本发明涉及与转导癌细胞的生长、分化、侵袭和转移相关的生化信号的β1整合素特异性结合的抗体，更详细地，本发明的抗体通过抑制β1整合素的信号转导功能，可以用于β1整合素过表达的各种癌症(例如，非小细胞肺癌)的诊断及治疗用途。
背景技术：
2018年，全球有1800万癌症病例，估计有900万人死亡。五分之一的男性和六分之一的女性会在一生中患上癌症，八分之一的男性和十一分之一的女性会死于癌症。在全球范围内，癌症诊断后五年内的幸存者总数估计为4380万(pressreleasen263，who，internalagencyforresearchoncancer，12september2018)。肺癌是仅次于乳腺癌和大肠癌的发病率最高的三大常见癌症。根据2018年全球癌症统计数据(globalcancerstatitics)，预计全球有210万例肺癌病例和180万例死亡病例，占所有癌症死亡人数的1/5或18.4％(worldhealthorganizationglobalhealthobservatorygeneva2018who.int/gho/database/en/.accessedjune21，2018)。
肺癌主要分为小细胞肺癌(smallcelllungcancer)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer；nsclc)。非小细胞肺癌根据癌细胞的大小和形状分为鳞状细胞肺癌(squamouscelllungcancer)、腺癌(adenocarcinoma)和大细胞肺癌(large-celllungcancer)。根据韩国癌症信息中心2018年的数据，2017年肺癌24235例中，癌(carcinoma)占86.6％，肉瘤(sarcoma)占0.2％，癌中非小细胞肺癌占78％，可见非小细胞肺癌的占比很高。
由于非小细胞肺癌是一种异质性很强的(heterogenouse)癌症类型，对抗癌药物的反应性非常低，因此目前仍需要开发治疗药物。尽管自1950年代以来就有关于肺癌的遗传学和组织学研究，但直到2000年代初才主要使用基于铂(platinum)的细胞毒性药物(cytotoxicdrug)的双联疗法。这涉及使用顺铂(cisplatin)和紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)或多西他赛(docetaxel)之一的组合，或卡铂(carboplatin)和紫杉醇(paclitaxel)的组合。这种治疗方法伴随着耐药性以及全身副作用，因此效果不佳。
之后出现的药物是靶向治疗剂，专门作用于egfr、ras和alk的基因突变。egfr突变的患者组有egfr酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor，tki)，如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)和阿法替尼(afatinib)等，但ras突变对这些egfrtki表现出耐药性。alk突变也显示出对egfrtki的耐药性，但赛可瑞xalkori(克唑替尼crizotinib)有效果。在抗体治疗剂方面，此前用于其他适应症的西妥昔单抗(cetuximab)(egfr靶点)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(vegf靶点)和曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)(her2)等被批准为肺癌治疗药物，但并未显示出太大效果，最近受瞩目的pd-1或将pd-l1作为靶点的免疫抗癌药物的情况下，反应性达到约20～30％，因此仍需要开发新的治疗药物。
在egfrtki的情况下，egfr突变患者组显示出约70％的高反应率，但在大多数情况下，一年内发生耐药性。原因包括抗性突变(resistantmutation)、选择性剪接(alternativesplicing)、基因扩增(geneamplification)和旁路激活(by-pathway)等。即，通过egfrtki新产生egfrt790m等突变或her2或met扩增等各种信号转导系统发生异常，从而诱发耐药性。
耐药性的另一个重要原因是β1整合素过度表达。β1整合素被认为是一种转导与细胞外环境相关的生化信号的物质，特别是与恶性细胞的生长、分化、侵袭和转移潜能相关的生化信号(julianorl.theroleofbeta1integrinsintumors[j].semincancerbiol，1993；4(5)：277-283.)。然而β1整合素的异常表达会影响肿瘤抑制和进展，β1整合素的增加可促进肿瘤细胞存活并赋予几种肿瘤细胞类型对化疗的抗性(hodkinsonps，elliottt，wongws，etal.ecmoverridesdnadamage-inducedcellcyclearrestandapoptosisinsmall-celllungcancercellsthroughbeta1integrin-dependentactivationofpi3-kinase[j].celldeathdiffer，2006；13(10)：1776-1788.；aoudjitf，vuorik.integrinsignalinginhibitspaclitaxel-inducedapoptosisinbreastcancercells[j].oncogene，2001；20(36)：4995-5004.；morozevichge，kozlovani，preobrazhenskayame，etal.theroleofbeta1integrinsubfamilyinanchorage-dependentapoptosisofbreastcarcinomacellsdifferinginmultidrugresistance[j].biochemistry(mosc)，2006；71(5)：489-495.)，与对放射疗法的抵抗有关(parkcc，zhanghj，yaoes，parkcj，bissellmj.beta1integrininhibitiondramaticallyenhancesradiotherapyefficacyinhumanbreastcancerxenografts.cancerres，2008；68(11)：4398-405.)。并且，与使用贝伐珠单抗(bevacizumab)抑制血管生成的癌症治疗的抗性有关(carbonellws，delaym，jahangiria，parkcc，aghimk.β1integrintargetingpotentiatesantiangiogenictherapyandinhibitsthegrowthofbevacizumab-resistantglioblastoma.cancerres，2013；73(10)：3145-54.)。β1整合素沉默细胞的情况下，有报道称对铂类顺铂和egfrtki药物吉非替尼的敏感性增加(morellov，cabodis，sigismunds，camacho-lealmp，repettod，volantem，papottim，turcoe，defilippip.β1integrincontrolsegfrsignalingandtumorigenicpropertiesoflungcancercells.oncogene2011；30：4087-4096.)。
因此，为了解决医学未满足需求，即，克服现有肺癌治疗剂的耐药性，对能在早期中和病原体的新药的需求正在出现，该药需要与现有药物联合使用。
上述背景技术所描述的事项仅是为了提高对本发明背景技术的理解，不应视为承认它们与本领域普通技术人员已知的现有技术相对应。
技术实现要素：
技术问题
本发明人为了开发与β1整合素特异性结合而使癌症细胞凋亡能力最大化的新型抗体而锐意努力。结果，通过用其他氨基酸序列替换并优化p5抗体的一些氨基酸序列，通过证实可以最大化抗癌活性而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供将β1整合素识别为抗原并与其特异性结合的单克隆抗体或其片段。
本发明的再一目的在于，提供包含上述单克隆抗体或其片段的多特异性抗体(multispecificantibody)或抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)。
本发明的的又一目的在于，提供编码上述单克隆抗体或其片段的核酸分子。
本发明的的又一目的在于，提供包含上述核酸分子的载体。
本发明的的又一目的在于，提供包含上述载体的宿主细胞。
本发明的的又一目的在于，提供包含上述单克隆抗体、核酸分子或载体的组合物。
本发明的的又一目的在于，提供样品中包含的β1整合素的定量方法，其包括处理上述单克隆抗体或其片段的步骤。
本发明的的又一目的在于，提供包含上述单克隆抗体或其片段的β1整合素定量试剂盒。
本发明的的又一目的在于，提供用于诊断由β1整合素的过表达引起的疾病的信息的方法。
本发明的其他目的及优点可通过以下具体实施方式、权利要求书及附图更加明确。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供将β1整合素识别为抗原并与其特异性结合的单克隆抗体或其片段。
本发明人为了开发β1整合素特异性结合而阻碍信号转导过程的新型抗体而锐意努力。结果，通过用其他氨基酸序列替换并优化现有抗体的一些氨基酸序列，从而发现了使抗癌活性最大化的新型抗体。
β1整合素被认为是一种转导与细胞外环境相关的生化信号的物质，特别是与恶性细胞的生长、分化、侵袭和转移潜能相关的生化信号。并且，β1整合素的增加可促进肿瘤细胞存活并赋予几种肿瘤细胞类型对化疗的抗性(hodkinsonps，elliottt，wongws，etal.ecmoverridesdnadamage-inducedcellcyclearrestandapoptosisinsmall-celllungcancercellsthroughbeta1integrin-dependentactivationofpi3-kinase[j].celldeathdiffer，2006；13(10)：1776-1788.；aoudjitf，vuorik.integrinsignalinginhibitspaclitaxel-inducedapoptosisinbreastcancercells[j].oncogene，2001；20(36)：4995-5004.；morozevichge，kozlovani，preobrazhenskayame，etal.theroleofbeta1integrinsubfamilyinanchorage-dependentapoptosisofbreastcarcinomacellsdifferinginmultidrugresistance[j].biochemistry(mosc)，2006；71(5)：489-495)。
在本说明书中，术语“抗体”可以为免疫球蛋白分子中的任意类型的抗体(例如，igg、ige、igm、igd、iga或igy)，可以为任意亚类的抗体(例如，在人类中有igg1、igg2、igg3及igg4；以及在小鼠中有igg1、igg2a、igg2b及igg3)。免疫球蛋白(例如，igg1)可以存在有多种同种异型(allotype)，在本说明书中，术语“抗体”通常包括已知的同种型(isotype)及同种异型(allotype)。并且，在本说明书中，术语“抗体”可以为igg1、igg2、igg3或igg4，或者可以为它们的杂交(hybrid)类型(例如，igg2及igg4的杂交)。
在本说明书中，术语“单克隆抗体”或“monoclonalantibody”是指对特定表位表现出单一结合特异性(singlebindingspecificity)及亲和度(affinity)的抗体。
本说明书中，上述单克隆抗体包括其片段，上述片段优选地指抗原结合片段(antigenbindingfragment)。可以使用本领域已知的各种方法来制备上述片段。例如，通过使用如木瓜蛋白酶(产生fab片段的生产)或胃蛋白酶(f(ab')2)等酶对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割(proteolyticcleavage)，来制备fab以及f(ab')2片段。
在本说明书中，术语“片段”可以是fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv(单链可变片段)或包含单体的vh或vl结构域的sdab，这些片段是本领域众所周知。
根据本发明一实施例，上述单克隆抗体或其片段是单链抗体(single-chainvariablefragment，scfv)。
本发明的单克隆抗体或其片段优选地可包括序列表中序列3的重链可变区(heavychainvariableregion，vh)和/或序列表中序列4的轻链可变区(lightchainvariableregion，vl)。
为了形成重链(heavychain)，vh结构域或一个或多个的cdr可以与不变区域连接。并且，为了形成轻链(lightchain)，vl结构域或一个或多个的cdr可以与恒定结构域连接。全长(fulllength)重链及全长轻链连接构成全长抗体。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述单克隆抗体或其片段的多特异性抗体(multispecificantibody)或抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)。
多特异性抗体(multispecificantibody)是指靶向两种以上抗原的抗体或其片段，包括双特异性抗体(bispecificantibody)和三特异性抗体(trispecificantibody)。例如，双特异性抗体是指抗体的两个臂(arm)中，一个臂包括本发明的β1整合素的抗体或其抗原结合片段，另一个臂包括除了β1整合素之外的其他抗原。
抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)是指上述抗体或其片段与药物的结合体，直至将药物递送至靶细胞，药物需稳定结合于抗体，且递送至靶标后远离抗体。在本发明中，上述抗体或其片段与药物(抗癌药物等)相互结合(例如，共价键、肽键等)并且可以以偶联物或融合蛋白(当药物是蛋白质时)的形式使用。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供编码上述单克隆抗体或其片段的核酸分子、包含上述核酸分子的载体或包含上述载体的宿主细胞。
本发明的核酸分子可以为分离的或重组的，不仅包括单链及双链形态的dna及核糖核酸(rna)，还包括对应的互补序列。在“分离的核酸”为从天然生成的源头分离的核酸的情况下，为从存在于核酸被分离的个体的基因组中的周边基因序列中分离的核酸。在从模板中通过酶或化学方法合成的核酸，例如聚合酶链式反应(pcr)产物、互补dna(cdna)分子或寡核苷酸的情况下，可以理解为通过上述过程生成的核酸被分离的核酸分子。分离的核酸分子可以表现为单独片段的形态或更大的核酸构建物的成分的核酸分子。当核酸与其他核酸序列通过功能性关系配置时，“可操作的连接”。例如，前序列或分泌前导(leader)的dna在表达为分泌多肽之前的形态的前蛋白(preprotein)的情况下，与多肽的dna可操作的连接，启动子或增强子在给多肽序列的转录带来影响的情况下，与编码序列可操作的连接，或者核糖体结合部位在为促进翻译而配置时与编码序列可操作的连接。通常，“可操作的连接”是指将要连接的dna序列进入相邻的位置，在分泌前导的情况下，是指相邻并存在于同一阅读框内。但是，增强子不需要位于相邻的位置。连接在便利的限制酶部位通过连接来实现。若没有这样的部位，可以根据常用的方法使用合成寡核苷酸适配体或接头。
在本说明书中，术语“载体”是指用于向能够复制核酸序列的细胞内导入的能够插入核酸序列的传递体。核酸序列可以为外源性(exogenous)或异种(heterologous)。载体可以为质粒、粘粒以及病毒(例如，噬菌体)，但不限定于此。本发明所属技术领域的普通技术人员可以通过标准的重组技术构建载体(maniatis，etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y.，1988；以及ausubeletal.，in：currentprotocolsinmolecularbiology，john，wiley&sons，inc，ny，1994等)。
在本说明书中，术语“表达载体”是指包含编码被转录的基因产物中的至少一部分的核酸序列的载体。在部分情况下，此后rna分子被翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体中可以包含多种调节序列。在载体及表达载体中，与调节转录及翻译的调节序列一起，还可以包含提供其他功能的核酸序列。
在本说明书中，术语“宿主细胞”包括真核生物及原核生物，是指能够进行可以复制上述载体或者可以表达通过载体编码的基因的任意转化的生物。宿主细胞可以通过上述载体转染(transfected)或转化(transformed)，这是指将外源性核酸分子传递或导入宿主细胞内的过程。
优选地，本发明的宿主细胞可以为细菌(bacteria)细胞、酵母(yeast)、人类细胞(cho细胞、hela细胞、hek293细胞、bhk-21细胞、cos7细胞、cop5细胞、a549细胞、nih3t3细胞等)，但不限定于此。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述抗体或其片段、上述核酸分子或上述载体的组合物。
根据本发明的优选实例，本发明的组合物为用于治疗或预防癌症的药剂学组合物。
本发明的药剂学组合物可包含：(a)上述单克隆抗体或其片段、上述核酸分子或包含上述核酸分子的载体；以及(b)药学上可接受的载体。
本发明的又一实施方式，本发明提供包括施用上述药剂学组合物的步骤的预防或治疗癌症的方法。
本发明所要预防或治疗的癌症的种类不受限制，优选地可以通过施用治疗包括白血病(leukemias)及急性淋巴细胞白血病(acutelymphocyticleukemia)、急性非淋巴细胞白血病(acutenonlymphocyticleukemias)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia)、慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenousleukemia)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin'slymphomas)及多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)等之类的淋巴瘤(lymphomas)、脑肿瘤(braintumors)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、肾母细胞瘤(wilmstumor)、骨肿瘤(bonetumors)及软组织肉瘤(soft-tissuesarcomas)等之类的儿童实体瘤(childhoodsolidtumors)、肺癌(lungcancer)、乳腺癌(breastcancer)、前列腺癌(prostatecancer)、尿道癌(urinarycancers)、子宫癌(uterinecancers)、口腔癌(oralcancers)、胰腺癌(pancreaticcancer)、黑色素瘤(melanoma)及其他皮肤癌(skincancers)、胃癌(stomachcancer)、结肠癌(coloncancer)、卵巢癌(ovariancancer)、脑肿瘤(braintumors)、肝癌(livercancer)、喉癌(laryngealcancer)、甲状腺癌(thyroidcancer)、食管癌(esophagealcancer)及睾丸癌(testicularcancer)等多种癌症，更优选地通过施用治疗β1整合素果表达的癌细胞引起的癌症。
本发明的药剂学组合物包含的药剂学上可接受的载体包括制剂时通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。除上述成分外，本发明的药剂学组合物还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。适当的药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。
本发明的药剂学组合物可经口服或胃肠外给药的方式给药，优选地，可胃肠外给药，例如通过静脉内注入、局部注入及腹腔注入等方式给药。
本发明的药剂学组合物的适当给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性之类的因素而多种多样，具有普通熟练度的医生可以轻松决定及处方对预期治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物一日给药量为0.0001-100mg/kg。
本发明的药剂学组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员易于实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来制剂化，可以制备为单位剂量形态或者放入多剂量容器内来制备。在此情况下，剂型可以为以油或水性媒介中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以为提取剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以包含分散剂或稳定剂。
本发明的药剂学组合物可以作为单独的疗法来使用，也可以与其他常规的细胞毒性化学疗法(cytotoxicchemtherapy)或放射疗法一同使用，在利用这样的联合疗法的情况下，可以更为有效地治疗癌症。尤其，已知β1整合素在各种癌症中引起对细胞毒性化学疗法的抗性(parkcc等人，cancerres，2006，66(3)：1526-35)，因此可以在上述细胞毒性化学疗法具有抗性的癌症的治疗中获得显著结果。
可以与本发明的组合物一同使用的细胞毒性化学疗法制剂包括吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、达克替尼(dacomintinib)、卡努替尼(canertinib)、来那替尼(neratinib)、埃克替尼(icotinib)、佩利替尼(pelitinib)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、甲基苄肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、双硫丹(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosourea)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、thp-阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、系列霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、转铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、长春新碱(vincristin)、长春花素(vinblastin)以及甲氨蝶呤(methotrexate)等。
能够与本发明的组合物一同使用的放射疗法由x射线照射及γ射线照射等。
本发明的又一实施方式，本发明提供样品中包含的β1整合素的定量方法，其中，包括如下步骤：处理单克隆抗体或其片段。
本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述单克隆抗体或其片段的β1整合素定量试剂盒。
本发明的单克隆抗体或其片段与β1整合素特异性结合，因此利用其能够正确测定样品中包含的β1整合素的量。
利用本发明的定量方法和/或试剂盒，可以通过抗原抗体结合反应来分析对上述抗体的抗原，从而可以定量β1整合素的量，优选地，上述抗原抗体结合反应选自由常规的酶联免疫吸附测定(elisa，enzyme-linkedimmunosorbentassay)、放射免疫分析(ria，radioimmnoassay)、夹心法(sandwichassay)、聚丙烯酰胺凝胶相的蛋白印迹法(westernblot)、免疫印迹分析(immunoblotassay)以及免疫组织化学染色方法(immnohistochemicalstaining)组成的组中，但不限定于此。
用于抗原-抗体结合反应的固定体可以使用选自由硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯(pvdf)膜、聚乙烯(polyvinyl)树脂或由聚苯乙烯(polystyrene)树脂合成的孔板(wellplate)及由玻璃制成的载玻片(slideglass)组成的组中的固定体，但不限定于此。
优选地，上述二抗使用发生显色反应的普通的显色剂标记，可以使用选自由辣根过氧化物酶(hrp，horseradishperoxidase)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、胶体金(coloidgold)、异硫氰酸荧光素(fitc，聚l-赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯(polyl-lysine-fluoresceinisothiocyanate))、罗丹明-b-异硫氰酸酯(ritc，rhodamine-b-isothiocyanate)等荧光物质(fluorescein)及色素组成的组中的任意标记体。优选地，诱导显色的基质根据标记体来使用，优选地，使用选自3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb，3，3'，5，5'-tetramethylbezidine)、2，2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts，2，2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid))以及邻苯二胺(opd，ophenylenediamine)组成的组中的一种，但不限定于此。
本发明的又一实施方式，提供一种提供用于诊断由β1整合素过表达引起的疾病的信息的方法，其中，包括如下步骤：
步骤(a)，从受试者获得体外分离的样品；
步骤(b)，使用上述单克隆抗体或其片段处理上述样品；以及
步骤(c)，确认上述受试者的样品中包含的β1整合素的表达量是否高于正常组样品中包含的β1整合素的表达量。
关于提供用于诊断由上述β1整合素过表达引起的疾病的信息的方法的描述中，与本发明的定量方法和/或试剂盒的描述相同的部分参考上述上面内容。
然而β1整合素的异常表达会影响肿瘤抑制和进展，β1整合素的增加可促进肿瘤细胞存活并赋予几种肿瘤细胞类型对化疗的抗性(hodkinsonps，elliottt，wongws，etal.ecmoverridesdnadamage-inducedcellcyclearrestandapoptosisinsmall-celllungcancercellsthroughbeta1integrin-dependentactivationofpi3-kinase[j].celldeathdiffer，2006；13(10)：1776-1788.；aoudjitf，vuorik.integrinsignalinginhibitspaclitaxel-inducedapoptosisinbreastcancercells[j].oncogene，2001；20(36)：4995-5004.；morozevichge，kozlovani，preobrazhenskayame，etal.theroleofbeta1integrinsubfamilyinanchorage-dependentapoptosisofbreastcarcinomacellsdifferinginmultidrugresistance[j].biochemistry(mosc)，2006；71(5)：489-495.)，可以通过比较上述β1整合素的表达量和正常人的表达量，来提供用于诊断由β1整合素过表达引起的疾病的信息。
根据本发明的优选实例，由上述β1整合素的过表达引起的疾病为癌症。
发明的效果
概要本发明的特征及优点如下：
(i)本发明提供将β1整合素识别为抗原并与其特异性结合的单克隆抗体或其片段。
(ii)并且，本发明提供包含上述单克隆抗体或其片段的用于预防或治疗癌症的药剂学组合物。
(iii)本发明的单克隆抗体通过抑制癌细胞的增殖和血管生成并有效诱导细胞凋亡，可有效地用于预防或治疗癌症。
附图说明
图1示出本发明的gp5单克隆抗体的重链可变区以及轻链可变区的氨基酸序列。
图2a、图2b是确认本发明的gp5单克隆抗体的纯度(图2a)以及均质性(图2b)的结果。
图3a、图3b、图3c是示出针对本发明的gp5单克隆抗体的重组人β1整合素的结合力(图3a)、针对重组小鼠β1整合素的结合力(图3b)以及针对β1整合素的特异性(图3c)的结果。
图4是在非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116的表面确认β1整合素的表达的结果。
图5a、图5b、图5c是本发明的gp5单克隆抗体的细胞凋亡能力(图5a)，细胞生长抑制能力(图5b)以及gp5单克隆抗体抑制的信号转导(signalpathway)的结果。
图6a、图6b是确认本发明的gp5单克隆抗体在癌细胞表面的β1整合素的内化诱导的结果(图6a：120分钟；图6b：a549细胞株中不同时间段的确认结果)。
图7a、图7b是针对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株pc9gr联用本发明的gp5单克隆抗体和吉非替尼时，将吉非替尼的反应性提高至母细胞pc9所示水平的结果(图7a：在pc9和pc9gr的表面确认β1整合素的表达的结果；图7b：在pc9和pc9gr联用吉非替尼合gp5单克隆抗体时诱导的细胞凋亡能力的程度的结果)。图8a、图8b是本发明的gp5抗体在非小细胞肺癌细胞株移植小鼠模型中的抗癌活性结果(图8a：肿瘤体积比较；图8b：肿瘤大小比较)。
图9a、图9b、图9c是测定本发明的gp5抗体的肿瘤细胞增殖抑制能力(图9a)、肿瘤内新生血管形成抑制能力(图9b)以及肿瘤的细胞凋亡诱导能力(图9c)的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明了的是，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1.p5的癌细胞杀伤能力改良以及人源化
为了开发与p5(kimmy等人.jbiomedres，2016，30(3)：217-24)相比癌细胞杀伤能力提高的人源化抗体，本发明人进行了如下实验。
为了改良p5，以如下方式在重链可变区的4个fr(hfr1，hfr2，hfr3，hfr4)和轻链可变区的4个fr(lfr1，lfr2，lfr3，lfr4)引入突变。
1)具体地，hfr1利用ighv7-4-1*03，hfr2利用ighv4-30-4*06，hfr3利用ighv1-69-2*01，hfr4利用ighj6*01的序列，考虑氨基酸的物理化学性质的相似性及不同性，将亲本抗体与其他氨基酸置换。通过这种方法置换的氨基酸，ighv7-4-1*03中是i20v、t25s、s30t；ighv4-30-4*06中是r40h、h43k；ighv1-69-2*01中是k66r、a67v、f69i、s75t、n76d、s79y、q81e、t83r、s87t；以及ighj6*01中是s108t。针对由此置换的重链可变区，再次利用ighv1-2*02进行比对(alignment)后，筛选预期具有优异性能的突变。
2)并且，lfr1利用igkv2-18*01，lfr2利用igkv2-18*01，lfr3利用igkv2-28*01，lfr4利用igkj2*01，进行如下氨基酸置换。igkv2-18*01中是a8p、v11l、t14n、s18p、v19a；igkv2-18*01中是r39k；igkv2-28*01中不存在；igkj2*01中是l106i。针对由此置换的轻链可变区，再次利用igkv2d-29*02进行比对(alignment)后，筛选预期具有优异性能的突变。
3)通过如上所述的过程筛选的突变位置如下：
①重链可变区：a9s、i20v、t25s、s30t、k66r、s75t、n76d、q81e。
②轻链可变区：v11l、f36y、r39k。
(抗体结构域的氨基酸残基编号根据本领域常用的卡巴特eu编号系统(kabateunumberingsystem，kabat等人.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91-3242，1991所述的eu指数编号)编号。
人源化重链可变区与人类igg1重链恒定区(ch1、ch2、ch3)相结合，人源化轻链可变区与人类轻链恒定区(ckappa)相结合，最终完成人源化。
将最终人源化的抗体命名为gp5，其碱基序列如表1所示，置换的碱基序列相关内容如图1所示。
表1
p5和gp5重链及轻链可变区氨基酸序列
上述表中，粗体表示氨基酸置换位置(根据卡巴特eu编号系统的a9s、i20v、t25s、s30t、k66r、s75t、n76d、q81e、v11l、f36y，r39k)
实施例2.gp5克隆的完全抗体转换以及表达/纯化
将实施例1中开发的gp5可变区的dna合成为scfv形式(cosmogenetech，韩国)，利用pcr方法转换为完全抗体(fulligg)。首先，从包括scfv的puc载体(cosmogenetech，韩国)，利用以下表2的vh、ch以及vl、ck引物组合，通过pcr获取重链以及轻链的可变区和恒定区的切片。针对获取的抗体的可变区和恒定区，利用以下表2的hc以及lc引物组合进行pcr，获得gp5的重链和轻链。使用ecorⅰ和notⅰ(newenglandbiolab，英国)酶处理重链，并将其连接到经过相同限制酶处理的pcmv载体(thermofisherscientific，美国)，其是动物细胞表达用载体。并且，使用xbaⅰ(newenglandbiolab，英国)酶处理轻链，并将其连接到经过相同限制酶处理的pcmv载体。将连接好的质粒热激转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞(newenglandbiolab，英国)，获得菌落，然后大规模培养获得质粒。
表2
gp5完全抗体克隆时所使用的引物列表
使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)(polysciences，美国)和150mmnacl，将转化为完全抗体的重链和轻链质粒转染到hek293f细胞(invitrogen，美国)中，并在37℃的温度、8％co2和55％湿度下，在freestyle293表达培养基(invitrogen，美国)培养7天。将表达的细胞培养液以4000rpm离心10分钟后，取上清液并通过0.22μm过滤器过滤。在4℃下诱导过滤的上清液与1ml蛋白a(genscript，中国)树脂结合。结合的树脂用10cv(柱体积)磷酸盐缓冲(pbs)溶液洗涤，用100mm甘氨酸-hcl(ph2.7)洗脱，并用1m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)(ph9.0)中和。用ph7.2～7.4的pbs更换缓冲液后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认纯化抗体的轻链和重链的大小和纯度，结果如图2a所示。纯化的gp5单克隆抗体中能够确认到与轻链和重链的理论计算值一致的分子量和高纯度。另外，通过尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography，sec)(gehealthcare，美国)确认纯化抗体的均质性(homogeneity)，结果显示95％的均质性(homogeneity)，结果如图2b所示。
实施例3.分析gp5单克隆抗体对β1整合素的结合力
直接elisa法确认上述实施例2中制备的gp5单克隆抗体对β1整合素的结合力。由于gp5单克隆抗体是人源化抗体，而p5是小鼠抗体，因此使用过氧化物酶标记试剂盒(peroxidaselabeling)-nh2(dojindo，日本)用hrp标记每个抗体，以直接比较结合力。直接elisa中，在50μlpbs中以1μg/ml稀释重组人β1整合素(sinobio，中国)和重组小鼠β1整合素(recombinantmousebeta1integrin)(mybiosource，美国)，并置于96孔免疫板(corning，美国)，在4℃储存过夜吸附。在37℃下与含有3％牛血清白蛋白(milipore，美国)的缓冲液反应1小时后，稀释至连续浓度(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、100、300、1000nm)每个hrp-标记的抗体，以每孔50μl处理。在37℃反应2小时，使抗体与抗原结合后，用含有0.5％tween20(amresco，美国)的缓冲液洗涤3次，然后用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3’，5，5'-tetramethylbenzidine，tmb)(lifetechnologies，美国)按50μl分配到每个孔中，并使其显色30分钟。使用分光光度计(biotek，美国)在450nm处测量吸光度，结果如图3a和图3b所示。
结果，确认到本发明中开发的gp5单克隆抗体对重组人β1整合素以及重组小鼠β1整合素表现出与p5等同水平的优异的结合力(图3a以及图3b)。
并且，为了确认gp5单克隆抗体对β1整合素的特异性，通过直接elisa确认对各种整合素的结合力。在50μlpbs中以1μg/ml稀释重组人αvβ1整合素(r&dsystems，美国)、αvβ3整合素(r&dsystems，美国)、αvβ5(r&dsystems，美国)、αvβ6(r&dsystems，美国)、αvβ8(r&dsystems，美国)、α5β1(r&dsystems，美国)和α2bβ3(r&dsystems，美国)，并置于96孔免疫板(corning，美国)，在4℃储存过夜吸附。在37℃下与含有3％牛血清白蛋白(milipore，美国)的缓冲液反应1小时后，稀释至连续浓度(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、100、300、1000nm)每个hrp-标记的抗体，以每孔50μl处理。在37℃反应2小时，使抗体与抗原结合后，用含有0.5％tween20(amresco，美国)的缓冲液洗涤3次，然后针对用pbs以1:3000比例稀释的hrp-标记的抗人fcigg，用二抗以每孔50μl处理。在37℃反应1小时，用含有0.5％tween20(amresco，美国)的缓冲液洗涤3次，然后用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3’，5，5'-tetramethylbenzidine，tmb)(lifetechnologies，美国)按50μl分配到每个孔中，并使其显色30分钟。使用分光光度计(biotek，美国)在450nm处测量吸光度，结果如图3c所示。
结果，本发明开发的gp5单克隆抗体与整合素的α链无关，仅与β链为β1的整合无特异性结合(图3c)。
如上所述，通过上述方法改良的gp5单克隆抗体没有表现出在常规抗体人源化过程中发生的结合力下降，并且表现出对β1整合素的特异性。因此，与亲本抗体一样，可以期待抗体在治疗包括非小细胞肺癌的各种癌症方面的性能。
实施例4.确认包括非小细胞肺癌的各种癌细胞株中β1整合素的表达
本发明人为了确认包括非小细胞肺癌的各种癌细胞株中β1整合素的表达，进行了如下实验。
将每个样品的5×105个非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116，悬浮在含有或不含gp5单克隆抗体的pbs中，浓度为10μg/ml，并在4℃培养1小时。培养液以3500rpm离心5分钟，用200μlpbs洗涤，再次以3000rpm离心5分钟。用经过pbs以1:200的比例稀释的山羊抗人igg抗体(goatanti-humaniggantibody)，alexafluor488(thermofisherscientific，美国)处理细胞，并在4℃、遮光条件下培养30分钟。将荧光染色的细胞用pbs洗涤后悬浮于500μlpbs中，使用facs分析设备attunenxt(thermofisherscientific，美国)进行分析，结果如图4所示。
通过facs评估结果，确认到β1整合素在非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116的细胞表面过表达(图4)。
实施例5.分析gp5单克隆抗体的癌细胞株中细胞凋亡、细胞生长抑制能力以及抗癌作用机制
本发明人为了确认p5与本发明的gp5单克隆抗体在β1整合素表达的包括非小细胞肺癌的各种癌细胞株中是否能够诱导细胞凋亡，进行了如下实验。
首先，实验前一天将非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116，以1ml接种到24孔板的含10％牛血清(gibco，美国)的rpmi培养基(welgene，韩国)中，每孔5×104个，并在37℃、5％co2条件下培养过夜。
次日，除去培养基，在rpmi培养基(welgene，韩国)中将p5和gp5单克隆抗体分别处理至10或20μg/ml，然后在37℃、5％co2条件下反应48小时。仅用新鲜的rpmi培养基(welgene，韩国)填充阴性对照组。反应结束后，用pbs洗涤细胞，用0.05％胰蛋白酶(trypsin)-edta(gibco，美国)分离细胞，置于ep管中，再次用pbs洗涤。之后，在3500rpm下离心5分钟，使用annexinv-fitc/7-aad凋亡检测试剂盒(biolegend，美国)、流式细胞仪设备attunenxt(thermofisherscientific，美国)，对收集的细胞团块(cellpellet)进行流式细胞分析，结果如图5a、图5b、图5c所示。
结果，可确认到本发明的gp5单克隆抗体与p5相比具有更优异的细胞凋亡能力，非小细胞肺癌细胞株a549表现出浓度依赖性的细胞凋亡能力效果(图5a)。
并且，本发明人为了确认本发明的gp5单克隆抗体在β1整合素表达的包括非小细胞肺癌的各种癌细胞株中是否抑制细胞生长，进行了如下实验。
首先，实验前一天将非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116，以1ml接种到12孔板的含10％牛血清(gibco，美国)的rpmi培养基(welgene，韩国)中，每孔1×105个，并在37℃、5％co2条件下培养过夜。
次日，除去培养基，在rpmi培养基(welgene，韩国)中将gp5单克隆抗体分别处理至10、20或50μg/ml，然后在37℃、5％co2条件下反应48小时。仅用新鲜的rpmi培养基(welgene，韩国)填充阴性对照组。反应结束后，除去培养基，用pbs洗涤，每孔加入200μl4％多聚甲醛(paraformaldehyde)(biosesang，韩国)，4℃温度下反应10分钟固定细胞。固定后的细胞用pbs洗涤，每孔加入300μl0.5％晶紫(cyrstalviolet)(sigma，美国)处理，然后在定轨振荡器中反应30分钟。之后，用三次蒸馏水洗涤至洗涤液中不出现紫色，然后干燥。通过在干燥板上处理每孔300μl的1％十二烷基硫酸钠(amresco，美国)来裂解细胞。使用分光光度计(biotek，美国)在570nm处测量吸光度，结果示于图5b中。
结果，确认到本发明的gp5单克隆抗体具有优异的细胞生长抑制能力，非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116表现出浓度依赖性的细胞生长抑制能力效果(图5b)。
并且，本发明人为了确认gp5单克隆抗体的抗癌机制，进行了如下实验。
已知β1整合素可激活akt通路和erk通路，这两种通路与癌细胞的存活和生长有关(blandinaf，rennerg，lehmannm，etal.β1integrinastherapeutictargetstodisrupthallmarksofcancer.frontpharmacol，2015；6：279.)，通过免疫印迹分析确认了gp5单克隆抗体对β1整合素诱导的信号通路的抑制能力。首先，20μg/mlgp5单克隆抗体处理48小时或得到未处理的a549细胞沉淀团块，然后根据文献(leems，leejc，choicy等人.productionandcharacterizationofmonoclonalantibodytobotulinumneurotoxintypeblightchainbyphagedisplay.hybridoma(larchmt)，2008；27(1)：18-24)中所记载的过程进行了免疫印迹。此时，使用akt、pakt、erk、perk(1:1000稀释；cellsignalingtechnology，美国)和β-actin(1:3000稀释；santacruzbiotechnology)抗体作为一抗，hrp-标记的抗兔igg(1:5000稀释；abcam，英国)或hrp-标记的抗小鼠igg(1:5000稀释；abcam，英国)作为二抗。根据制造商的说明，使用增强的化学发光系统(thermofisherscientific，美国)使印迹可视化，结果显示在图5c中。如图5c所示，用gp5单克隆抗体处理的a549细胞中，pakt和perk的表达显着降低。
结果，本发明的gp5单克隆抗体通过抑制与β1整合素激活的癌细胞的存活和生长相关的akt通路和erk通路，可以表现出凋亡作用和细胞生长抑制作用。
因此，由上述结果可知，本发明的gp5单克隆抗体对包括非小细胞肺癌的各种癌症具有治疗作用，且gp5单克隆抗体的细胞凋亡效果优于p5，这表示已实现有效改良。
实施例6.分析gp5单克隆抗体的癌细胞中β1整合素的内化(internalization)
本发明人为了确认本发明的p5和gp5单克隆抗体在包括非小细胞肺癌的各种癌细胞株中诱导β1整合素内化的作用，进行了如下实验。用0.05％胰蛋白酶-edta(gibco，美国)处理，从t75烧瓶(flask)(spl，韩国)中分离非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231以及大肠癌细胞株hct116，并以5×105个置于ep管。3500rpm离心5分钟后，用pbs洗涤。此后，使用pbs将p5或gp5单克隆抗体稀释至10μg/ml，然后处理100μl。在4℃下反应1小时后，使非小细胞肺癌细胞株a549在37℃分别继续反应0、40、60、80、90、120、150分钟，使乳腺癌细胞株mda-mb-231和大肠癌细胞株hct116继续反应120分钟。反应结束后，用pbs洗涤，用p5处理的ep管中，在pbs以1:100的比例稀释fitc-标记的抗小鼠抗体(sigma，美国)并用100μl处理，然后用gp5单克隆抗体处理的ep管中，在pbs以1:200的比例稀释fitc-标记的抗人抗体(lifetechnologies，美国)并用100ul处理。遮光30分钟，4℃下反应后，用pbs洗涤，流式细胞仪attunenxt(thermofisherscientific，美国)进行流式细胞分析，结果如图6所示。图6a为非小细胞肺癌细胞株a549、乳腺癌细胞株mda-mb-231和大肠癌细胞株hct116在37℃反应120分钟的结果，图6b为以图表显示非小细胞肺癌细胞株a549在37℃反应的按照不同时间段的结果。结果，与经p5处理的a549、mda-mb-231和hct116细胞相比，经gp5单克隆抗体处理的a549、mda-mb-231和hct116细胞表面的β1整合素显着减少(图6)。
这意味着gp5单克隆抗体与β1整合素的结合会诱导细胞膜中的β1整合素内化。并且，这些结果表明，除了非小细胞肺癌细胞外，gp5单克隆抗体还可以通过与β1整合素过表达的细胞结合而被内化。gp5单克隆抗体与p5相比优异的抗癌活性可以通过这种内化作用来解释，这是根据本发明的改良效果。
实施例7.分析gp5单克隆抗体的吉非替尼(gefitinib)耐药性细胞株中细胞凋亡
由于β1整合素是各种癌症中对细胞毒性化疗产生抗性的原因(parkcc等人.cancerres，2006，66(3)：1526-35)，本发明人为了确认对细胞毒性化疗中所使用的吉非替尼具有耐性的非小细胞肺癌细胞株中，gp5单克隆抗体单独使用或与吉非替尼联合使用时，诱导细胞凋亡的程度，进行了如下实验。
首先，为了确认吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株pc9gr和母细胞非小细胞肺癌细胞株pc9的β1整合素的表达，按照与实施例4相同的方式进行了实验。
facs评估结果，与母细胞非小细胞肺癌细胞株pc9相比，在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株pc9gr中，gp5单克隆抗体与β1整合素结合而出现的峰更向右移动。因此，母细胞pc9相比，β1整合素在pc9gr中的表达更多(图7a)。
为了确认在pc9细胞株和pc9gr细胞株中单独使用gp5单克隆抗体或与吉非替尼联合使用时的细胞凋亡诱导能力，实验前一天将pc9细胞株以及pc9gr细胞株，以1ml接种到12孔板的含10％牛血清(gibco，美国)的rpmi培养基(welgene，韩国)中，每孔1×105个，并在37℃、5％co2条件下培养过夜。
次日，除去培养基，在rpmi培养基(welgene，韩国)中将吉非替尼(sigma，美国)以及gp5单克隆抗体分别处理至2μg/ml或20μg/ml，然后在37℃、5％co2条件下反应24小时。仅用新鲜的rpmi培养基(welgene，韩国)填充阴性对照组。反应结束后，用pbs洗涤细胞，用0.05％胰蛋白酶-edta(gibco，美国)分离细胞，置于ep管中，再次用pbs洗涤。之后，在3500rpm下离心5分钟，使用annexinv-fitc/7-aad凋亡检测试剂盒(biolegend，美国)、流式细胞仪设备attunenxt(thermofisherscientific，美国)，对收集的细胞团块进行流式细胞分析，结果如图7b所示。如图7b所示，母细胞pc9中，吉非替尼引起的细胞凋亡为50％以上，而pc9gr中为约30％。并且，当gp5单克隆抗体与吉非替尼联合用于pc9gr时，细胞凋亡约为50％。
结果，确认到与母细胞pc9相比，吉非替尼耐药的细胞株pc9gr中吉非替尼的反应性下降，当联合使用吉非替尼和gp5单克隆抗体时，pc9gr中下降的吉非替尼的反应性恢复至pc9细胞株水平(图7b)。
这些结果意味着本发明的gp5单克隆抗体可以通过阻断引起抗癌药物耐药性的β1整合素来抑制对抗癌药物的耐药性，β1整合素是抗癌药物耐药性的原因。
实施例8.分析非小细胞肺癌细胞株a549异种移植模型(humana549non-smallcelllungcancerxenograftmodel)中gp5单克隆抗体抗癌活性
本发明人为了确认本发明的gp5单克隆抗体在非小细胞肺癌细胞株移植裸鼠体内是否具有抗癌活性，进行了如下实验。
将非小细胞肺癌细胞株a549以5×106个/只接种于雌性balb/c裸鼠(slc，日本)的侧腹。小鼠每周称重两次，用“宽×宽×长/2”公式计算肿瘤体积。当癌细胞接种7天后肿瘤体积达到约80mm3时，每组随机选出6只小鼠。每组以pbs(阴性对照组)、1mg/kgp5或gp5单克隆抗体和2.5mg/kg顺铂(sigma，美国)的剂量，每周两次给药至小鼠的腹膜内，持续5周。在联合治疗组中，每周两次给药1mg/kgp5或gp5单克隆抗体和2.5mg/kg顺铂(sigma，美国)，持续5周。之后，连续3周不施用抗体和顺铂并每周两次测量肿瘤大小和重量。计算每次给药引起的肿瘤体积，结果如图8a所示(箭头(↓)：给药时刻，*：阴性对照组和学生试验比较结果，p<0.05，***：阴性比较结果对照组和学生试验比较结果，p<0.001)。另外，实施例9处死小鼠后，切除的癌组织照片如图8b所示。
如图8a和图8b所示，可以确认到本发明的gp5单克隆抗体单独给药时与p5相比具有更优异的抗癌活性，并且与作为传统的非小细胞肺癌的治疗药物的-顺铂相比也表现出更优异的抗癌活性。并且，还可确认到当gp5单克隆抗体和顺铂联合给药时，抗癌活性进一步优于单独给药的情况，即使停止给药，肿瘤体积也没有增加。因此，确认gp5单克隆抗体单独或联合给药时的抗癌效果高于单独给药p5和顺铂的抗癌效果。
实施例9.根据免疫组织化学染色(immunohistochemistry)的组织病理学研究(histopathologicalstudies)
免疫组织化学染色由韩国绿源生物融合研究财团进行，组织病理学分析由韩国sg医疗公司进行。在实验结束时间点(第60天)，处死所有小鼠，以进行组织处理、免疫组织化学染色和组织学分析。实验动物在深度麻醉下剖腹，心脏采血，切除组织，将切除的组织用4％甲醛溶液固定，石蜡包埋。从肿瘤最大部位以4μm厚度切下组织切片，去除石蜡后复水。为了进行免疫过氧化物酶标记，而通过暴露于0.3％h2o215分钟来抑制细胞内过氧化物酶。然后，为了抗原修复，而将其置于抗原修复溶液(teph9.0)(sigma，美国)中并在压力锅(biosb，美国)中加热30分钟。将其暴露于封闭溶液中20分钟，以排除非特异性免疫反应。
为了评估肿瘤细胞增殖(proliferation)的程度，使用针对人ki67的兔一抗(abcam，uk)，对ki67进行免疫组织化学染色。在用封闭液处理过的组织切片上，使稀释的一抗在室温下反应1小时，形成抗原抗体反应复合物。使用envision system-hrp-标记的聚合物抗兔(dako，美国)将hrp-标记的二抗与抗原-抗体反应复合物结合后，使用液体(liquid)dab 底物显色系统(substratechromogensystem)(dako，美国)处理3，3’二氨基联苯胺(3，3’diaminobenzidine，dab)用作显色底物。苏木精(hematoxylin)(sigma，美国)染色作为dab染色的对照染色。使用ix71光学显微镜(日本奥林巴斯)观察图像。ki67染色部位的比例使用imagej软件(nih，美国)计算，结果如图9a所示(*：通过student’st检验与阴性对照组进行比较的结果，p<0.05，***：通过student’st检验与阴性对照组进行比较的结果，p<0.001)。
为了评估肿瘤血管的变化，使用针对小鼠cd31的兔一抗(abcam，uk)，对cd31进行免疫组织化学染色。免疫组织化学染色以与上述ki67染色相同的方式进行。使用ix71光学显微镜(日本奥林巴斯)观察图像。cd31染色部位的比例用imagej软件(nih，美国)计算，结果如图9b所示(*：通过student’st检验与阴性对照组进行比较的结果，p<0.05，***：通过student’st检验与阴性对照组进行比较的结果，p<0.001)。
为了评估肿瘤细胞凋亡的程度，使用apoptag过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒(chemicon，美国)进行末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)dutp缺口末端标记(nick-endlabeling)(tunel)染色。使用使用液体dab 底物显色系统(dako，美国)进行显色。苏木精染色作为dab染色的对照染色。使用ix71光学显微镜(日本奥林巴斯)观察图像。使用imagej软件(nih，美国)计算凋亡位点比例，结果如图9c所示(*：通过student’st检验与阴性对照组进行比较的结果，p<0.05)。
免疫化学组织学的结果显示，ki67和cd31的表达在阴性对照组中最高(图9a和图9b)，并且几乎没有观察到tunel染色的细胞(图9c)。这意味着在阴性对照组中积极进行癌细胞增殖和新血管生成。ki67和cd31在gp5单克隆抗体单独组中的表达低于p5单克隆抗体单独给药组(图9a和图9b)，并且观察到更多tunel染色的细胞(图9c)。这意味着与p5相比，gp5单克隆抗体具有更大的抑制癌细胞增殖和血管生成以及诱导细胞凋亡的作用。此外，确认到当gp5单克隆抗体和顺铂联合给药时这些效果比单独给药时更大(图9a、图9b和图9c)。这意味着gp5单克隆抗体通过抑制癌细胞增殖、抑制血管生成和诱导细胞凋亡而表现出抗癌效果。此外，通过与顺铂的联用而增加的抗癌活性意味着这种效果最大化。
以上，详细记述了本发明的特定部分，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，上述具体记述只不过是优选实例，本发明的范围不受其限制。因此，本发明实质上的范围应由随附的发明要求保护范围及其等同物定义。
<110>sg医疗株式会社
<120>抗β1整合素人源化抗体以及包含其的用于治疗癌症的药学组合物
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