一种鲜鹿茸制备强肾片的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鲜鹿茸制备强肾片的方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.强肾片是辽宁上药好护士药业(集团)有限公司的生产的一款处方类药品。其以鹿茸为君药发挥其补肾壮阳、益精填髓的作用，以六味地黄丸(熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮)为基础方作为臣药，滋阴补肾，加入枸杞子滋补肝肾，桑椹滋阴补血，补骨脂补肾壮阳，固精缩尿，杜仲补肝肾，强筋骨，人参茎叶总皂苷大补元气，丹参养血活血，益母草活血祛瘀，共为佐药。诸药合用，发挥补肾填津，益气壮阳的功效，主治阴阳两虚所致的肾虚水肿，腰痛，遗精，阳痿，早泄，夜尿频数，慢性肾炎和久治不愈的肾盂炎等症，自上市销售以来，取得了良好的疗效。
4.其中，君药鹿茸的传统制法为在沸水中煮炸、烘烤、晾干循环加工等工序，这种传统的加工炮制，使鹿茸中的活性成分受热变性或者经水漂而使活性成分随之水分丢失，最终导致鹿茸的活性减弱。同时，其他药物成分亦由于制法上存在缺陷，导致原料有效成分不能充分利用，增加了企业成本的同时，也不利于产品品质的进一步提高。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，经长期的技术与实践探索，本发明提供一种鲜鹿茸制备强肾片的方法，本发明中以鲜鹿茸作为原料，先采用高压均质技术，在有效保持鲜鹿茸的营养成分的基础上达到热杀菌同样的效果，杀灭鲜鹿茸自身生物酶、细菌等微生物，防止其腐败，而且经高压均质后，提高了产品稳定性。同时通过对强肾片中其他原料提取制备工艺进行改良，减少原料药材的浪费，并有效提升药品品质。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：
7.本发明的第一个方面，提供一种强肾片，所述强肾片的药物活性成分包括鲜鹿茸提取物，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，丹参醇提取物，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，和人参茎叶提取物。
8.其中，所述鲜鹿茸提取物，其制备方法包括：以鲜鹿茸为原料，采用研磨、高压匀质分散、冷冻干燥制成鲜鹿茸提取物，保留了鲜鹿茸中珍贵的鹿茸血，新鲜的鹿茸血能够增加sod含量，增强代谢机能，抑制mao活性，减少自由基形成，增强睾酮合成，提高性机能。
9.牡丹皮和山药超微粉碎提取物，其制备方法包括：将牡丹皮和山药经超微粉碎制成超微粉；其中，牡丹皮和山药的质量比为1:1～2；
10.丹参醇提取物，其制备方法包括：将丹参加入乙醇做溶剂，浸渍处理后收集渗滤液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，低温干燥，粉碎即得。
11.山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，其制备方法包括：
12.将于山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲共十味药，加水煎煮两次，第一次加8-10倍水(优选为10倍水)，提取1-2h，第二次加6-8倍水(优选为8倍水)，提取1-2h，过滤，合并提取液，静置；取上清减压浓缩至稠膏，低温(60℃以下)干燥，粉碎。
13.人参茎叶提取物，其制备方法包括：取林下山参叶，切段，加水煎煮2次，第一次加水量控制为1:14～16(优选为1:15)，煎煮2～3h，第二次加水量1:8～10(优选为1:10)，煎煮1～2h，煎液纱布滤过，合并滤液，浓缩，通过大孔吸附树脂柱洗脱，后直接离子交换树脂脱色，收集并合并洗脱液，滤液浓缩至清膏，干燥，粉碎，得人参茎叶提取物。
14.本发明的第二个方面，提供上述强肾片制备方法，所述制备方法包括：将上述药物活性成分混匀合并，加入药学上可接受的辅料压片即得。
15.优选的，所述制备方法还包括在压片后进行包糖衣或薄膜衣，即得强肾片。
16.本发明的有益效果：
17.本发明中以鲜鹿茸作为原料，先采用高压均质技术，在有效保持鲜鹿茸的营养成分的基础上达到热杀菌同样的效果，杀灭鲜鹿茸自身生物酶、细菌等微生物，防止其腐败，而且经高压均质后，提高了产品稳定性。同时通过对强肾片中其他原料对提取制备工艺进行了优化改良，减少原料药材的浪费，并有效提升药品品质，经试验证明，本发明最终制备产品其疗效确切，具有提高小鼠抗疲劳能力，缩短肾阳虚小鼠首次爬背时间，显著增加其爬背次数等功效，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
18.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
19.图1为本发明实施例1的人参与林下山参茎叶总皂苷含量对比图；其中(a)为人参皂苷对照品液相色谱图；(b)为林下山参茎叶总皂苷液相色谱图；(c)为人参茎叶总皂苷液相色谱图。
具体实施方式
20.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
21.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
22.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对
其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.如前所述，现有强肾片中君药鹿茸的制法为在沸水中煮炸、烘烤、晾干循环加工等工序，这种传统的加工炮制，使鹿茸中的活性成分受热变性或者经水漂而使活性成分随之水分丢失，最终导致鹿茸的活性减弱。同时，其他成分亦由于制法上存在缺陷，导致原料有效成分不能充分利用，增加了企业成本的同时，也不利于产品品质的进一步提高。
24.有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种强肾片，所述强肾片的药物活性成分包括鲜鹿茸提取物，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，丹参醇提取物，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，和人参茎叶提取物。
25.本发明的又一具体实施方式中，所述鲜鹿茸提取物，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，丹参醇提取物，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物和人参茎叶提取物五部分提取物的质量比为10:50～100:10～20:20～25:1～5。
26.本发明的又一具体实施方式中，所述鲜鹿茸提取物，其制备方法包括：以鲜鹿茸为原料，采用研磨、高压匀质分散、冷冻干燥制成鲜鹿茸提取物，保留了鲜鹿茸中珍贵的鹿茸血，新鲜的鹿茸血能够增加sod含量，增强代谢机能，抑制mao活性，减少自由基形成，增强睾酮合成，提高性机能。区别于以干燥的鹿茸片为原料的其他同类产品，与之相比，本发明制备方法获得的鲜鹿茸提取物有效成分保留更多，补肾壮阳效果更加显著。
27.本发明的又一具体实施方式中，以鲜鹿茸为原料，先将鲜鹿茸斩碎成直径约为2-5mm的粗颗粒，加入1～3倍量水(优选为1.5倍量水)，研磨，研磨温度控制在38-41℃，得到浓稠浆液；
28.浆液先经分散机处理后，再经过匀质处理，制得纳米分散液；
29.将纳米分散液先预冻(-25℃～-40℃)后，保持-25℃～-30℃1.5～3小时(优选2小时)，抽真空至40-60pa，然后升温至搁板温度为-20℃，维持10-13小时(优选12小时)，再升温至搁板温度为-10℃，维持5-6小时(优选为6小时)，至升华完成，再将搁板温度升至40℃，直至解析完成，出料得到冻干粉，即为鲜鹿茸提取物。
30.由于成年鹿体温在38-39℃范围内，仔鹿体温略高，在38.7-40.6℃范围内，因此本发明通过控制研磨温度，使之与鹿体温度更为接近，从而减少鹿茸活性成分的丧失。
31.本发明应用鲜鹿茸作为原料，先采用高压均质技术，通过调节均质压力、次数等条件，在有效保持鲜鹿茸的营养成分的基础上达到热杀菌同样的效果，杀灭鲜鹿茸自身生物酶、细菌等微生物，防止其腐败，而且经高压均质后，提高了产品稳定性。
32.高压均质后再应用冷冻干燥技术将均质液进行低温干燥，在低温下进行，同样保证蛋白质等营养成分不变性，活性不被破坏，且整个过程在真空环境下进行，与外界隔离，也防止其在外界腐败菌作用下进一步腐败变质。
33.本发明的又一具体实施方式中，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，其制备方法包括：将牡丹皮和山药经超微粉碎制成超微粉；其中，牡丹皮和山药的质量比为1:1～2；
34.本发明的又一具体实施方式中，丹参醇提取物，其制备方法包括：将丹参加入乙醇做溶剂，浸渍处理后收集渗滤液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，低温干燥，粉碎即得。
35.料液比为1:5～15(1:10，w/w)，所述乙醇为55％乙醇，浸渍处理时间为10～15小时
(优选12小时)，以1～5ml/min(优选3ml/min)收集渗滤液；所述低温为60℃以下。
36.本发明的又一具体实施方式中，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，其制备方法包括：
37.将于山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲共十味药，加水煎煮两次，第一次加8-10倍水(优选为10倍水)，提取1-2h，第二次加6-8倍水(优选为8倍水)，提取1-2h，过滤，合并提取液，静置；取上清减压浓缩至稠膏，低温(60℃以下)干燥，粉碎。
38.其中，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲的质量比为1:1:1～2:1:1:1:1～2:1～2:1:1。
39.本发明的又一具体实施方式中，人参茎叶提取物，其制备方法包括：取林下山参叶，切段，加水煎煮2次，第一次加水量控制为1:14～16(优选为1:15)，煎煮2～3h，第二次加水量1:8～10(优选为1:10)，煎煮1～2h，煎液纱布滤过，合并滤液，浓缩，通过大孔吸附树脂柱洗脱，后直接离子交换树脂脱色，收集并合并洗脱液，滤液浓缩至清膏，干燥，粉碎，得人参茎叶提取物。
40.本发明的又一具体实施方式中，通过大孔吸附树脂柱洗脱具体程序为：控制上药量为15～18g:20～24ml(优选为16g:20ml，药材量：大孔树脂体积)，调节ph至8～11(优选ph为10.71)水洗脱至无色，先用20％乙醇洗脱，再用60％乙醇洗脱。
41.本发明的又一具体实施方式中，所述大孔吸附树脂优选为d101型。
42.本发明的又一具体实施方式中，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂，优选为弱碱型d941阴离子交换树脂。
43.经试验证明，人参叶中皂苷含量远大于人参茎，因此，本发明优选使用纯人参叶制备，更进一步的，优选林下参叶，其皂苷含量最高。
44.本发明的又一具体实施方式中，提供上述强肾片的制备方法，所述制备方法包括：将上述药物活性成分混匀合并，加入药学上可接受的辅料压片即得。
45.本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括在压片后进行包糖衣或薄膜衣，即得强肾片。
46.本发明的又一具体实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、填充剂、崩解剂、流动剂、塑化剂、着色剂、甜味剂、保存剂或抗氧化剂中的一种或多种。
47.本发明的又一具体实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括淀粉、蔗糖和硫酸钙。
48.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
49.实施例1
50.一种强肾片的组成：1)鲜鹿茸提取物；2)超微提取物：牡丹皮、山药超微粉碎；3)人参茎叶总皂苷；4)醇提取物：丹参加乙醇提取，得醇提取物；5)水提取物：山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲加水提取，得水提取物。
51.1、鲜鹿茸提取物
52.传统工艺：鲜鹿茸，置沸水中反复烫3次，每次30s，然后晾干，次日再重复沸水烫3次，每次30s，然后挂在烘炉中40-50℃(不超过60℃)烘干，烘好后，取出，迅速冷却风凉，凉
透后粉碎成细粉。
53.优化后工艺：1)鲜鹿茸斩碎成粗颗粒，直径约为2-5mm；2)加入1.5倍量纯化水，用胶体磨研磨60min，接冷凝水，研磨温度控制在38-40℃(成年鹿体温在38-39℃范围内，仔鹿体温略高，在38.7-40.6℃范围内)，得到浓稠浆液；3)浆液先经分散机处理，得到初乳液；5)初乳液经过高压微射流匀质机匀质处理，120mpa，均质8次，制得纳米分散液；6)纳米分散液装入托盘中，先预冻(-25℃～-40℃)5小时后，放入冷冻干燥机，保持-25℃～-30℃2小时，抽真空至40-60pa，然后升温至搁板温度为-20℃，维持12小时，再升温至搁板温度为-10℃，维持6小时，至升华完成，再将搁板温度升至40℃，直至解析完成，出料。得到冻干粉，即为鲜鹿茸提取物。
54.测定传统工艺鹿茸粉和鲜鹿茸提取物以下各成分的含量，测定结果如下：
55.序号成分名称传统工艺样品工艺优化样品1水溶性多糖1.48g/kg2.35g/kg2粗蛋白64.30％66.54％3水解氨基酸总量48.89g/100g50.90g/100g4总脂肪酸6.50g/kg7.74g/kg5核苷类成分总量3.43g/kg3.87g/kg
56.试验结果显示，鲜鹿茸提取物各成分含量均高于应用传统加工方法制备的鹿茸粉，鲜鹿茸提取物中水溶性多糖含量是以传统工艺制备的鹿茸粉的1.59倍；粗蛋白1.03倍；水解氨基酸1.04倍；总脂肪酸1.19倍；核苷类成分总量1.13倍。
57.2、超微粉碎提取物
58.药典工艺：牡丹皮粉碎成细粉。
59.优化后工艺：牡丹皮先粉碎成细粉，再超微振动粉碎成超微粉。
60.测定两工艺样品中丹皮酚含量差异。
61.序号样品名称丹皮酚(％)溶出度(％)1细粉1.55-2超微粉1.60
↑
3.23
62.试验结果显示，经超微粉碎后，丹皮酚含量升高，溶出度提高了3.23％。表明超微粉碎可以提高原料中成分的溶出度。所以原工艺中牡丹皮和山药工艺为单纯粉碎成细粉修改为超微粉。
63.3、醇提取物
64.药典工艺：丹参粉碎成粗粉，用70％乙醇作溶剂，浸渍，渗漉，收集渗漉液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏。
65.优化后工艺：加入10倍量55％乙醇做溶剂，先浸渍12h，12h后以3ml/min收集渗滤液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，低温(60℃以下)干燥，粉碎。
66.取粉碎成粗粉的丹参，经正交试验研究，以获取最佳提取方法和工艺条件。
67.因素水平表
[0068][0069][0070]
正交试验结果表
[0071][0072]
方差分析表
[0073]
因素偏差平方和自由度f比f临界值显著性乙醇浓度10.55425277.00019.000*乙醇量0.01527.50019.000 流速000120.50019.000 误差0.002
ꢀꢀꢀ
[0074]
试验结果显示，丹参酮ⅱa含量的影响因素为：乙醇浓度＞乙醇量＞浸泡时间＞流速；最佳工艺为a1b3c1d2；但仅乙醇浓度对丹参酮ⅱa含量具有显著影响，其他条件对丹参酮ⅱa含量的影响较小，结合节省生产时间、能源消耗等其他因素综合考虑最终工艺定为a1b2c2d2，即加入10倍量55％乙醇，浸渍12h，12h后以3ml/min收集渗滤液。
[0075]
4.水提取物
[0076]
药典工艺：山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲加水煎煮两次，滤过，合并滤液，静置；取上清液减压浓缩至稠膏。
[0077]
优化后工艺：山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲加水煎煮两次，第一次加10倍水，提取2h，第二次加8倍水，提取1.5h，过滤，合并提取液，静置；取上清减压浓缩至稠膏，低温(60℃以下)干燥，粉碎。
[0078]
4.1加水量筛选
[0079]
以上十味药，分别用8、10、12倍量水进行提取，提取1次，2h，过滤，提取液浓缩至稠膏，测定稠膏中以下各成分含量。
[0080][0081]
实验结果显示，提取物稠膏中各成分含量随着加水量的增加而增加，加水量由8倍增加到10倍时，各成分含量提取率增加显著，再继续增加加水量至12倍时，含量继续增加，但变化趋势减小。
[0082]
4.2提取次数筛选
[0083]
用8倍量水进行提取，分别提取1、2、3次，每次2h，过滤，分别合并提取液，浓缩至稠膏，测定稠膏中以下各成分含量。
[0084][0085]
实验结果显示，随着提取次数的增加，提取物稠膏中各成分含量随之增长，但提取3次和提取2次的结果显著较小，提示，提取2次基本可以达到充分提取。
[0086]
4.3提取时间筛选
[0087]
用8倍量水进行提取，提取1次，分别提取1、1.5、2h，过滤，提取液浓缩至稠膏，测定稠膏中以下各成分含量。
[0088][0089][0090]
实验结果显示，随着提取时间的增加，提取物稠膏中各成分的含量随之增长。
[0091]
综合以上实验结果，结合节省生产时间、能源消耗等其他因素综合考虑最终工艺定为，十味药加水煎煮两次，第一次加10倍水，提取2h，第二次加8倍水，提取1.5h，过滤，合并滤液，静置；取上清减压浓缩至稠膏。
[0092]
5.林下山参茎叶总皂苷制备工艺优化
[0093]
药典工艺：取人参茎叶，切成1～2cm段，加水煎煮2次，第一次2h，第二次1.5h，煎液滤过，合并滤液，通过d101型大孔吸附树脂柱，水洗脱至无色，60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08(80℃)的清膏，干燥，粉碎，即得。
[0094]
优化后工艺：取林下山参叶，切成1～2cm段，加水煎煮2次，第一次加水量1:15，煎煮2h，第二次加水量1:10，煎煮1.5h，煎液纱布滤过，合并滤液，浓缩至约0.1g/ml，通过d101型大孔吸附树脂柱，上药量为16:20(药材量：大孔树脂体积)，水洗脱至无色，先用20％乙醇洗脱，再用60％乙醇洗脱，后直接离子交换树脂脱色，收集并合并洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08(80℃)的清膏，干燥，粉碎，即得。
[0095]
5.1人参茎叶提取
[0096]
取人参茎叶，切成1-2cm段，加水煎煮2次，第一次加水量1:15，煎煮2h，第二次加水量1:10，煎煮1.5h，煎液纱布滤过，合并，浓缩至约0.1g/ml。4℃条件下保存。
[0097]
5.2大孔树脂上样量筛选
[0098]
表1.1上样量筛选结果
[0099][0100]
注：原料为河北安国园参叶；洗脱方式为水洗后，60％醇洗脱；大孔树脂为沪试d101大孔吸附树脂。
[0101]
在之前的实验中，筛选过大孔树脂吸附人参茎叶提取液上样饱和吸附量测试，当上样量人参茎叶20g，大孔树脂柱体积为20ml时，开始有少量的人参皂苷rg1和re流出。因此当大孔树脂柱体积为20ml时，上样量控制在16g人参茎叶较适宜。
[0102]
如表1.1所示，选择了三个不同的上样量，即不饱和上样(实验1)，近饱和上样(实验2)，过饱和上样(实验3)，结果显示制备的人参茎叶总皂苷中三个成分的含量无明显差异，说明增加上样量，人参皂苷与其中的杂质并不会产生竞争性吸附，增加产物中人参皂苷的含量。因此之后的实验中将上样量控制在16:20(药材量：大孔树脂体积)左右，以节省试剂及时间。
[0103]
5.3大孔树脂洗脱条件筛选结果
[0104]
表1.2洗脱条件筛选
[0105][0106][0107]
注：原料为林下参茎叶；大孔树脂为沪试d101大孔吸附树脂。
[0108]
《中国药典》中规定人参茎叶总皂苷的制法：取人参茎叶，切小段，加水煎煮二次，过滤，上样d101大孔树脂吸附，水洗脱后，60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，粉碎即得。且其质控方法为人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rd的总量应为30～45％。
[0109]
按照《中国药典》相同的制备方法，即表1.2中实验1，制备得到的人参茎叶总皂苷中rg1、re、rd三者含量之和只有13.8％，远低于药典标准，且产物为棕褐色，与药典上淡黄色或黄白色粉末的性状不符。两次过柱后(方法2)，三者含量有明显升高，仍不符合药典标准。用河北安国人参叶作为原料，洗脱方式为水洗后20％醇洗再60％醇洗脱，两次过柱后，产物中三种人参皂苷含量为36.7％，含量符合药典标准，但总皂苷为黄棕色，性状不合药典标准。
[0110]
在水洗与60％乙醇洗脱液中间加入20％(实验3)及30％(实验4)稀醇洗脱步骤，20％乙醇洗脱液中检测不到人参皂苷，且终产物中人参皂苷含量有升高，但仍未达到药典标准。30％乙醇已能明显洗脱出人参皂苷，因此终产物中三者含量低于方法2制备产物。人参茎叶总皂苷提取液的ph值大约在5.6左右，呈弱酸性，用1m的氢氧化钠水溶液调节将其调制碱性时，有沉淀析出，离心取上清，过大孔树脂洗脱。如实验5及实验6，当调节提取液ph值越高，三个人参皂苷含量有明显升高。但只是刚刚达到药典标准，且改变其酸碱度，可能会导致成分的不稳定，因此该方法并不适用。
[0111]
5.4不同型号及种类大孔树脂筛选
[0112]
表1.3树脂筛选
[0113][0114]
注：洗脱方式均为水洗，20％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱。
[0115]
2015版《中国药典》规定，制备人参茎叶总皂苷的树脂为d101型大孔吸附树脂。本实验选择了国药集团、西安蓝晓及艾美科健三个厂家的d101型大孔吸附树脂，以及美国陶氏的xad1600n及xad1180n两个型号的树脂。xad系列的树脂骨架与d101相同，均为苯乙烯-二乙烯基苯，且xad1600n大孔树脂与d101相同均为非极性大孔树脂。而且中药中皂苷类成分的分离纯化均选择ab-8，d101，hpd100等这些弱极性或非极性的大孔吸附树脂。
[0116]
如表1.3所示，实验1-4中，均选择林下参茎叶作为原料，四种不同的大孔树脂制备总皂苷中三个皂苷含量有些许差异，但并不明显，xad系列的大孔树脂制备的皂苷含量也无明显差异，且未达到药典标准。实验5-8比较了西安蓝晓及国药沪试的d101大孔吸附树脂，两个样品均是沪试的大孔树脂制备效果较好，但差异并不明显。
[0117]
5.5不同原料制备人参茎叶总皂苷
[0118]
表1.4不同原料制备人参茎叶总皂苷结果
[0119][0120]
注：洗脱方式均为水洗，20％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱；大孔树脂为d101型大孔吸附树脂。
[0121]
市场上可以购买到的人参茎叶样品一般为单纯的人参叶，并无人参茎。药典上也只有人参叶的质量标准。据文献显示，人参叶中皂苷含量远大于人参茎。经实验研究可得相同结果，如表1.4，实验1原料为人参茎叶混合样品，实验2为单纯的人参叶，实验2制备的人参茎叶总皂苷含量较高，说明原料中的人参茎叶皂苷含量多，制备的终产物人参皂苷的含
量也会相应的升高。且实验3及实验4为两种园参叶，从结果可以看出河北安国园参叶中皂苷含量应大于亳州园参叶。
[0122]
5.6阴离子交换树脂脱色研究
[0123]
表1.5阴离子交换树脂脱色
[0124][0125][0126]
注：洗脱方式均为水洗，20％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱，后直接离子交换树脂脱色；大孔树脂为d101型大孔吸附树脂。
[0127]
中药提取物常用的脱色方法有活性炭脱色、氧化铝脱色、h2o2脱色、大孔树脂脱色等方法。但活性炭对人参皂苷有吸附，造成产物损失。氧化铝会改变提取液ph值，过氧化氢有氧化性，可能会导致成分改变，因此选择离子交换树脂的方法进行脱色。
[0128]
氯型717为强碱型阴离子交换树脂，d941为弱碱型阴离子交换树脂。脱色后人参茎叶总皂苷为均淡黄色粉末，两种离子交换树脂脱色效果无明显差异。如表1.5所示，脱色后人参皂苷含量有明显改善，两种离子交换树脂均能是终产物符合药典要求。实验1和2两种离子交换树脂制备总皂苷含量无明显差异；实验3和4制备的人参茎叶总皂苷，d941纯化效果较好。
[0129]
5.7人参与林下山参茎叶总皂苷含量对比
[0130]
对比人参与林下山参茎叶总皂苷中含量差异，如图1所示，明显看出林下山参中，各成分含量均高于人参茎叶总皂苷样品。
[0131]
具体的，强肾片制备方法如下：
[0132]
1、鲜鹿茸提取物：1)取鲜鹿茸33g，斩碎成直径约为2-5mm的粗颗粒；2)加入纯化水49.5g，用胶体磨研磨60min，接冷凝水，研磨温度控制在38-40℃(成年鹿体温在38-39℃范围内，仔鹿体温略高，在38.7-40.6℃范围内)，得到浓稠浆液82g；浆液先经分散机处理后，再经过高压微射流匀质机匀质处理，120mpa，均质8次，制得纳米分散液80g；将纳米分散液装入托盘中，先预冻(-25℃～-40℃)5小时后，放入冷冻干燥机，保持-25℃～-30℃2小时，抽真空至40-60pa，然后升温至搁板温度为-20℃，维持12小时，再升温至搁板温度为-10℃，维持6小时，至升华完成，再将搁板温度升至40℃，直至解析完成，出料得到冻干粉10g，即为鲜鹿茸提取物。
[0133]
2、超微粉碎提取物：牡丹皮50g和山药50g先经粉碎机粉碎成细粉，再经超微粉碎机制成超微粉。
[0134]
3、醇提取物：丹参100g，加入55％乙醇做溶剂，先浸渍12h，12h后以3ml/min收集渗滤液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，得稠膏20g，60℃以下减压干燥，粉碎得15g。
[0135]
4、水提取物：山药50g、山茱萸50g、熟地黄100g、枸杞子50g、补骨脂50g、桑椹50g、
益母草100g、茯苓100g、泽泻50g、盐杜仲50g，加水煎煮提取两次，第一次加6500g，提取2h，第二次加5200g，提取1.5h，过滤，合并提取液，静置；取上清减压浓缩至稠膏50g，60℃以下减压干燥，粉碎得22g。
[0136]
5、人参茎叶提取物：取人参叶12g，切成1～2cm段，加水煎煮2次，第一次加水量1:15，煎煮2h，第二次加水量1:10，煎煮1.5h，煎液纱布滤过，合并滤液，浓缩至约0.1g/ml，通过d101型大孔吸附树脂柱，上药量为16:20(药材量：大孔树脂体积)，水洗脱至无色，先用20％乙醇洗脱，再用60％乙醇洗脱，后直接离子交换树脂脱色，收集并合并洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08(80℃)的清膏，干燥，粉碎，得人参叶提取物3g。
[0137]
6、合并以上5部分提取物，加入淀粉50g，蔗糖粉32.5g，硫酸钙5g，混匀，干法制粒，再加硬脂酸镁2.5g，压片，包糖衣或薄膜衣，制得强肾片400片，0.6g/片。
[0138]
效果验证
[0139]
1、材料与试剂
[0140]
1.1材料与仪器
[0141]
实验动物：健康成年昆明种小鼠，spf级，体重17～25g，雌雄兼用，实验前7天将受试动物置于饲养观察室内观察(室温25
±
1℃、相对温度50-60％)，自然光照，昼夜明暗交替时间为12h，自由进食饮水，通风洁净良好。
[0142]
主要仪器：电子天平(赛多利斯(北京)公司，sartorius)
[0143]
1.2药物及试剂
[0144]
对照品(强肾片原工艺提取物)，样品(强肾片新组合物)，万艾可(0.1g/片，5片/盒，辉瑞制药有限公司)，强的松(5mg/片，100片/瓶，浙江仙琚制药股份有限公司)，戊酸雌二醇片(1mg/片，21片/盒，delpharm lille s.a.s.)，以上试验药品均临用时用0.5％cmc去离子水配制成所需浓度的溶液。
[0145]
2方法
[0146]
2.1小鼠负重游泳实验
[0147]
30只小鼠适应性喂养7d后，被随机分为3组：空白对照组、对照组和实验组，每组10只，各给药组每天灌胃临床等效剂量的药物溶液1.0ml，2次/d，空白对照组灌服同体积的生理盐水，连续给药10d。各组于末次给药后2h，尾根部按其体重1/10负重，然后分别投入直径50cm，水深40cm，水温23℃，记录自游泳开始至头部全部沉入水中8s不能浮出水面的时间，作为小鼠力竭游泳时间。
[0148]
2.2改善肾阳虚阳痿小鼠性行为实验
[0149]
将50只雄鼠与100只雌鼠随机分为5组，即空白对照组、模型对照组、万艾可组、对照组和实验组。雄鼠每组10只，雌鼠每组10对，每对对应于一只雄鼠，用于合笼及观测性行为活动。雄鼠除空白对照组外，其余各组动物灌胃强的松15mg/kg，每天1次，连续4周。对照组和实验组分别灌胃临床等效剂量的药液，空白对照组和模型对照组灌胃等体积0.5％cmc-na溶液，每天给药1次，连续4周。雌鼠于第25
±
2天，每天灌胃一次戊酸雌二醇1mg/kg。末次给药后1h将雄鼠与其对应的两只雌鼠合笼10min，观察雄鼠的嗅舔次数，首次爬背时间和爬背次数。
[0150]
2.3改善肾阳虚阳痿小鼠睾丸、附睾重量及其指数实验
[0151]
将50只雄性小鼠随机分为5组，即空白对照组、模型对照组、万艾可组、对照组和实
验组。每组10只，除空白对照组外，其余各组动物均灌胃强的松15mg/kg，每天1次，连续4周。对照组和实验组分别灌胃临床等效剂量的药液，空白对照组和模型对照组灌胃等体积0.5％cmc-na溶液，每天给药1次，连续4周。杀死雄鼠，取睾丸、附睾组织称湿重，并计算其脏器指数。
[0152]
2.4统计学分析
[0153]
计量数据采用均数
±
标准差表示组间比较进行one-way anova检验，重复测量数据采用重复测量方差分析，多重比较采用lsd法。所有资料统计、分析、作图均采用spss 16.0完成，p＜0.05表示具有统计学意义。
[0154]
3结果
[0155]
3.1两种提取物对小鼠负重游泳时间的影响
[0156]
实验过程中，各组大鼠的精神状态、活动状态及摄食饮水状态均正常。如表1所示，各给药组小鼠与空白对照组比较，力竭游泳时间均明显增加(p＜0.01)，提示强肾片两种提取物均具有提高小鼠抗疲劳能力的作用，实验组力竭游泳持续时间明显长于对照组。
[0157]
表1强肾片提取物对小鼠负重游泳的影响
[0158][0159]
注：与空白对照组比较，
*
p＜0.01。
[0160]
3.2两种提取物对肾阳虚导致阳痿小鼠的影响
[0161]
如表2所示，小鼠在给予强的松4周后，其嗅舔次数显著减少，首次爬背时间明显延长，爬背次数显著减少，与正常对照组比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。强肾片对照组、实验组和万艾可组均可显著缩短肾阳虚小鼠首次爬背时间，显著增加其爬背次数，与模型对照组比较具有统计学差异(p＜0.05)。
[0162]
表2强肾片提取物对肾阳虚导致阳痿小鼠性行为的影响
[0163]
[0164][0165]
注：*与模型对照组比较，p＜0.05。
[0166]
3.3两种提取物对肾阳虚阳痿小鼠睾丸、附睾重量及其指数的影响
[0167]
如表3所示，连续给予强的松4周，其睾丸重量、附睾重量均有一定程度的降低，但各药物组与正常对照组比较无统计学差异；由于模型动物体重降低的缘故，其睾丸指数及附睾指数均显著增加，与正常对照组比较有统计学差异(p＜0.05)。各药物组对上述指标均无明显影响，与模型对照组比较，虽然有改善作用，但是效果不明显，无统计学差异(p＞0.05)。
[0168]
表3强肾片提取物对肾阳虚阳痿小鼠睾丸、附睾重量及其指数的影响
[0169][0170]
注：*与模型对照组比较，p＜0.05。
[0171]
4、结论
[0172]
现代医学认为阴茎勃起首先是在激素的作用下，即有性欲存在的基础上，对内外刺激做出的反应，其中雄激素与性欲、性的激发和发展、性功能密切相关，其在性行为中起着关键的作用。本研究显示，强肾片两种提取物均可延长小鼠游泳时间，提高小鼠的抗疲劳能力，与空白对照组比较，差异均具有统计学意义(p＜0.01)。实验组力竭游泳时间明显长于对照组，药效作用呈现出明显的增强趋势。两种提取物均可显著改善肾阳虚小鼠的阳痿症状，增强小鼠阴茎勃起及交配能力，嗅舔次数与爬背次数明显优于阳性对照组，性欲改善明显；与对照组相比，实验组各检测指标均有不同程度的增强趋势。阴茎勃起是一个复杂的心理、生理过程，受正常的激素分泌，健全的神经反射，血液循环协调运动及阴茎正常的解剖结构等多种因素影响；性功能障碍与年龄、心理、疾病和社会等因素有关。强肾片药物作用可能与其具有一定的类雄性激素样作用、调节内分泌有关。
[0173]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发
明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.一种强肾片，其特征在于，所述强肾片的药物活性成分包括鲜鹿茸提取物，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，丹参醇提取物，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，和人参茎叶提取物。2.如权利要求1所述的强肾片，其特征在于，所述鲜鹿茸提取物，其制备方法包括：以鲜鹿茸为原料，采用研磨、高压匀质分散、冷冻干燥制成鲜鹿茸提取物。3.如权利要求2所述的强肾片，其特征在于，制备方法包括：以鲜鹿茸为原料，先将鲜鹿茸斩碎成直径约为2-5mm的粗颗粒，加入1～3倍量水(优选为1.5倍量水)，研磨，研磨温度控制在38-41℃，得到浓稠浆液；浆液先经分散机处理后，再经过匀质处理，制得纳米分散液；将纳米分散液先预冻(-25℃～-40℃)后，保持-25℃～-30℃1.5～3小时(优选2小时)，抽真空至40-60pa，然后升温至搁板温度为-20℃，维持10-13小时(优选12小时)，再升温至搁板温度为-10℃，维持5-6小时(优选为6小时)，至升华完成，再将搁板温度升至40℃，直至解析完成，出料得到冻干粉，即为鲜鹿茸提取物。4.如权利要求1所述的强肾片，其特征在于，牡丹皮和山药超微粉碎提取物，其制备方法包括：将牡丹皮和山药经超微粉碎制成超微粉。5.如权利要求1所述的强肾片，其特征在于，丹参醇提取物，其制备方法包括：将丹参加入乙醇做溶剂，浸渍处理后收集渗滤液，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，低温干燥，粉碎即得；优选的，料液比为1:5～15(1:10，w/w)，所述乙醇为55％乙醇，浸渍处理时间为10～15小时(优选12小时)，以1～5ml/min(优选3ml/min)收集渗滤液；所述低温为60℃以下。6.如权利要求1所述的强肾片，其特征在于，山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻和盐杜仲的水提取物，其制备方法包括：将于山药、山茱萸、熟地黄、枸杞子、补骨脂、桑椹、益母草、茯苓、泽泻、盐杜仲共十味药，加水煎煮两次，第一次加8-10倍水(优选为10倍水)，提取1-2h，第二次加6-8倍水(优选为8倍水)，提取1-2h，过滤，合并提取液，静置；取上清减压浓缩至稠膏，低温(60℃以下)干燥，粉碎。7.如权利要求1所述的强肾片，其特征在于，人参茎叶提取物，其制备方法包括：取林下山参叶，切段，加水煎煮2次，第一次加水量控制为1:14～16(优选为1:15)，煎煮2～3h，第二次加水量1:8～10(优选为1:10)，煎煮1～2h，煎液纱布滤过，合并滤液，浓缩，通过大孔吸附树脂柱洗脱，后直接离子交换树脂脱色，收集并合并洗脱液，滤液浓缩至清膏，干燥，粉碎，得人参茎叶提取物；优选的，过大孔吸附树脂柱洗脱具体程序为：控制上药量为15～18g:20～24ml(优选为16g:20ml，药材量：大孔树脂体积)，调节ph至8～11(优选ph为10.71)水洗脱至无色，先用20％乙醇洗脱，再用60％乙醇洗脱；优选的，所述大孔吸附树脂优选为d101型；优选的，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂，进一步优选为弱碱型d941阴离子交换树脂。8.权利要求1-7任一项所述强肾片的制备方法，所述制备方法包括：将各药物活性成分混匀合并，加入药学上可接受的辅料压片即得。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在压片后进行包糖
衣或薄膜衣，即得强肾片。10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括淀粉、蔗糖和硫酸钙。
技术总结
本发明提供一种鲜鹿茸制备强肾片的方法，本发明中以鲜鹿茸作为原料，先采用高压均质技术，在有效保持鲜鹿茸的营养成分的基础上达到热杀菌同样的效果，杀灭鲜鹿茸自身生物酶、细菌等微生物，防止其腐败，而且经高压均质后，提高了产品稳定性。同时通过对强肾片中其他原料提取制备工艺的改良，减少原料药材的浪费，并有效提升药品品质。有效提升药品品质。有效提升药品品质。


技术研发人员：谭燕妮 汪巍 罗红 李国栋 苑鹏翀
受保护的技术使用者：辽宁上药好护士药业（集团）有限公司
技术研发日：2019.12.30
技术公布日：2021/7/15