一个新的甘油单-二酰酯脂肪酶的制作方法

一个新的甘油单-二酰酯脂肪酶
发明领域
1.本申请属于酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。
2.发明背景
3.脂肪酶是酯酶的一种，可以催甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯键的水解，脂肪为脂肪酶的天然底物，水解的过程中会产生甘油二酯和甘油单酯，水解最终产物为甘油和脂肪酸。脂肪酶水解条件温和，副产物少，不需要辅酶。脂肪多为疏水物质，因此水解反应发生在油水界面或者有机相中。甘油单-二酰酯脂肪酶(mdgl)是脂肪酶的一种，mdgl具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(mag)和甘油二酰酯(dag)，对甘油三酰酯(tag)不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。
4.yamaguchi等首先利用卡门柏干酪青霉获得了mdgl，mdgl有2种形态，分子量分别为37kda和39kda，mdgl有26个氨基酸组成的信号肽，成熟肽包含279个氨基酸。yamaguchi等以月桂酸乙烯酯为底物测定卡门柏干酪青霉来源的mdgl酶活单位，经培养基过滤、乙醇纯化、硫酸铵沉淀、deae琼脂糖凝胶过滤、纤维素膜纯化和离子交换等纯化步骤后，mdgl的比酶活为6680u/mg。mdgl由mdla编码，mdla已经在毕赤酵母中获得表达。
5.mag是一种优良的乳化剂，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的应用。mag的传统合成工艺是在高温下，以无机碱为催化剂，在氮气条件下通过油脂/甘油三酯与甘油连续酯化进行生产，产物为mag、dag和tag的混合物，通过蒸馏获得mag，mag的产率为40-50％。与传统合成工艺不同，酶法合成mag是以脂肪酸和甘油为底物，在温和条件下催化合成mag，酶法催化中脂肪酸的转化率超过97％，mag在产物中的占比超过74％。目前限制酶法应用的主要问题是酶的活力较低和酶的成本较高。
6.因此，本领域亟需开发出活力较高的酶。
7.发明概述
8.本发明提供了一种具有脂肪酶活性的多肽。
9.本发明的多肽包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
10.(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列，以及
11.(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，
12.其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。
13.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的多肽包含seq id no:2所示的氨基酸序列。优选地，所述多肽由seq id no:2所示的氨基酸序列组成。
14.本发明的脂肪酶活性为甘油单-二酰酯脂肪酶活性。
15.本发明还提供了编码本发明的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
16.(a)核苷酸序列，其编码如权利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及
17.(b)在严格条件下与(a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
18.在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供的多核苷酸包含seq id no:1所示的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方案中，所述多核苷酸由seq id no:1所示的核苷酸序列组成。
19.本发明还提供了表达载体，其包含至少一种前述的多核苷酸。
20.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的表达载体还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。
21.本发明还提供宿主细胞，其包含前述的多核苷酸、或者表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞为酵母。
22.本发明还提供了前述多肽用于甘油单酯和/或甘油二酯的水解和/或合成的用途。
23.本发明还提供了一种水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯的方法。本发明提供的方法为使用前述多肽催化，或使用前述的宿主细胞的发酵液或上清液或浓缩液催化。
24.在本发明的一个具体实施方案中，所述催化的底物为对硝基苯酚棕榈酸酯(pnpp)。
25.附图简要说明
26.图1显示了菌株的三角瓶发酵的蛋白产量结果，其中，cm1为ctlmc生产菌株1，cm2为ctlmc生产菌株2，cm3为ctlmc生产菌株3。
27.图2显示了ctlmc三角瓶发酵蛋白pnpp水解活力结果，其中，cm1为ctlmc生产菌株1产酶，cm2为ctlmc生产菌株2产酶，cm3为ctlmc生产菌株3产酶。
28.图3显示了ctlmc甘油单、二油酸酯水解产物tlc分析结果，其中，1为油酸标准品；2为1-单油酸甘油酯标准品；3为2-单油酸甘油酯标准品；4为空白样；5为1,3-二油酸甘油酯标准品；6为油精标准品；7为单油酸甘油酯cm1水解产物；8为单油酸甘油酯未水解；9为二油酸甘油酯cm1水解产物；10为二油酸甘油酯未水解。
具体实施方式
29.本申请的多肽
30.本申请提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
31.(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列，以及
32.(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。
33.本发明的脂肪酶活性为甘油单-二酰酯脂肪酶活性。
34.在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个，其中获得的多肽变体基本上保持未改变的蛋白的脂肪酶活性。
35.在优选的实施方案中，上述多肽变体与seq id no:2所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，上述多肽变体与seq id no:2所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。
36.在一些实施方案中，上述多肽由seq id no:2所示的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，所述多肽由seq id no:2所示的氨基酸序列组成。
37.在一些实施方案中，在所述多肽的氨基酸序列中发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸的保守性取代。进行保守性取代后的多肽基本上保持原多肽的脂肪酶活性。
38.在一些实施方案中，在所述多肽的c端或n端可以缺失约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然具有脂肪酶活性。
39.在一些实施方案中，还可以在所述多肽的c端或n端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的多肽变体仍具有脂肪酶催化活性。
40.此外，还可以在所述多肽的c端或n端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的多肽基本上保持原多肽的脂肪酶活性。
41.如本文所用的，术语“氨基酸”表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20种(l)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(d)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，这些是本领域技术人员已知的。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这种修饰可以包括例如取代氨基酸上的化学基团和部分，或者氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如表现出功能上类似性质的有机结构，所述性质例如氨基酸的电荷和电荷空间特性。例如，模拟精氨酸(arg或r)的有机结构具有位于类似分子空间并且具有与天然存在的arg氨基酸的侧链的e-氨基相同程度的移动性的正电荷部分。模拟物还包括约束结构以维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳空间和电荷相互作用。本领域技术人员可以确定什么结构构成功能上等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
42.在一些实施方案中，seq id no:2所示的氨基酸序列的变体与seq id no:2具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，多肽变体与seq id no:1所示序列具有99％以上的同源性。
43.本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。
44.本申请的“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物，以及其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物。此类衍生物包括例如翻译后修饰和降解产物，包括seq id no:2所示的多肽片段的磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。
45.被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
46.本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)和亮氨酸(l)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(s)取代苏氨酸(t)，反之亦然；用天冬氨酸(d)取代谷氨酸(e)，反之亦然；用谷氨酰胺(q)取代天冬酰胺(n)，反之亦然；用赖氨酸(k)取代精氨酸(r)，反之亦然；用苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(m)取代半胱
氨酸(c)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(g)和丙氨酸(a)经常可以互换，如同丙氨酸(a)和缬氨酸(v)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(m)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(k)和精氨酸(r)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pk并不明显。在特定的环境下，仍有其他一些变化可以视为“保守性”的(参见，例如，biochemistry at pp.13-15,2
nd ed.lubert stryer ed.(stanford university)；henikoff et al.,proc.nat’l acad.sci.usa0(1992)89:10915-10919；lei et al.,j.biol.chem.(1995)270(20):11882-11886)。
47.在某些实施方案中，本申请的多肽，例如seq id no:2所示多肽或其变体与异源多肽融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白基本上保持seq id no:2所示多肽的脂肪酶活性。在某些实施方案中，异源多肽与seq id no:2所示多肽的n端连接。在某些实施方案中，异源多肽与seq id no:2所示多肽的c端连接。在这些实施方案中，异源多肽可以选自纯化标签(例如可以包括但不限于：gst、mbp)、表位标签(例如可以包括但不限于：myc、flag)、靶向序列、信号肽等。在具体实施方案中，融合蛋白包含seq id no:2所示多肽和标签，所述标签与seq id no:2所示多肽的c-末端或n-末端结合，通常为肽标签。
48.本申请的多肽具有水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯的能力。
49.多核苷酸
50.本申请提供了编码本文公开的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
51.(a)核苷酸序列，其编码seq id no:2所示的氨基酸序列、或在seq id no:2中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及
52.(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
53.在某些具体的实施方案中，本申请的多核苷酸编码seq id no:2所示多肽及其功能等同变体。在一实施方案中，本申请的多核苷酸与编码seq id no:2所示多肽及其功能等同变体的多核苷酸具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。
54.在某些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与seq id no:1所示的核苷酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含seq id no:1所示的核苷酸序列。
55.在一些实施方案中，本申请的多核苷酸由与seq id no:1所示的核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列组成。在优选的实施方案中，本申请的多核苷酸由seq id no:1所示的核苷酸序列组成。
56.在具体的实施方案中，seq id no:1所示的多核苷酸编码seq id no:2所示的氨基酸序列。
57.本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mrna、rna、crna、cdna或dna，包括单链和双链形式的dna。该术语通常指至少10个碱基长度的核苷酸多聚形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。
58.在某些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与编码seq id no:2所示多肽及其功能等同变体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者由与编码seq id no:2所
示多肽及其功能等同变体的核苷酸序列特异性杂交且编码与seq id no:2所示多肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列组成。
59.本领域技术人员可以常规选择dna杂交的严格条件。通常较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性dna的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格条件的详细描述，可参阅ausubel等人，current protocols in molecular biology,wiley interscience publishers,(1995)。
60.在某些实施方案中，dna杂交采用的严格条件包括：1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/ph 6.5的50mm磷酸钠缓冲液以及750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠；或(3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5
×
ssc(0.75m氯化钠，0.075m朽1檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5
×
denhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子dna(50.mg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2
×
ssc(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，再以含有edta的0.1
×
ssc于55℃进行高严格度洗涤。中等严格条件可按sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual,newyork：cold spring harbor press,1989中的描述加以确定。中等严格条件包括采用严格度低于以上描述的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和sds百分比)。例如，中等严格条件包括用至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5m到至少约0.9m的盐在42℃杂交，以及用至少约0.1m到至少约0.2m盐在55℃洗涤。中等严格条件还可以包括用1％牛血清白蛋白(bsa)、1mm edta、0.5m nahpo4(ph7.2)、7％sds在65℃杂交，以及用(i)2
×
ssc、0.1％sds；或(ii)0.5％bsa、1mm edta、40mm nahpo4(ph47.2)、5％sds在60-65℃洗涤。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的tm)以下列顺序递减：rna:rna、dna:rna,dna:dna。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。
61.本申请公开的多核苷酸可以与其他dna序列组合，所述其他dna序列例如启动子、聚腺苷化信号、其他限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码节段等，使得它们的总长度可以显著不同。因此考虑可以利用几乎任意长度的多核苷酸片段；总长度优选地受预期重组dna方案中制备和使用的便利性的限制。
62.可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多核苷酸及其融合物。例如，编码本申请的多肽或其变体的多核苷酸序列可以用于重组dna分子中以指导多肽在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他dna序列也可以用于本申请中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。
63.此外，可以使用本领域内公知的方法改造本申请的多核苷酸序列，包括但不限于基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变。
64.在某些实施方案中，本申请的多核苷酸通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸通过重组技术产生。
65.在某些实施方案中，可以通过常规方法优选如双脱氧链终止法(sanger et al.pnas,1977,74:5463-5467)测定所获得的多核苷酸的序列。这类多核苷酸序列测定也可用购买的测序试剂盒来完成。
66.表达载体
67.本申请提供了包含本申请的多核苷酸的表达载体。
68.本申请所述的“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。本申请使用的表达载体可以是诸如ppic9k、pao815、puc57、pet-24a( )、pires2-egfp、pcdna3.1、pci-neo、pdc516、pvac、pcdna4.0、pgem-t、pdc315的质粒载体，或者是诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sfv)载体的病毒载体，或者是本领域熟知的其它载体。
69.在某些实施方案中，编码seq id no:2所示多肽及其变体的多核苷酸序列被克隆到载体中，以构成含有本申请所述多核苷酸的重组载体。
70.在优选的实施方案中，用于克隆多核苷酸的表达载体为质粒载体。在更优选的实施方案中，所述质粒载体为ppic9k或pao815。
71.在具体的实施方案中，上述表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。
72.本文所用的术语“调控序列”是指实现与其连接的编码序列表达所需的多核苷酸序列。这类调控序列的性质随宿主生物而改变。在原核生物中，这类调控序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核生物中，这类调控序列一般包括启动子、终止子以及在某些情况下的增强子。因此，术语“调控序列”包括其存在对目的基因的表达是必需的最低限度的所有序列，也可以包括其存在对目的基因表达是有利的其它序列，例如前导序列。
73.本文所用的术语“可操作地连接”是指如下情形：所涉及到的序列处于允许它们以希望的方式起作用的关系之中。因此，例如“可操作地连接”到一编码序列的调控序列使得在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。
74.在某些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建包含编码seq id no:2所示多肽及其变体的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等(sambroook,et al.molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory.new york,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性实例包括：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是dna表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。实例包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的sv40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
75.此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的
宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
76.宿主细胞
77.本申请提供了包含本文公开的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
78.在某些实施方案中，将编码seq id no:2所示多肽及其变体的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该多核苷酸或表达载体的基因工程化宿主细胞。
79.本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞等。示例性的细菌细胞包括埃希氏菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属中的任何种，包括例如大肠杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荧光假单胞菌。示例性的真菌细胞包括曲霉属的任何种。示例性的酵母细胞包括毕赤酵母属、啤酒酵母菌属、裂殖酵母属或酵母菌属中的任何种，包括毕赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的昆虫细胞包括斜纹夜蛾或果蝇中的任何种，包括果蝇s2和斜纹夜蛾sf9。示例性的动物细胞包括cho、cos或黑色素瘤或任何小鼠或人细胞系。选择合适的宿主在本领域技术人员的能力范围内。
80.在具体的实施方案中，本申请所用的宿主细胞为大肠杆菌。在优选的实施方案中，将携带本申请多核苷酸序列的表达载体转化至大肠杆菌dh5α菌株进行诱导表达。在另一具体的实施方案中，将携带本申请多核苷酸序列的表达载体转化至毕赤酵母细胞中进行表达。可用于本申请的毕赤酵母包括gs115、m314等，其适用于一般的酵母转化方法。
81.可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或ti-介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(davis,l.,dibner,m.,battey,i.,basic methods in molecular biology,(1986))。作为示例，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可在指数生长期后收获感受态细胞，用本领域熟知的电转化法进行转化。
82.在具体的实施方案中，将含有编码tl突变体的多核苷酸的重组表达载体用sali限制性内切酶酶切线性化后，采用电击法转化毕赤酵母感受态细胞，将转化物接种于mgys平板上培养。挑取转化子至bmmy-月桂酸乙烯酯筛选平板上培养，最后挑取水解圈最大的转化子进行测试。
83.具有脂肪酶活性的多肽的应用
84.本申请的多肽是具有脂肪酶活性的多肽，能够水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯。
85.水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯时，可以使用本申请的多肽，也可以使用包含本申请的多肽的混合物，例如，包括但不限于包含本申请的多肽的发酵液、发酵上清液、发酵液的浓缩液等。
86.本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
87.应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
88.上述公开内容总体上描述了本申请，通过下面的实施例进一步示例本申请。描述这些实施例仅为说明本申请，而不是限制本申请的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请的范围。
89.实施例
90.实验材料
91.1)实验菌株和质粒
92.质粒puc57：生工生物股份有限公司
93.质粒ppic9k：invitrogen
94.巴斯德毕赤酵母m316h：已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为pichia pastoris m316h，其保藏编号为cgmcc no.19221。
95.2)培养基和溶液
96.lb液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠。
97.lb平板：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠，1.7％琼脂糖。
98.选择培养基mgys筛选平板：1.34％酵母氮源碱(ynb)，18.1％山梨醇，2％甘油。
99.甘油二油酸酯平板：1.34％酵母氮源碱(ynb)，1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％琼脂糖，2％甲醇，0.5％甘油二油酸酯。
100.bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，2％甘油，4
×
10-5％d-生物素，100mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,ph 6.6。
101.bmmy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，2％甲醇，4
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10-5％d-生物素，100mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,ph 6.6。
102.pnpp反应液：3mg/ml溶于异丙醇，使用前取1ml与9ml 0.2m乙酸钠-乙酸溶液混匀，ph4.8。
103.终止液：200mm tris-hcl，5％triton-100ph 8.5。
104.3)序列
105.seq id no.:1为ctlmc成熟肽核苷酸序列。
106.seq id no.:2为ctlmc的氨基酸序列。
107.seq id no.:3为tl成熟肽核苷酸序列。
108.seq id no.:4为tl的氨基酸序列。
109.实施例1：tl突变文库构建和突变体筛选
110.根据tl的序列(序列如seq id no.:3所示，其编码序列如seq id no.:4所示)，对其c端序列i241至l269进行人工设计，设计后序列命名为ctlmc(序列如seq id no.:1所示，其编码序列如seq id no.:2所示)，送上海生工生物工程有限公司进行全基因合成并酶切连接到质粒puc57的avrii和ecori酶切位点处，得到puc57-ctlmc。
111.使用neb公司的avrii和ecori酶切质粒puc57-ctlmc，同时用avrii和ecori酶切质粒酶切带有诱导型启动子paox1和酵母α-交配因子的商品化质粒ppic9k，然后使用axygen公司的凝胶回收试剂盒纯化。使用fermentas公司t4 dna连接酶，按照产品说明，将ctlmc序列酶切片段和质粒酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌dh5α中，在含氨苄的lb平板上过夜培养。次日挑取单克隆在lb液体培养基中培养，使用axygen公司质粒提取试剂
盒提取质粒并送交上海生工生物有限公司测序，获得测序正确的重组表达载体。
112.实施例2：ctlmc转化巴斯德毕赤酵母和平板筛选
113.将测序正确的重组表达载体用sali限制性内切酶酶切线性化，参考巴斯德毕赤酵母操作手册(invitrogen)制备m316h感受态细胞，然后用线性化质粒电击转化巴斯德毕赤酵母m316h感受态细胞，转化子涂布到选择培养基mgys筛选平板，于28℃培养三天。挑取转化子至甘油二油酸酯平板上，28℃培养1天。
114.实施例3：产ctlmc菌株的发酵测试
115.挑取3个甘油二油酸酯平板上透明圈较大的单克隆，分别命名为cm1，cm2和cm3，并将3个菌株分别接种到50ml bmgy培养基中，28℃、200rpm，培养1天，至od600约为10，取菌体总量为300od的培养液，8000rpm离心2分钟，重悬到含50ml bmmy的250ml三角瓶中，初始菌液od600为5，于28℃、200rpm培养3天，每12h补加甲醇500ul。培养结束后收集所有菌液，8000rpm离心5分钟，取全部上清，使用10k的滤膜(购自millipore)超滤，形成酶液，用于蛋白浓度测定、酶活力测定、聚丙烯酰氨凝胶电泳分析和水解测试，使用bradford试剂(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)测定蛋白浓度，发酵液中蛋白浓度为0.20-0.45mg/ml，结果如图1所示。
116.实施例4：pnpp法检测mdgl的水解活力
117.取400ul pnpp反应液，加入5ul酶液，于37℃，1000rpm反应20分钟后，加入400ul终止液终止反应，12000rpm离心5min，取上清，测定405nm处吸光值，酶活单位检测方法如下：
118.酶活单位＝0.1935*od*v1*稀释倍数/t/v2，v1反应液体积(ml)，v2酶体积(ml)，t时间(min)；
119.经检测，ctlmc的最高酶活产量为2.0u/ml(图2)。
120.实施例5：ctlmc对甘油单、二油酸酯水解的测试
121.对ctlmc进行甘油单、二油酸酯水解测试(于eppendorf mixer上37℃1000rpm反应2h)，反应体系如表1所示。
122.表1
123.组分用量甘油单油酸酯或甘油二油酸酯10ulddh2o9ul酶液/水1ul 总体积20ul
124.反应结束后加入250ul正己烷，混匀后12000rpm离心10min，取200ul上清挥干，加入50ul正己烷溶解油样，取2ul上样到薄层层析板(默克)上。展开剂为正己烷：乙醚：乙酸乙酯：乙酸＝29:19:1:0.5，碘熏蒸约5min，其中，使用cm1的酶液的结果如图3所示(cm2和cm3的结果相似，未展示)。
125.根据图3结果，与tl只能水解甘油三油酸酯和甘油二油酸酯不同，ctlmc可以将甘油单油酸酯水解为油酸和甘油，可以将甘油二油酸酯水解为油酸和甘油，且水解甘油单油酸酯的能力强于水解甘油二油酸酯。
126.可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还
可做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。

技术特征：
1.具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。2.如权利要求1所述的多肽，其包含seq id no:2所示的氨基酸序列，优选地，所述多肽由seq id no:2所示的氨基酸序列组成。3.编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)核苷酸序列，其编码如权利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及(b)在严格条件下与(a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其包含seq id no:1所示的核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸由seq id no:1所示的核苷酸序列组成。5.表达载体，其包含至少一种权利要求3或4所述的多核苷酸。6.如权利要求5所述的表达载体，其还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。7.宿主细胞，其包含权利要求3或4所述的多核苷酸、或者权利要求5或6所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞为酵母。8.权利要求1或2所述的多肽用于甘油单酯和/或甘油二酯的水解和/或合成的用途。9.一种水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1或2所述的多肽或权利要求7所述的宿主细胞的发酵液或上清液或浓缩液催化。
技术总结
本发明提供了一种具有脂肪酶活性的多肽，本发明提供的多肽包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。本发明提供的多肽能水解和/或合成甘油单酯和/或甘油二酯。甘油二酯。甘油二酯。


技术研发人员：赵强 徐正军 牛其文
受保护的技术使用者：丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
技术研发日：2019.12.30
技术公布日：2021/7/15