间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷的制备方法与流程

专利2022-05-09  5



1.本发明属于医药技术领域,具体涉及利用间充质干细胞来源囊泡(msc-evs)包裹三氧化二砷(ato)制备复合制剂的方法。


背景技术:

2.急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,agvhd)是异基因造血干细胞移植(allo-geneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-hsct)后一种重要的并发症,是移植后导致患者死亡的主要原因之一。糖皮质激素是目前公认的agvhd一线治疗药物,但激素治疗维持长期缓解的患者不足50%,激素耐药agvhd死亡率达70%以上。因此,激素耐药agvhd成为造血干细胞移植后合并症的研究热点。近年来,msc治疗激素耐药agvhd有许多进展,其通过调节t细胞亚群增殖分化,阻断dc向t细胞提呈抗原、干扰nk细胞功能、以及归巢至损伤部位、促进组织修复等减轻agvhd。
3.细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是由细胞经旁分泌方式产生的纳米级微颗粒,主要包括外泌体、膜微粒和凋亡小体3种组分,其分子大小和产生方式略有差异。evs存在于广泛微环境,包括血液、唾液、精液、尿液、乳汁等,几乎所有细胞均可自发或经刺激后产生evs,如msc能在低氧环境下诱导产生evs。evs携带众多细胞内信息物质(如细胞生长因子、mrna、mirna、dna、脂质等)从而能参与物质交换、信息传递等功能。在临床应用中,evs既能作为药物本身,也能作为药物载体发挥作用。msc来源细胞外囊泡(msc derived evs,msc-evs)相较于msc,有诸多优势:首先,msc-evs为非细胞,无致肿瘤、致突变等安全性问题;其次,msc-evs定向将母细胞信息向特定靶细胞传递,同时其磷脂双分子层保护所包含的物质在信息传递过程中不受降解;最后,msc-evs容易制备,适合量产,便于运输。上述优势均为msc-evs在临床上广泛应用提供了可能。
4.三氧化二砷(ato)ato作为砒霜的主要成分之一,是祖国传统医学中的药物。近年来,ato逐渐被发现在自身免疫病中有一定治疗作用;因为ato既能发挥促炎作用,也能发挥抗炎作用,在不同环境调节免疫平衡。singer m等鼠模型验证ato可通过促进中性粒细胞凋亡,减轻结肠炎炎性反应;bobe pdeng研究表明ato通过促进活化的t淋巴细胞凋亡治疗小鼠sle;研究发现,ato也促进cd4 t细胞、嗜酸性粒细胞等凋亡,促进treg细胞产生,影响单核细胞和b细胞分化过程。kavian n等采用ato杀伤cd4 t细胞和浆细胞样树突状细胞(pdc),缓解鼠模型慢性gvhd(chronic gvhd,cgvhd)。


技术实现要素:

5.本发明提供了一种利用msc-evs包裹ato制备复合制剂的方法,用于干预gvhd,为其治疗提供新方法,提高ato治疗gvhd的治疗效果。
6.间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(msc-ato-evs)的制备方法,包括如下步骤:
7.1)分离、传代培养间充质干细胞(mesenchymal stem cell,msc);
8.2)加入三氧化二砷(arsenictrioxide,ato)处理msc,同时紫外线照射,使msc释放囊泡(extracellular vesicles,evs);
9.3)采用多次离心方法提取包括有ato的msc囊泡,即得到msc-ato-evs。
10.上述方法中,所述间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(msc-ato-evs)为一种复合制剂。
11.4)所述步骤1)中分离、传代培养获得msc的方法包括如下步骤:
12.a、取新鲜脐带,以生理盐水反复冲洗脐带2-3次,去除残留血液及脐带内血管,剪碎脐带组织至大小为1~2mm3;将组织铺入75cm2培养瓶内,静置15分钟,加入5ml培养基;置于培养箱内培养(37℃,5%co2,饱和湿度);
13.b、2天后向培养瓶内补充培养基3ml,7天后需更换培养基;培养12天后行显微镜下观察:组织周围有细胞爬出,且局部细胞融合度大于80%时收集组织,可对细胞进行传代培养;
14.c、传代培养:弃去瓶内原有培养基,加入15ml生理盐水,弃去洗液;加入2ml胰酶,轻轻拍打/左右摇晃,显微镜下观察,待细胞脱落后终止消化;将细胞悬液转入50ml离心管中,混匀,吸取100μl细胞悬液,行细胞计数;参考计数结果,按4000~8000个/cm2的密度接种至新的培养瓶内;置于培养箱内培养(37℃,5%co2,饱和湿度);
15.d、重悬、接种:将细胞重悬在50ml离心管中,
16.每个培养瓶种约2
×
107个msc,再加入20ml培养基(1640培养基 10%fbs配成)。
17.5)优选地,所述步骤1)中新鲜脐带为健康产妇离体24小时内的脐带。
18.6)所述步骤2)中利用ato处理msc的过程包括如下步骤:
19.a、将所述步骤1)中得到的细胞吸取至50ml离心管中,加入pbs洗涤细胞一次,加入10ml 0.05%的胰酶37度培养箱消化约1.5分钟,加入刚才置入离心管的上清终止消化,1500rpm离心5min,用5ml培养基重悬2
×
107个细胞,铺入10cm培养皿中;
20.b、将培养皿平均分为3组,每个培养皿加入3mg ato;然后加入培养基,控制培养皿中液体总体积为7-8ml;
21.c、紫外线照射诱导msc凋亡,每个培养瓶再加入5ml培养基,放入培养箱,在37℃5% co2条件下培养。
22.7)优选地,所述步骤6)中ato试剂来源为arsenic(iii)oxide(sigma,17971-10g)。
23.8)优选地,所述步骤6)中紫外线来源为生物安全柜(thermo 1300 series a2),强度为300j/m2,照射时间为90min。
24.9)优选地,所述步骤6)中照射后培养箱中培养时间为14小时,方可进行下一步离心步骤。
25.10)所述步骤3)中离心提取msc-ato-evs的方法包括如下步骤:
26.a、用移液器收集所述步骤2)的细胞至50ml离心管,500g离心10min去除细胞碎片;
27.b、取上清,14000g离心2min,除掉细胞碎片;
28.c、取上清,14000g离心60min;
29.d、将离心得到的沉淀用pbs洗一遍即得到msc-evs包裹ato的复合制剂。
30.11)优选地,所述步骤10)中所用离心机型号为eppendorf centrifuge 5810 r,转速及时间依次为500g
×
10min,14000g
×
2min,14000g
×
60min。
31.进一步,本发明所述的msc-ato-evs制备用于agvhd的干预。
32.本发明结合紫外线照射和药物处理的方式,将ato包入msc-evs中,制备成复合制剂,以期同时发挥ato和msc-evs的免疫调节作用,对gvhd进行干预,为临床治疗提供新方法。
附图说明
33.图1为本发明分离、传代培养所获得的msc的流式鉴定结果;
34.图2为本发明制备的msc-ato-evs在电镜下的照片(80000
×
);
35.图3为本发明制备的msc-ato-evs经hplc方法测定其中包含ato量的结果;
36.图4为本发明制备的msc-ato-evs应用于gvhd小鼠模型的干预结果;
37.图5为各组gvhd模型鼠行gvhd临床评分;
38.图6为各组gvhd模型鼠行总体生存率;
39.图7为各组gvhd模型鼠行gvhd病理评分;
40.图8为各组gvl模型鼠进行肿瘤负荷检测。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
42.下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
43.实施例1:间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(msc-ato-evs)的制备方法
44.一、材料
45.脐带:来源于健康产妇
46.试剂:ato来源为arsenic(iii)oxide(sigma,17971-10g)
47.下述实施例1中的用于培养msc细胞的培养基为1640培养基 10%fbs:向rpmi-1640培养基中加入fbs,使fbs的体积百分含量为10%得到的液体。
48.二、方法
49.1)间充质干细胞的分离和传代培养msc:取健康产妇离体24小时内新鲜脐带,去除残留血液及脐带内血管,剪碎脐带组织铺入75cm2培养瓶内,培养并传代,得到间充质干细胞(简称msc),具体步骤包括:
50.a1、取新鲜脐带,以生理盐水反复冲洗脐带2-3次,去除残留血液及脐带内血管,剪碎脐带组织至大小为1~2mm3;将组织铺入75cm2培养瓶内,静置15分钟,加入5ml培养基;置于培养箱内培养(37℃,5%co2,饱和湿度);
51.a2、2天后向培养瓶内补充培养基3ml,7天后需更换培养基;培养12天后行显微镜下观察:组织周围有细胞爬出,且局部细胞融合度大于80%时收集组织,可对细胞进行传代培养;
52.a3、传代培养:弃去瓶内原有培养基,加入15ml生理盐水,弃去洗液;加入2ml胰酶,轻轻拍打/左右摇晃,显微镜下观察,待细胞脱落后终止消化;将细胞悬液转入50ml离心管
中,混匀,吸取100μl细胞悬液,行细胞计数;参考计数结果,按4000~8000个/cm2的密度接种至新的培养瓶内;置于培养箱内培养(37℃,5%co2,饱和湿度);
53.a4、重悬、接种:将细胞重悬在50ml离心管中,离心管加入培养基至50ml,1500rpm离心5min,得到细胞沉淀;用5ml培养基重悬细胞,种入175cm2培养瓶中:每个培养瓶种约2
×
107个msc,再加入20ml培养基。
54.a5、msc鉴定:利用流式细胞技术,对获得的msc进行鉴定,结果如图1,是符合msc生物学特性的活细胞。
55.2)加入ato处理msc,同时紫外线照射,使间充质干细胞(简称msc)释放囊泡(简称evs),具体步骤包括:
56.b1、将所述步骤1)中得到的细胞吸取至50ml离心管中,加入pbs洗涤细胞一次,加入10ml 0.05%的胰酶37℃培养箱消化约1.5分钟,加入刚才置入离心管的上清终止消化,1500rpm离心5min,用5ml培养基重悬2
×
107个细胞,铺入10cm培养皿中;
57.b2、将培养皿平均分为3组,每个培养皿加入3mg ato;然后加入培养基,使培养皿中液体总体积为7ml(即ato的含量为3mg/7ml);紫外线照射诱导msc凋亡,每个培养瓶再加入5ml培养基,放入培养箱,在37℃ 5% co2条件下培养。
58.其中,所述步骤b2)中紫外线来源为生物安全柜(thermo 1300 series a2),强度为300j/m2,照射时间为90min;所述照射后培养箱中培养时间为14小时。
59.3)离心提取间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(简称msc-ato-evs):
60.c1、用移液器收集所述步骤2)的细胞至50ml离心管,于500g离心10min去除细胞碎片,取上清液;
61.c2、将c1中的上清液,于14000g离心2min,除掉细胞碎片,取上清液;
62.c3、将c2中的上清液,于14000g离心60min;
63.c4、将离心得到的沉淀用pbs洗一遍即得到间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷(简称msc-ato-evs)。
64.c5、电镜下观察获得的msc-ato-evs形态,如图2所示。
65.c6、利用高效液相质谱法对msc-ato-evs中ato含量进行测定,如图3所示:所得每10万个msc-ato-evs中含有381ng ato。
66.实施例2:
67.一、材料
68.实施例1得到的msc-ato-evs;
69.gvhd鼠模型构建:c57bl/6(雄鼠,周龄6-8周,体重18-20g)和balb/c(雌鼠,周龄6-8周,体重18-20g)小鼠。
70.二、方法
71.1)gvhd型构建,包括如下步骤:
72.a、称重和标记小鼠,喂抗生素水;
73.b、断颈处死c57bl/6小鼠,取出脾脏,研磨后的细胞液,进行裂红、洗涤等操作,用rpmi-1640培养基重悬脾细胞,调整细胞浓度为1
×
108/ml,得到c57bl/6小鼠的脾细胞悬液;取双后肢,冲洗骨髓腔,对冲洗液体进行裂红、洗涤等操作,用rpmi-1640培养基重悬骨髓细胞,调整浓度为5
×
107/ml,得到c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液;将c57bl/6小鼠的脾细
胞悬液和c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液进行混合,得到c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液,该c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液中,c57bl/6小鼠的脾细胞的含量为5
×
107/ml,c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液的含量为2.5
×
107/ml。
74.c、gvhd鼠模型构建:gvhd鼠模型构建:用
60
coγ射线以致死剂量8gy对balb/c小鼠行全身照射4-6小时,将照射后的小鼠随机分为3组:单纯tbi组(仅接受射线照射,共3只)、bm组(照射后注射骨髓细胞,共3只)、gvhd组(照射后注射骨髓细胞 脾细胞,构建gvhd模型,共26只)。bm组经尾静脉注射入0.1ml c57bl/6小鼠的脾细胞悬液及0.1ml rpmi-1640培养基,gvhd组经尾静脉注射入0.2ml c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液,单纯tbi组经尾静脉注射入0.2ml rpmi-1640培养基。
75.2)gvl鼠模型构建,包括如下步骤:
76.21)称重和标记小鼠,喂抗生素水;
77.22)断颈处死c57bl/6小鼠,取出脾脏,研磨后的细胞液,进行裂红、洗涤等操作,用rpmi-1640培养基重悬脾细胞,调整细胞浓度为1
×
108/ml,得到c57bl/6小鼠的脾细胞悬液;取双后肢,冲洗骨髓腔,对冲洗液体进行裂红、洗涤等操作,用rpmi-1640培养基重悬骨髓细胞,调整浓度为5
×
107/ml,得到c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液;将c57bl/6小鼠的脾细胞悬液和c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液进行混合,得到c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液,该c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液中,c57bl/6小鼠的脾细胞的含量为5
×
107/ml,c57bl/6小鼠的骨髓细胞悬液的含量为2.5
×
107/ml。
78.23)gvl鼠模型构建,gvhd鼠模型构建:用
60
coγ射线以致死剂量8gy对balb/c小鼠行全身照射4-6小时,将照射后的小鼠随机分为3组:单纯tbi组(仅接受射线照射,共3只)、bm组(照射后注射骨髓细胞,共5只)、gvhd组(照射后注射骨髓细胞 脾细胞,构建gvhd模型,共13只)。bm组经尾静脉注射入0.1ml c57bl/6小鼠的脾细胞悬液及0.1ml rpmi-1640培养基和a20肿瘤细胞,gvhd组经尾静脉注射入0.2ml c57bl/6脾细胞 小鼠骨髓细胞悬液和a20肿瘤细胞,单纯tbi组经尾静脉注射入0.2ml rpmi-1640培养基。每只小鼠注射1
×
104a20肿瘤细胞。
79.3)gvhd/gvl小鼠给药方案:将gvhd/gvl小鼠随机分为3组(分别为10只/5只、8只/4只和8只/4只),从移植后第1天开始,连续10天(d1-d10),经腹腔分别注射如下药物治疗:gvhd/gvl不干预组(15只)(每只注射pbs 400ul)、ato治疗组(12只)(每只注射ato的pbs悬液400ul,其中每只小鼠注射ato量按照5ug/kg计算)、msc-ato-evs治疗组(12只)(msc-ato-evs的的pbs悬液400ul,其中,将实施例1中由2
×
107msc和3mgato制备获得msc-ato-evs与400ulpbs配置成msc-ato-evs的的pbs悬液)。其中每400ul msc-ato-evs均由2
×
107msc制备获得,每只小鼠注射ato量按照5ug/kg计算所得且均配成400ul。
80.3)gvhd小鼠干预结果评估:从移植后第1天(d1)开始,每2日观察小鼠体重、活动度、弓背、体毛打皱、脱毛、腹泻等,根据cooke评分系统行gvhd临床评分;移植后第14天(d14)每组随机处死部分受鼠,取小鼠肝、脾、皮肤、结肠、小肠,按照病理评分标准对各个器官进行组织学评分。
81.4)gvl效应评估:第14天对于各组小鼠(bm组、gvhd组、ato治疗组、msc-ato-evs治疗组)进行活体成像,检测肿瘤负荷。
82.三、结果
83.1)各组gvhd模型鼠行gvhd临床评分,结果如图5和图6所示,图5中所示为各组小鼠gvhd临床评分,图6中所示为各组小鼠生存情况,从图5和图6可以看出,msc-ato-evs治疗组与gvhd组、ato治疗组相比,gvhd评分均显著降低(见图5),总体生存率显著升高(见图6);
84.2)各组gvhd模型鼠行gvhd病理评分,结果如图7所示,图7中所示为各组小鼠gvhd各靶器官部位(包括皮肤、肝、脾、结肠、小肠)病理评分,从图7可以看出,msc-ato-evs治疗组与gvhd组相比,在结肠(2.00
±
0.82 vs 3.75
±
0.50,p=0.040)和小肠(3.20
±
0.84 vs 6.6
±
1.14,p=0.031)部位病理评分显著降低(见图7)。
85.3)各组gvl模型鼠进行肿瘤负荷检测:结果如图8所示,图8中所示为荧光活体成像下各组小鼠肿瘤负荷,从图8可以看出,msc-ato-evs可显著降低肿瘤负荷(见图8)。
86.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。

技术特征:
1.一种复合制剂的制备方法,其特征在于,包括:1)将间充质干细胞置于含有三氧化二砷的培养基中,先进行紫外照射处理,后进行培养,使间充质干细胞释放囊泡,2)提取培养物中的囊泡,得到间充质干细胞来源的囊泡包裹的三氧化二砷。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述1)中,三氧化二砷和所述间充质干细胞的配比为3mg三氧化二砷:2
×
107所述间充质干细胞;所述步骤1)中紫外照射处理时含有三氧化二砷的培养基中三氧化二砷的浓度为3/8~3/7mg/ml;培养时含有三氧化二砷的培养基中三氧化二砷的浓度为3/12-3/11。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,将间充质干细胞置于含有三氧化二砷的培养基中,是所述间充质干细胞的含量为4*个/ml。4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)紫外照射处理的紫外线强度为300j/m2,紫外线照射时间为90min。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中培养条件为:37℃,5%co2条件下培养14小时。6.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中提取培养物中的囊泡的方法包括:c1)离心,去除细胞碎片,取上清液;c2)将步骤c1)中的上清液,第二次离心,去除细胞碎片,取上清液;c3)将步骤c2)中的上清液,第三次离心,取沉淀;c4)将步骤c3)中离心得到的沉淀进行清洗,得到间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷。7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤c1)中的离心条件为:500g离心10min;所述步骤c2)中的离心条件为:14000g离心2min;所述步骤c3)中的离心条件为:14000g离心60min。8.根据权利要求1-7任一所述的方法,其特征在于,所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞;所述脐带间充质干细胞来源于新鲜脐带,所述新鲜脐带是指健康产妇离体24小时内的脐带。9.权利要求1-8任一所述方法制备得到的间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷。10.权利要求10所述的的间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷在制备预防和/或治疗移植物抗宿主病和/或肿瘤药物中的应用。
技术总结
本发明涉及一种间充质干细胞来源囊泡包裹三氧化二砷的制备方法,包括:1)将间充质干细胞置于含有三氧化二砷的培养基中,先进行紫外照射处理,后进行培养,使间充质干细胞释放囊泡,2)提取培养物中的囊泡,得到间充质干细胞来源的囊泡包裹的三氧化二砷。本发明结合紫外线照射和药物处理的方式,将ATO包入MSC-EVs中,制备成复合制剂,以期同时发挥ATO和MSC-EVs的免疫调节作用,对GVHD进行干预,为临床治疗提供新方法。疗提供新方法。


技术研发人员:张晓辉 刘晓 苏艳 黄晓军 黄波 刘玉英
受保护的技术使用者:北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院)
技术研发日:2019.12.30
技术公布日:2021/7/15

转载请注明原文地址:https://doc.8miu.com/read-650254.html

最新回复(0)