本发明涉及免疫医学领域，尤其涉及一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
2008年《新英格兰医学杂志》报道1例晚期黑色素瘤的免疫治疗取得成功，该患者为全身多处转移病例，经自身cd4 t细胞治疗后所有病灶消失，经随访26个月长期生存。2010年fda批准dendreoncorporation(丹德里昂公司)自体免疫细胞治疗技术用于前列腺癌临床应用，2011年的诺贝尔医学奖也授予了从事肿瘤免疫治疗相关的3位科学家，预示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。
近几年，利用基因修饰诱导的t细胞免疫治疗肿瘤取得了良好的疗效，为肿瘤的免疫细胞治疗发展指明了新的方向。预示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。
免疫细胞治疗技术经历了lak、cik、dc-cik的发展历程，并朝着抗原负载的dc诱导t细胞(dikat)、基因修饰的dc诱导t细胞(av/lv-dc-ctl)以及基因修饰的嵌合抗原受体t细胞(car-t)方向飞速发展，目前由诺华公布的针对cd19靶点的b淋巴瘤临床实验结果宣布完全有效率达到了93％，更是突出了免疫细胞疗法抗癌的前景。然而car-t因其细胞复杂的制备过程，高额的费用也同时让人望而却步，其每个疗程的成本预计是50万美元，并且目前也只是针对cd19阳性b淋巴瘤体现了良好疗效，其局限性显而易见。
如何研发一种可以加强免疫细胞疗法的特异性和有效性，并具有简单、方便使用等优点的免疫细胞治疗技术是目前亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种双特异性抗体及其制备方法和应用，特别是一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括结合在效应t细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。
本发明中所述的第二抗体部分可以是一种或多种抗体，其均可以结合靶细胞。
本发明中，所述第一抗体部分和第二抗体部分通过纳米材料进行连接。其连接方式可采用利用纳米颗粒表面的羧基和抗体的氨基连接。
“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。本文所述的“多特异性抗体”或“双特异性抗体”包括通过纳米材料连接的结合不同靶标的多种或两种抗体(例如两种单克隆抗体)。本文所述的多特异性抗体或双特异性抗体可以具有通过纳米材料连接的至少一种特异性结合t细胞的抗体和至少一种特异性结合由患病细胞、组织、器官或病原体产生或与其相关的抗原(例如肿瘤相关抗原)的抗体。
本发明以免疫细胞靶向治疗为原则，利用抗体的特异性结合能力，将能够特异识别肿瘤细胞和肿瘤杀伤细胞的抗体用临床可用的降解的纳米材料连接起来，从而形成双特异性抗体。与抗癌单抗相比较，大多数抗癌单抗作为治疗疾病的药物主要基于其固有的生物学功能包括：补体介导的细胞毒性作用(cdc)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(adcc)凋亡诱导、调理吞噬等。本发明的双特异性抗体是其一边特异性识别并结合肿瘤细胞，另一边识别并结合杀伤性t淋巴细胞，从而帮助t细胞识别肿瘤细胞，并拉近肿瘤细胞和杀伤性t淋巴细胞之间的物理距离，方便t淋巴细胞杀伤肿瘤细胞，起到加强免疫细胞疗法的特异性和有效性的目的。
本发明中所述纳米材料为生物可降解纳米材料。
本发明中所述的纳米材料通常是以纳米颗粒的形式而存在，选自常规的可降解的纳米材料，例如可以是聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚己内酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己内酯共聚物中的任意一种或至少两种的混合物，优选但不限于此。
本发明采用纳米材料具有缓释、良好的生物相容性等优点，例如plga是美国fda批准的药用辅料，具有良好生物相容性和生物可降解性，无毒、无刺激性，强度高，易加工成型，在生物题内经酶解最终分解产物为水合二氧化碳，置入体内后3-6个月可完全吸收。
本发明中，所述靶细胞是b细胞、癌细胞或病原体细胞等。
优选地，所述靶细胞上表达的抗原为碳酸酐酶ix、甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、a3、a33抗体特异性抗原、ang2、art-4、b7、ba733、bage、bre3-抗原、ca125、camel、cap-1、casp-8/m、、cccl19、cccl21、cd1、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd29、cd30、cd32h、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd45、cd46、cd52、cd54、cd55、cd59、cd64、cd66a-e、cd67、cd70、cd70l、cd74、cd79a、cd79b、cd80、cd83、cd95、cd126、cd132、cd133、cd138、cd147、cd154、cdc27、cdk-4/m、cdkn2a、cs1、cxcr4、cxcr7、cxcl12、hif-1α、结肠特异性抗原-p(csap)、cea(ceacam5)、ceacam6、c-met、dam、egfr、egfrviii、egp-1、egp-2、elf2-m、ep-cam、flt-1、flt-3、叶酸受体、g250抗原、gage、gp100、gpa33、grob、hla-dr、hm1.24、人绒毛膜促性腺激素(hcg)和其亚单位、her2/neu、her3、hmgb-1、低氧可诱导因子(hif-1)、hsp70-2m、hst-2、ia、igf-1r、ifn-γ、ifn-α、ifn-β、il-2、il-4r、il-6r、il-13r、il-15r、il-17r、il-18r、il-6、il-8、il-12、il-15、il-17、il-18、il-23、il-25、il-33、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、kc4-抗原、ks-1-抗原、ks1-4、l1cam、le-y、ldr/fut、巨噬细胞迁移抑制因子(mif)、mage、mage-3、mart-1、mart-2、ny-eso-1、trag-3、mcrp、mcp-1、mica、micb、mip-1a、mip-1b、mif、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc13、muc16、mum-1/2、mum-3、nca66、nca95、nca90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、plagl2、前列腺酸性磷酸酶、psa、prame、psma、plgf、ilgf、ilgf-1r、il-6、il-25、ror-1、rs5、rantes、t101、sage、s100、存活蛋白、存活蛋白-2b、tac、tag-72、腱生蛋白、trail受体、tnf-α、tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、trop-2、vegfa、vegfr、ed-b纤连蛋白、wt-1、17-1a-抗原、补体因子c3、c3a、c3b、c5a、c5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、kras、cmet、致癌基因产物、hiv病毒、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、抗甲氧西林性金黄色葡萄球菌(meticillin-resistantstaphylococcusaureus)、嗜肺军团菌(legionellapneumophilia)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(escherichiacoli)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、肺炎球菌(pneumococcus)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、b型流感嗜血杆菌(hemophilisinfluenzaeb)、苍白密螺旋体(treponemapallidum)、莱姆病螺旋体(lymediseasespirochetes)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、i型单纯疱疹病毒、ii型单纯疱疹病毒、人血清细小样病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人t细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒、猫白血病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(plasmodiumvivax)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、让氏锥虫(trypanosomarangeli)、克氏锥虫(trypanosomacruzi)、罗德西亚锥虫(trypanosomarhodesiensei)、布氏锥虫(trypanosomabrucei)、曼森氏裂体吸虫(schistosomamansoni)、日本裂体吸虫(schistosomajaponicum)、牛巴贝虫(babesiabovis)、艾美耳球虫(elmeriatenella)、旋盘尾丝虫(onchocercavolvulus)、热带利什曼虫(leishmaniatropica)、旋毛虫(trichinellaspiralis)、小泰勒虫(theileriaparva)、泡状带绦虫(taeniahydatigena)、羊绦虫(taeniaovis)、牛肉绦虫(taeniasaginata)、细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)、科氏中殖孔绦虫(mesocestoidescorti)、关节炎支原体(mycoplasmaarthritidis)、鼻支原体(m.hyorhinis)、口腔支原体(m.orale)、精氨酸支原体(m.arginini)、拉氏无胆甾原体(acholeplasmalaidlawii)、唾液支原体(m.salivarium)和肺炎支原体(m.pneumoniae)中的任意一种，优选地为cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、muc1、muc16、her2、her3、egfrviii、vegfa、cea、gpa33、gp100、ang2、l1cam、ror-1、cs1、mica或micb中的任意一种。
优选地，所述效应t细胞上表达的抗原为adam17、cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd16、cd16b、cd25、cd28、cd30、cd32a、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd56、cd57、cd64、cd69、cd74、cd89、cd90、cd137、cd177、ceacam6、ceacam8、hla-drα链、kir、lsectin或slc44a2中的任意一种，优选地为cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd8、cd25、cd28、cd30、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd69或cd90中的任意一种。
第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体的制备方法，其包括将纳米材料与第一抗体部分和第二抗体部分连接。
本发明中所述的双特异性抗体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)纳米材料的制备、收集和活化：
(2)将步骤(1)得到的纳米材料与第一抗体部分和第二抗体部分的混合物进行连接。
本发明的步骤(1)中，所述纳米材料的制备包括：利用溶剂将纳米材料完全溶解，搅拌，加水，形成均匀的乳浊液。
优选地，所述纳米材料为聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚己内酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己内酯共聚物中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述溶剂为丙酮、丁酮、甲醇、乙醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述纳米材料的收集包括：离心收集制备的纳米材料，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米材料。
优选地，所述纳米材料的活化包括：利用1-10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(eds)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合溶剂室温活化纳米材料0.5-5h。
本发明的步骤(2)中，所述连接包括：将活化后的纳米材料离心收集，然后用连接反应液洗涤纳米材料1次，将需要连接的第一抗体部分和第二抗体部分等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应0.5-5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液(d-pbs)中放4℃保存备用。
本发明中所述双特异性抗体的制各方法，具体包括以下步骤：
(1)纳米材料的制备：利用丙酮将纳米材料完全溶解至浓度为5～30mg/ml，按照丙酮和去离子水1∶4的体积比，在500～1500rpm/min磁力搅拌的状态下将纳米材料与内酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至内酮挥发；
(2)纳米材料的收集：8000～15000rpm/min离心收集制备的纳米材料，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米材料；
(3)纳米材料的活化：利用1～10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合溶剂室温活化纳米材料0.5～5h；
(4)纳米材料连接抗体：将活化后的纳米材料离心收集，然后用0.1m、ph＝8.0的杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料1次，将需要连接的第一抗体部分和第二抗体部分等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应0.5～5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液中放4℃保存备用。
第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或诊断肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于：肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、急性(慢性b)淋巴细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌和淋巴瘤。
第四方面，本发明还提供用于治疗或预防肿瘤的根据权利要求1-3任一项所述的双特异性抗体。所述肿瘤包括但不限于：肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、急性(慢性b)淋巴细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌和淋巴瘤。
第五方面，本发明提供治疗肿瘤的方法，所述方法包括给受治疗者施用本发明的双特异性抗体。所述肿瘤包括但不限于：肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、急性(慢性b)淋巴细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌和淋巴瘤。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)与现有的采用生物法表达双特异性抗体相比，本发明制备的双特异性抗体具有更加快捷、工艺更简单实用等特点，其可以将市面上已经审批上市的单抗药物直接拿来连接实用，因所使用的原料全是临床已经审批上市的，故可以快速推向临床使用；
(2)与基因修饰的嵌合抗原受体t细胞(car-t)免疫细胞疗法相比，本发明的双特异性抗体具有生物可降解，无基因重组，副作用小，安全性高，成本低，可针对不同肿瘤细胞组合对应的特异性抗体，使用方便等优点，只需在体外诱导的ctl细胞回输时同时加入本发明的双特异性抗体制剂即可起到相似的靶向和高效杀伤肿瘤细胞的目的，并且产生的副作用比car-t疗法小；
(3)本发明的所有材料在人体内均可降解成无毒无害产物，并且可以在短期内降解代谢，因而比car-t的安全性要高。
附图说明
图1是实施例1的双特异性抗体的组装示意图。
图2是实施例1的双特异性抗体的细胞杀伤实验评估结果。
图3-9显示了其他双特异性抗体杀伤肿瘤细胞的能力。
图10显示了双特异性抗体抗cd3-plga-抗muc1体内抗肿瘤的效力。
图11为体内抗肿瘤实验的实验动物死亡曲线。
具体实施方式
以下将结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例
实施例1
图1是该实施例的双特异性抗体的组装示意图，其制备的具体步骤如下：
(1)plga纳米颗粒的制备：利用丙酮将plga完全溶解至浓度为5mg/ml，按照丙酮和去离子水1∶4的体积比，在1000rpm/min磁力搅拌的状态下将plga与丙酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至丙酮挥发；
(2)plga纳米颗粒的收集：8000rpm/min离心10min收集制备得到较大颗粒的纳米颗粒；再用15000rpm/min离心10min收集得到较小颗粒的纳米颗粒，然后分别用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米颗粒，较大颗粒的纳米颗粒和较小颗粒的纳米颗粒分别进行如下操作；
(3)plga纳米颗粒的活化：利用5mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合溶剂室温活化plga纳米颗粒1h；
(4)plga纳米颗粒连接抗体：将活化后的纳米材料离心收集，然后用0.1m、ph＝8.0的杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料1次，将需要连接的cd3和muc1单抗等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应0.5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液中放4℃保存备用。
实施例2
将实施例1的双特异性抗体加入t细胞和癌细胞mcf-7杀伤实验体系中，检测该双特异性抗体对t细胞杀伤癌细胞能力的提升情况，其中t细胞∶mcf-7＝4∶1，反应时间为8h，其中对照组为加等量纳米颗粒(未连接任何抗体)，结果采用3次独立重复实验结果平均值±标准差表示，其评估结果如图2所示，其中，*代表t检验比较具有显著差异。
其中，图2中的a表示较大颗粒(即采用转速为8000rpm/min，10min离心收集得到的颗粒)的纳米颗粒连接的双特异性抗体，其中的b表示较小颗粒(即采用转速为8000rpm/min，10min未离心下来，15000rpm/min，10min离心得到的颗粒)的纳米颗粒连接的双特异性抗体。
从图2可以看出，其中对照组的杀伤率为7.9％；较大颗粒的纳米颗粒连接的双特异性抗体组的杀伤率为24.5％；较小颗粒的纳米颗粒连接的双特异性抗体的杀伤率为40.7％。
实施例3
以pla为纳米材料，制备了能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特性抗体，其制备方法如下：
(1)pla纳米颗粒的制备：利用丙酮将pla完全溶解至浓度为15mg/ml，按照丙酮和去离子水1∶4的体积比，在500rpm/min磁力搅拌的状态下将pla与丙酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至丙酮挥发；
(2)pla纳米颗粒的收集：8000rpm/min离心收集制备的纳米颗粒，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米颗粒；
(3)pla纳米颗粒的活化：利用lmg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合溶剂室温活化pla纳米颗粒0.5h：
(4)pla纳米颗粒连接抗体：将活化后的纳米材料离心收集，然后用0.1m、ph＝8.0的杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料一次，将需要连接的cd3单抗和cd19单抗等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液中放4℃保存备用。
实施例4
以pcl为纳米材料，制备了能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特性抗体，其制备方法如下：
(1)pcl纳米颗粒的制备：利用丙酮将pcl完全溶解至浓度为30mg/ml，按照丙酮和去离子水1∶4的体积比，在1500rpm/min磁力搅拌的状态下将pcl与丙酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至丙酮挥发；
(2)pcl纳米颗粒的收集：15000rpm/min离心收集制备的纳米颗粒，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米颗粒；
(3)pcl纳米颗粒的活化：利用10mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺混合溶剂室温活化plga纳米颗粒5h；
(4)pcl纳米颗粒连接抗体：将活化后的纳米材料离心收集，然后用0.1m、ph＝8.0的杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料一次，将需要连接的cd3和cd20单抗等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应2.5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液中放4℃保存备用。
实施例5
对通过plga连接的抗cd3和抗muc1双特异性抗体(抗cd3-plga-抗muc1)杀伤其他肿瘤细胞的能力进行了评估。
具体而言，于96孔板中，以5000个靶细胞每孔培养12h后，弃原培养基，利用无细胞因子的x-vivo15培养基调整dc-cik细胞密度，使100μl体积dc-cik细胞数量为靶细胞4倍(效靶比为4∶1)，加100μldc-cik细胞悬液到癌细胞培养板中，并加入10μl(双特异性抗体制剂含量为0.2mg，含单抗成分共0.2μg)制备的双特异性抗体，培养箱中孵育8h，然后加入cck-8试剂，按照试剂说明进行孵育，用酶标仪检测450nm处吸光值。对数据进行统计分析，按照以下公式计算dc-cik细胞对癌细胞的杀伤率。
杀伤率＝[1-(实验组-效应对照组)/(靶对照组-空白对照组)]×100％
其中，空白对照表示加入培养基；靶对照组表示加入靶细胞 培养基；效应对照组表示加入效应细胞 培养基；实验组表示效应细胞 靶细胞 培养基 双特异性抗体。
结果显示于表1和图3。
表1.抗cd3-plga-抗muc1对肿瘤细胞的杀伤能力
注：hkc-人胚肾上皮细胞；a549-人非小细胞肺癌细胞；hepg2-人肝癌细胞；ht29-人结肠癌细胞；ags-人胃腺癌细胞；hela-人宫颈癌细胞；5637-人膀胱癌细胞；os-rc-2-人肾癌细胞。
实施例6
使用与上述类似的方法，以plga、pla或pcl为纳米材料，制备了通过纳米颗粒连接的抗cd3和抗cd33双特异性抗体抗cd3-plga-抗cd33、抗cd3-pla-抗cd33和抗cd3-pcl-抗cd33。按照实施例5中所述的方法，对本发明的双特异性抗体杀伤肿瘤细胞的能力进行了评估。
结果显示于表2和图4中。
表2.抗cd3-plga-抗cd33对肿瘤细胞的杀伤能力
注：raji-黑人burkitt淋巴瘤细胞；ramos-人b淋巴细胞瘤细胞。
双特异性抗体cd3-pla-cd33和cd3-pcl-cd33对于黑人burkitt淋巴瘤细胞和人b淋巴细胞瘤细胞，同样表现出83％以上的杀伤率。
实施例6
使用与上述类似的方法，以plga、pla或pcl为纳米材料，制备了连接有抗cd8抗体和抗muc1抗体的纳米颗粒抗cd8-plga-抗muc1、cd8-pla-muc1和抗cd8-pcl-抗muc1。用实施例5中所述的方法对本发明的双特异性抗体杀伤肿瘤细胞的能力进行了评估。
结果显示于表2和图5中。
表3.抗cd8-plga-抗muc1对肿瘤细胞的杀伤能力
注：hkc-人胚肾上皮细胞；a549-人非小细胞肺癌细胞；hepg2-人肝癌细胞；ht29-人结肠癌细胞；ags-人胃腺癌细胞；hela-人宫颈癌细胞；5637-人膀胱癌细胞；os-rc-2-人肾癌细胞。
双特异性抗体抗cd8-pla-抗muc1和抗cd8-pcl-抗muc1显示出对于人非小细胞肺癌细胞和人胃腺癌细胞均具有95％以上的杀伤率；对于人结肠癌细胞和人肾癌细胞均具有92％以上的杀伤率；对于人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞和人膀胱癌细胞，其均表现出接近90％的杀伤率，对于人肝癌细胞的杀伤率也在80％左右。
实施例7
使用与上述类似的方法，制备了通过纳米颗粒连接的其他双特异性抗体：抗cd3-plga-抗cd19、抗cd3-plga-抗cd20、抗cd3-plga-抗her2、，对这些杀伤肿瘤细胞的能力进行了评估。结果显示于表4-7中和图6-9。
表4.抗cd3-plga-抗cd19对肿瘤细胞的杀伤能力
注：raji-黑人burkitt淋巴瘤细胞；ramos-人b淋巴细胞瘤细胞。
表5.抗cd3-plga-抗cd20对肿瘤细胞的杀伤能力
注：raji-黑人burkitt淋巴瘤细胞；ramos-人b淋巴细胞瘤细胞。
表6.抗cd3-plga-抗her2对肿瘤细胞的杀伤能力
注：mcf-7-人乳腺癌细胞。
表7.抗cd3-plga-抗cd38对肿瘤细胞的杀伤能力
注：raji-黑人burkitt淋巴瘤细胞。
实施例6.体内抗肿瘤实验
对本发明的双特异性抗体内抗肿瘤的效力进行了评估。具体而言，在健康balb-c裸鼠(清洁级，雌性，四周龄，体重18-22g，购自广东省医学实验动物中心)腋下接种人肺腺癌细胞a549，接种3-4周后取瘤体直径约0.5×0.5cm的裸鼠30只随机分成3组用于实验。
于第1、3、5天分别给药一次，采用尾静脉注射方式给药，dc-cik组每次注射1×106数量的dc-cik细胞，dc-cik 双抗组每次注射1×106数量的dc-cik细胞和0.4mg(单抗含量共0.4μg)双特异性抗体抗cd3-plga-抗muc1，对照组注射同等体积的生理盐水。
从第一天起开始测量记录瘤体体积。计算双特异性抗体对肿瘤的抑制率。
在观察到对照组和单独dc-cik治疗组个体全部死亡后停止实验，总观察时间为128天。
各个组的平均肿瘤体积显示于图10中。实验结果表明：双特异性抗体抗cd3-plga-抗muc1对肿瘤的抑制率达到88.73％，有60％个体(6/10)肿瘤完全消失。
就存活时间而言，当与未治疗的小鼠相比时，用单独dc-cik治疗和用dc-cik 双特异性抗体治疗均提供显著的存活益处(图11)。截止第105天，未治疗组小鼠全部死亡。截至第128天，单独dc-cik治疗组小鼠全部死亡，而dc-cik 双特异性抗体治疗组仍有6只小鼠存活。
通过上述实施例可以看出，本发明的双特异性抗体对t细胞杀伤癌细胞的能力有所提升，能联合免疫细胞增强肿瘤杀伤能力，相比car-t免疫细胞疗法，具有副作用小，安全性高，成本低，使用方便等特点。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
