pcr的检测引物为：seq.no.5～seq.no.10所示，如图4所示，初步确认t-dna插入位点在编号为solyc09g065140的基因终止密码子下游139bp的位置，为进一步确认，如图5所示，针对插入位点前后进一步开发多重pcr检测引物，p1、p2、p3、p4为检测引物，p1序列如seq.no.11所示，p2序列如seq.no.12所示，p3序列如seq.no.13所示，p4序列如seq.no.14所示，其检测结果如图6所示，在wt中p1和p4引物对能够扩增出条带；而在ef突变体中，，引物对p1 p2和p3 p4能够扩增出目的片段，而引物对p1 p4因为存在t-dna的插入，不能检测出条带，其检测结果进一步确认了solyc09g065140的基因终止密码子下游139bp的位置是t-dna的插入位点。
得到确切的t-dna的插入点后，为进一步明确t-dna的插入对关联基因的影响，锁定了插入位点附近的四个基因solyc09g065130、solyc09g065140、solyc09g065150及solyc09g065160。对ef突变体中上述基因的表达量进行检测，solyc09g065130(简称130)的扩增引物为seq.no.15～seq.no.16，solyc09g065140(简称140)的扩增引物为seq.no.17～seq.no.18，solyc09g065150(简称150)的扩增引物为seq.no.19～seq.no.20，solyc09g065160(简称160)的扩增引物为seq.no.21～seq.no.22。其检测结果如图7所示，基因solyc09g065140的表达量显著上调，初步判定solyc09g065140为番茄开花早晚的调控基因，且该基因表达量增加时，可提早开花。
solyc09g065140相关信息如图8所示，其中，solyc09g065140的cdna序列如seq.no.1所示转录出mrna情况，其编码蛋白的氨基酸的序列如seq.no.2(protein)所示，是一个由243个氨基酸组成的蛋白，该蛋白的139到191位氨基酸为fantasticfour(faf)蛋白结构域，也称slfaf1/2c。
取wt各组织对solyc09g065140基因表达情况作进一步研究，测其在番茄不同组织的表达量，如图9所示，solyc09g065140基因在根、叶、花蕾和开放的花中表达量较高。
实施例3
为进一步验证solyc09g065140基因的生物学功能，本实施例构建了solyc09g065140基因的超量表达载体，转入野生型外植体，进行培育后，进行测试，本实施例中，以ac作为野生型外植体，其具体步骤如下：
(1)solyc09g065140基因超量表达载体的构建。
番茄cdna的获得。获取ac的根、茎、叶、花和不同时期的果实样品，置于液氮中速冻，提取rna，然后进行反转录，获得ac番茄全组织的cdna。
根据ef编码基因的序列，设计引物ef-oe-fw(seq.no.3)和ef-oe-rv(seq.no.4)。以ac番茄的cdna为模板，pcr扩增回收目的片段，并测定浓度，作为插入片段。
使用限制性核酸内切酶xhoi和xbai对phellsgate8载体进行双酶切，回收载体骨架，并测定浓度，作为线性化载体。
使用同源重组的方法，将插入片段重组到线性化载体中，然后热激转化大肠杆菌trans-t1。
使用壮观霉素sep进行阳性克隆筛选，使用35s引物(seq.no.23)和ef-oe-rv对单克隆进行阳性检测。对阳性克隆进行扩大培养提取质粒，测序后选择测序结果与参考序列一致的质粒进行保存，并将质粒转入农杆菌c58中用于外植体侵染。
(2)番茄遗传转化
采用实施例1农杆菌介导法对ac种质进行遗传转化，对移栽出来的植株体取dna进行目标基因的检测。阳性材料即为获得的阳性转基因材料。
转基因材料的阳性检测和转入基因表达量检测结果如图10所示，o结果显示，e-5、oe-7、oe-8均为阳性转基因材料，solyc09g065140基因在阳性转基因材料的表达量显著增加。
其开花情况如图11所示，图11中，oe-5、oe-7、oe-8均为阳性转基因材料，箭头指向开花点，数字为叶片着生的地方，图11结果显示，超量表达植株其开花时间明显提早。进一步说明，solyc09g065140基因为调控番茄开花的调控基因。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华中农业大学
<120>控制番茄开花早晚的基因及应用
<160>23
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>732
<212>dna
<213>番茄(tomato)
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