本发明涉及生物医药免疫疗法领域，尤其涉及一种人4igb7-h3的突变编码基因及其调节免疫的应用。
背景技术：
正性/负性协同刺激信号(又称共刺激信号，co-stimulatorysignals)之间的有序调节达到的动态平衡在机体抵抗外来抗原的入侵以及防止自身免疫性疾病的发生中起着重要的作用。t淋巴细胞(简称t细胞)的活化或增殖依赖于正性/负性双重信号，其对t细胞抗原特异性的有效激发以及免疫效应适时中止是必须的。免疫调节失去平衡、不管抑制或者过度激活，都属于免疫异常，从而影响机体的免疫应答，引起的疾病即为各种免疫性疾病，包括肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等。另一方面，t细胞活化与增殖依赖于双信号：一是抗原呈递细胞(apc)呈递的抗原肽-人类白细胞抗原(hla)复合物，二是共刺激信号(第2信号)。apc呈递的抗原肽-人类白细胞抗原(hla)复合物由特殊t细胞抗原受体(tcr)识别，并将信号传递给t细胞，该信号对t细胞活化是必需的，但不引起t细胞增生和分泌细胞因子。共刺激信号为t细胞抗原特异性激活所必需，启动、维持并调节活化级联反应决定了t细胞是活化增殖、抑或转变为无反应状态(anergy)甚至凋亡(apoptosis)。双信号学说(two-signalmodel)的提出，解释了成熟外周b细胞如何识别抗原，以及t细胞如何获得来自于apc呈递的抗原肽-主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplexi，mhc)信号，因此共刺激信号已经成为人们研究的热点。共刺激信号为抗原(ag)非特异性，除影响t细胞的活化与增殖外，还直接影响细胞因子的产生。共刺激分子在肿瘤免疫中起重要作用。研究发现大多数肿瘤细胞表达mhc-1类分子和肿瘤ag，是潜在的apc，但免疫原性较弱，因为其不表达或低表达b7-1，故难以诱导肿瘤特异性t细胞激活，这是肿瘤逃避免疫监视的重要原因之一。因此，可以通过增加或增强共刺激信号，达到治疗肿瘤的作用。
由此可见，肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生、侵袭及转移的重要机制。由于肿瘤细胞通常不能提供有效的抗原信号，自身具备抵抗免疫效应细胞攻击的能力，或者机体存在免疫应答缺陷及免疫抑制，这些情况均导致了肿瘤细胞逃避机体的免疫监控。在这一过程中，协同刺激分子(又称共刺激分子)及其调节网络发挥着重要作用。协同刺激分子是t淋巴细胞活化过程中一类重要的调节分子，共刺激分子与其受体或配体作为共刺激信号，在t、b细胞活化、辅助t细胞分化、信号转导及效应细胞的细胞因子分泌过程中起重要作用。协同刺激分子主要分为b7/cd28和tnf/tnfr两个超家族。经典的b7/cd28信号途径主要以协同刺激的形式来调节初始t细胞的活化。然而，新近发现的一些b7家族新成员亦可通过作用于活化的t细胞，对免疫应答起到负性调控作用。b7家族属免疫球蛋白类，为50000～70000d的跨膜糖蛋白，b7免疫蛋白家族的成员包括b7-1、b7-2、b7-h1(即pd-l1)、b7-h2、b7-h3和pd-l2。它们结构相似均可在机体免疫过程中作为共刺激信号，参与t、b细胞的活化和机体免疫。因此，b7家族在肿瘤治疗、器官移植和自体免疫病的治疗方面有重要作用，在基础研究方面则可以用于t、b细胞分化、活化机制、抗原提呈、共刺激机制、免疫耐受、移植排斥反应和自体免疫等的研究。
b7-h1、b7-h3就是其中两个重要的负性调控协同刺激分子。陈陆俊等首次报导了负性协同刺激分子b7-h1、b7-h3在结直肠癌中的表达及其临床意义(陈陆俊，苏州大学硕士学位论文，2009，协同刺激分子b7-h1和b7-h3在结直肠癌中表达的临床意义及调控机制)，证实它们在肠癌的发生发展中发挥重要作用并负性调控t淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润，检测b7-h1、b7-h3分子可作为肠癌诊断和预后判断的重要生物学指标。同时，肿瘤微环境中的细胞因子ifn-γ和tnf-α对肿瘤细胞表达协同刺激分子b7-h1、b7-h3起到重要的调控作用。b7-h3分子可通过膜型和可溶性(又称sb7-h3)两种形式在肠癌的肿瘤免疫逃逸过程中发挥作用。
人b7-h3，也称为cd276，是属于b7-cd28途径的免疫检查点分子。b7-h3是一种i型跨膜蛋白，在小鼠中由9号染色体编码，在人类中由15号染色体编码。b7-h3作为b7家族的最新成员，mrna广泛存在于非淋巴组织，在许多淋巴器官如脾、淋巴结、胸腺、婴儿的肝和胸腺也有表达。此外，部分肿瘤细胞株如黑色素瘤g361、子宫颈腺瘤、helas3、慢性髓淋巴瘤k562、肺癌a546和结直肠腺癌sw480中，b7-h3的mrna也有表达。其受体在活化的t细胞表面可被诱导表达，b7-h3对cd4 和cd8 细胞的生成均具有增加作用，并能诱导ctl产生，并可选择性地增加ifn-γ的生成，参与t、b细胞的活化和机体免疫，在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用(suhwk,etal.theb7familymemberb7-h3prefeerntialydown-regulatesthelpertype1-mediatedimmuneresponses[j].natimmunol,2003,4(9):899-906.)。b7-h3不能与ctla-4icos和pd-1结合，表明b7-h3有受体或配体，但目前还没有分离到。
在人类中，b7-h3基因具有四个ig样重复，这些重复可以交替剪接以产生包含四个ig样结构域(4ig)或两个ig样结构域(2ig)的蛋白质，即异构体4igb7-h3(或b7-h3b)和2igb7-h3。4igb7-h3带有两个拷贝的igv-igc结构域，为人大部分细胞和组织中的主要表达形式，其胞外段两对vc之间碱基重复率为98％，是2igb7-h3基因复制的结果。孙静等(孙静，苏州大学博士学位论文，2010，协同刺激分子b7-h3两种异构体的基因演化及其生物学功能差异的研究)根据b7-h3分子2种异构体在不同物种中的分布及其基因复制模式的研究、人2igb7-h3和4igb7-h3蛋白质的空间结构模拟及其受体表达分析、及人2igb7-h3和4igb7-h3生物学功能差异研究等发现：1、4igb7-h3是2igb7-h3基因复制的结果，除表达于人类外还可表达于豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊猫、蝙蝠及高级灵长类动物如猩猩、猴体内；2、人2igb7-h3和4igb7-h3两种蛋白质具备不同的空间构象；3、活化的t细胞上可表达两种受体与b7-h3的2种异构体相结合；人2igb7-h3与小鼠b7-h3与刺激性受体相结合，发挥促进t细胞的活化与增强单核细胞的功能；而人4igb7-h3可与抑制性受体结合，对t细胞的活化具有抑制作用。
在人4igb7-h3分子“pqrspt”基序的生物学特性的研究发现在外显子复制过程中产生的保守性氨基酸“pqrspt”可成为人4igb7-h3不能形成可溶性形式及对活化t细胞产生抑制作用的重要基序。蛋白质建模发现氨基酸高度重复的2种异构体具备不同的空间构象，融合蛋白结合实验推测其可结合不同的受体发挥生物学功能。体外实验对活化t细胞和单核细胞的作用证实了之前的实验结果。人2igb7-h3与小鼠b7-h3基因可促进活化t细胞的增殖，增强单核细胞的作用；人4igb7-h3主要表达于抗原递呈细胞中可发挥抑制t细胞活化的生物学功能。
综上，人b7-h3在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用，且其异构体2igb7-h3与4igb7-h3在功能上相互配合，增加了该信号通路的重要性和复杂性，且由于b7-h3受体或者配体尚未被发现，因此关于其功能学研究的报道还存在很大的争议。围绕b7-h3两个异构体开展深入研究对揭示共刺激分子在免疫应答中的精确调控具有重要的生物学意义。而提供2igb7-h3与4igb7-h3的各种突变体及功能研究，也为上述b7-h3的功能研究提供新途径，但目前尚未有4igb7-h3的突变体或4igb7-h3的突变编码基因的报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种新的人4igb7-h3的突变编码基因，比野生型4igb7-h3基因具有增强的生物功能，为抑制过度或异常激活的免疫特别是t淋巴细胞介导的细胞免疫及t淋巴细胞的发育、或与功能增强的2igb7-h3突变体的配合提供一种新的技术手段；尤其是通过新的人4igb7-h3的突变编码基因、其编码的蛋白或其受体或配体、相关的例如rna分子等药物或含其的药物组合物来干预免疫逃逸，从而调节或改善受试者的免疫响应；同时提供在调节免疫的应用例如其在制备预防或治疗恶性肿瘤和传染性疾病的免疫治疗药物、疫苗以及缓解过敏药物等中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种人4igb7-h3的突变编码基因，其中，所述人4igb7-h3的突变编码基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。
众所周知，dna是绝大多数生物的遗传物质，dna携带的遗传信息、dna复制、dna修复等过程对维持染色质稳定和基因表达、调控具有重要作用；按照中心法则dna转录为mrna，并翻译为蛋白质，执行相应的生理功能。一方面，细胞内mrna的转录在时间和空间上受到了多层次的精细调控；另一方面，最新实验研究发现了细胞内另一反馈调节机制，即rna通过调控mediator的相分离对转录过程进行反馈调节。基因(dna分子)最主要的功能是编码功能性蛋白质产物或rna产物。其中，蛋白质产物可以是大分子的结构蛋白、蛋白酶、蛋白质聚合体、核孔复合物(npc)等，也可以是氨基酸、多肽(多肽链)等；rna产物则可以是核酶和trna、rrna、mrna等。虽然之前技术显示蛋白质折叠等蛋白质二级以上结构主要由一级结构中的氨基酸序列决定，但最新的研究例如大肠杆菌中的氯霉素乙酰基转移酶的同义突变研究则显示基因层面对于蛋白质二级以上结构可能也有影响；另一方面，一级结构氨基酸序列相同的蛋白质构象也有可能不一样，类似于小分子化合物有手性，大分子也会有不同的空间构象，且可能具有不同的活性。而本发明涉及基因层面，故可能对于中心法则中的上述rna、蛋白质等物质及物质结构，基因表达、转录等属性，以及基因药物等应用方面均能产生影响。
根据本发明，所述的突变编码基因属于外显子序列，较佳地用于转录mrna，于5’端第2142位点进行了杂合突变c>t。突变通常分为同义突变和错义突变。经典理论认为，错义突变导致蛋白质分子中某一氨基酸为另一氨基酸所替代；而同义突变(使用同义密码子)改变了基因编码序列，却保留了编码的氨基酸序列，由此不会影响到其所翻译的蛋白质的正确折叠过程以及蛋白质的结构和功能，因此被称为“沉默突变”。然而，近期的研究证实，罕见的同义密码子往往比普通密码子翻译得慢，其改变了核糖体合成蛋白质的速度，由此不仅会扰乱蛋白质折叠，导致更容易降解的结构形成，造成细胞生长缺陷。越来越多的研究表明，同义突变可以通过多种机制改变蛋白质水平、翻译准确性、翻译后修饰、分泌效率和蛋白质的最终折叠结构，从而显著改变体内蛋白质进而影响细胞的功能。因此，同义突变的研究对有效的蛋白质设计和与同义突变相关疾病的治疗将产生广泛的影响。
如上所述，本发明的突变编码基因可能对于4igb7-h3的二级、三级蛋白质构象产生影响，而目前4igb7-h3在免疫调节中作为受体还是配体作用尚未有定论。故为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供如上所述的突变基因编码的蛋白或其受体或配体；其中，当本发明突变基因编码的蛋白为受体时，与其特异性结合的为配体；而当本发明突变基因编码的蛋白为配体时，与其特异性结合的为受体。优选地，所述蛋白的第一个c样结构域末端包含pqrspt基序，该基序可能是人4igb7-h3不能形成可溶性形式的一个重要基序。所述蛋白可为膜型蛋白。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含如上所述的人4igb7-h3突变编码基因。
优选地，所述重组表达载体为病毒表达载体或原核表达载体或真核表达载体或逆转录病毒载体或腺病毒载体或单纯孢疹病毒。
更优选地，所述病毒表达载体为慢病毒表达载体或腺相关病毒表达载体。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：提供一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包括如上所述的重组表达载体。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五为：提供一种分离的mrna，其中，所述mrna由如seqidno:1所示的核苷酸序列转录而得。优选地，所述mrna为ivtmrna。
本发明所述的体外转录信使rna(invitrotranscriptionmessengerrna,ivtmrna)是在体外条件下以dna为模板转录得到的一种mrna，这种mrna可以指导特定蛋白质的合成，阻止或改变某种特定的疾病。因此，ivtmrna可以作为一种传递遗传信息的潜在新药。这种ivtmrna能够更好地控制转录基因，转录过程与蛋白功能等。ivtmrna可以将特定的遗传信息导入患者的细胞内，快速表达出蛋白质，从而阻止或改变某种疾病。目前，ivtmrna免疫疗法主要应用于三个领域：恶性肿瘤的免疫治疗、治疗传染性疾病的疫苗、缓解过敏的疫苗。
ivtmrna有2条递送途径。一条是将ivtmrna导入患者离体细胞，再将转染的细胞有选择性地导回患者体内。这种方法适用于基因组工程、基因重组、以t细胞和树突状细胞(dendriticcells，dc)为基础治疗恶性肿瘤和传染性疾病的免疫疗法以及一些蛋白替补疗法等。另一条途径是通过多种方式直接递送ivtmrna，包括肌肉注射、真皮内注射、结内注射、静脉注射、皮下注射、气管内滴入和鞘内注射等。这种方法适用于肿瘤、传染性疾病的治疗、治疗过敏的免疫耐受养生法以及其他蛋白替补疗法等。对于疫苗而言，ivtmrna具有的强烈免疫刺激作用和固有的佐剂特性有很多优势，它能够引起有效的抗原特异性细胞和体液免疫应答。
细胞内rna感应器的识别机制和mrna免疫识别结构元件：
ivtmrna通过激活模式识别受体(patternrecognitionreceptor，prr)引起各种下游效应，从而识别病毒rna，引起免疫应答。
在免疫细胞中，toll样受体3(toll-likereceptor3，tlr3)、tlr7和tlr8存在于内体之中。细胞吞噬ivtmrna后能够激活tlr，并且引起干扰素分泌。其中，tlr3用于识别双链rna(double-strandedrna，dsrna)，tlr7和tlr8用于识别单链rna(single-strandedrna，ssrna)。最有效的干扰素诱导剂聚尿苷酸通过tlr7发挥作用。而在非免疫细胞中，大多数干扰素是通过激活细胞质基质受体产生的。另外，细胞质中的rna感应器能够影响免疫刺激作用和mrna的翻译能力。它可以抑制蛋白质翻译，降解rna，直接产生抗病毒活性。ivtmrna发挥药效的部位主要是细胞质。与天然mrna不同，ivtmrna由细胞外进入细胞质，翻译并修饰后产生相应的具有药理活性的蛋白质。在免疫治疗中，ivtmrna的药效取决于编码蛋白的处理加工过程。与内源性蛋白相似，mrna编码产生的蛋白分子会被蛋白酶体降解为肽片段，然后mhc-i类分子将这些肽片段呈递给cd8 t细胞，诱导t细胞免疫应答。一般来说，胞内蛋白不会与mhc-ii类分子结合引起辅助t(helpert，th)细胞应答。但如果将分泌信号导入抗原编码序列，抗原蛋白在分泌信号作用下就可以重新导向细胞外，与mhc-ii类分子结合，从而同时诱导th细胞应答。
由此，为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六为：提供一种细胞，包含如上所述的分离的mrna和rna感应器和/或mrna免疫识别结构元件；较佳地，所述细胞包括免疫细胞和非免疫细胞；更佳地所述免疫细胞包括树突状细胞和淋巴细胞，所述淋巴细胞包括b细胞和t细胞，所述t细胞包括辅助性t细胞、抑制性t细胞、效应t细胞、细胞毒t细胞、迟发性变态反应t细胞、天然t细胞和记忆t细胞；其中，辅助性t细胞分为th1、th2、th17或treg。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七为：提供一种分离的mirna，其中，所述分离的mirna靶向seqidno:1和/或seqidno:2所示的核苷酸。优选地，所述mirna药物靶向seqidno:1和/或seqidno:2所示的核苷酸的第2142位点。所述分离的mirna可以作为本发明突变编码基因或其编码蛋白关联疾病的检测标志物，也可以应用于防治相关疾病例如肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之八为：提供一种靶向药物，所述靶向药物靶向本发明上述人4igb7-h3的突变编码基因，所述靶向药物为反义rna或sirna或环状rna(circrna)或lncrna或shrna等不编码rna(non-codingrna，ncrna)；或者靶向本发明突变编码基因编码的蛋白或其受体或配体、所述靶向药物例如抗体。所述靶向药物可抑制本发明人4igb7-h3的突变编码基因、或其编码蛋白、或该蛋白的受体或配体，干预其生物功能；或者用于检测上述物质。
其中，所述抗体通过在细胞内的内化和摄取情况来进行生物药物抗体的选择和优化。
目前的分子生物学研究显示，在基因表达调控和基因转录等过程中，除了dna，rna也发挥着重要的作用，rna剪接、降解、代谢和化学修饰等都与细胞功能息息相关，每种rna修饰都需要其特异的调控因子，包括修饰酶、去修饰酶和识别蛋白。特别是非编码rna(non-codingrna，ncrna)在细胞各项生物过程中发挥着不可忽视的作用，被喻为生命的“暗物质”，其包括但不仅限于rrna、trna、snrna、incrna、snorna、circrna和mirna等多种已知功能的rna，还包括未知功能的rna。其中，circrna与传统的线性rna不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circrna分子富含mirna结合位点，在细胞中起到mirna海绵(mirnasponge)的作用，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。通过与疾病关联的mirna相互作用，circrna在疾病中发挥着重要的调控作用。由此，靶向本发明突变编码基因、其编码蛋白或其相关mirna的circrna也是诊断或防治免疫性疾病的重要手段。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之九为：提供一种药物组合物，其中，其包括如上所述的人4igb7-h3突变编码基因、所述的蛋白或其受体或配体、所述的重组载体、所述的宿主细胞、所述的分离的mrna、所述的细胞、所述的mirna药物或靶向药物。优选地，所述药物化合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之十为：提供一种如上所述的人4igb7-h3的突变编码基因、所述的蛋白或其受体或配体、所述的重组载体、所述的宿主细胞、所述的分离的mrna、所述的细胞、所述的分离的mirna、所述的靶向药物或所述的药物组合物在制备调节t细胞活性和/或调节t细胞增殖的药物中的用途；进一步地，提供其在制备调节免疫或免疫治疗的药物中的用途；优选地，所述调节免疫或免疫治疗的药物为预防和/或治疗肿瘤、传染性疾病或缓解过敏的药物。
其中，所述调节免疫或免疫治疗的药物为疫苗。
所述肿瘤为胃癌、肠癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、乳房癌和淋巴癌中的一种或多种。
根据本发明，所述的“免疫调节”是指对过度或异常激活的免疫反应进行抑制，而对过低或被抑制的正常免疫反应进行促进或激活。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
转染了本发明人4igb7-h3突变编码基因的hek293t细胞比转染了野生型基因的细胞增殖快，说明突变基因比野生型基因具有更强的生物学功能。换言之，该人4igb7-h3的突变编码基因比野生型基因的生物学功能增强，即突变编码4igb7-h3与抑制性受体或配体结合对t细胞的增殖、活化的抑制作用增强。从而可用于抑制过度或异常激活的免疫、或与2igb7-h3及其突变体的配合调节免疫，在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面有广泛的应用前景。此外，该突变编码基因还可以作为相关疾病的诊断指标，并由此设计有效的疾病干预手段。突变编码基因编码的蛋白或其受体或配体、针对突变编码基因的mrna及含其的细胞、mirna和sirna、抗体等靶向药物也可以用于肿瘤治疗、传染病治疗、缓解过敏、器官移植和自身免疫病的临床应用。
附图说明
图1为构建的含人4igb7-h3的突变编码基因的重组表达载体的质粒图谱；
图2为构建的含编码人4igb7-h3的野生型基因的重组表达载体的质粒图谱；
图3为重组表达载体的流式细胞检测结果：a.含人4igb7-h3的突变编码基因的重组表达载体，b.含编码人4igb7-h3的野生型基因的重组表达载体；
图4为慢病毒感染hek293t细胞的流式细胞检测结果：a.含人4igb7-h3的突变编码基因的慢病毒，b.含编码人4igb7-h3的野生型基因的慢病毒；
图5为野生型和突变编码基因对hek293t细胞增殖效果随时间变化影响的比较；
图6为慢病毒感染jurkat细胞的流式细胞检测结果；
图7为野生型和突变编码基因对jurkat细胞增殖效果随时间变化影响的比较。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1含4igb7-h3野生型编码基因和4igb7-h3突变编码基因的质粒的制备
1、材料和方法
将人工合成的野生型4igb7-h3编码基因(seqidno:2，ncbireferencesequence:nm_001024736.1)和4igb7-h3突变编码基因(seqidno:1)进行pcr后，分别构建到pgmlv-pa7和pgmlv-pa6，并分别以blasticidin和puro为筛选标记。载体以本领域常规技术转化到感受态细胞中，将感受态细胞涂板，倒置于37℃恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)内过夜培养。第二天挑选单克隆，每一种载体克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定，经过比对，重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致，因此质粒构建成功。获得人4igb7-h3野生型编码基因(seqidno:2)及人4igb7-h3(seqidno:1)的突变编码基因。流式细胞实验验证目的基因的表达水平。具体的转化、测序和流式细胞实验验证目的基因的表达水平过程如下。
(1)转化
a.将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。
b.之后于42℃水浴中热击90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。
c.加入500μl不含抗生素的soc培养基于37℃，225rpm振荡培养45min。
d.3000转离心2min，弃掉900μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
(2)测序
每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定，经过比对，重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致，因此质粒构建成功。获得含人4igb7-h3野生型编码基因(seqidno:2)及人4igb7-h3(seqidno:1)的突变编码基因的质粒，分别命名为cmv-4igb7-h3(cd276)wt-pgk-puro(11,459bp，质粒图谱见图2，以下简称4igb7-h3(cd276)wt质粒)和cmv-4igb7-h3(cd276)mt(c.c2142t)-pgk-blasticidin(11,267bp，质粒图谱见图1，以下简称4igb7-h3(cd276)mt质粒)。
(3)流式细胞实验验证目的基因的表达水平
细胞：hek293t；dmem 10％胎牛血清(gibico)；hgtransgenereagent(吉满生物科技)；0.25％trypsin(gibico)；高纯度质粒抽提试剂盒(qiagen)；荧光显微镜(olympus)；异丙醇；流式抗体；生物安全柜(thermo)；co2培养箱(thermo)，bdfacscalibur流式细胞仪。
a.过表达质粒瞬时转染靶细胞
a.将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25％胰酶(gibico)消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔5×105个细胞接种于35mm培养皿(上海前尘生物)中；
b.培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率80％左右时，进行转染实验；
c.转染2h前换液为新鲜的培养基。
d.转染
取无菌的1.5mlep管，转染体系按下表：
混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于co2培养箱中培养。
b.通过流式抗体细胞染色检测目的基因的表达
a.转染72h后，吸除上层培养基，适当pbs清洗细胞，后加入适当胰酶消化、终止。使用血球计数板计数，调整细胞密度至1×106cells/ml，以每管100μl的细胞液分装到流式管中；
b.加入适当体积荧光标记的一抗到已经准备好的细胞悬液里，4℃避光孵育20min；
c.加入1ml的pbs清洗细胞，300×g离心5min，小心吸除上清，重复此步骤1次；
d.用300μlpbs重悬细胞；
e.流式细胞仪分析。
结果：如图3所示，经流式验证，4igb7-h3(cd276)wt质粒和4igb7-h3(cd276)mt质粒与对照组相比，表达量升高，启动子正常启动，有过表达效果，由此说明4igb7-h3(cd276)wt表达质粒和4igb7-h3(cd276)mt表达质粒构建成功，可以进行后续的病毒包装。
实施例2慢病毒的包装和病毒滴度的测定
细胞株：hek293t，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为dmem(含10％fbs)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株：大肠杆菌菌株dh5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
慢病毒包装系统：将构建成功的慢病毒重组质粒和包装质粒采用qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取。所得的质粒dna溶于无菌的te中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒dna的a260/a280在1.8～2.0之间。
一、慢病毒包装
1)hek293t细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％～80％时准备转染。
2)转染前换液：转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿。
3)转染：取无菌的1.5mlep管或15ml离心管，转染体系按下表：
混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于co2培养箱中培养。
4)加enhancingbuffer：转染10～12h后，均匀滴加100×enhancingbuffer促进转染，120μl/皿。
5)换液：转染18～20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的细胞培养基继续培养。
6)病毒收集：换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，4,500×g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃，4,500×g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4,500×g，离心20min，此时滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。
7)病毒分装与保存：将病毒分装后保存于-80℃。
二、lentivirus滴度测定
样品制备：将hek293t细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10％fbs的细胞培养基。第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔2×105细胞接种12孔板，37度培养过夜，感染时细胞长至20～40％的融合密度；感染前换液，感染前1～2h将需要感染的细胞换新鲜的培养基，0.91ml每孔，polybrene浓度为1μg/ml。第二天，对12孔板当天转染时，将保存于-80度冰箱中病毒液冰浴融化，用含有10％fbs的细胞培养液进行梯度稀释。选取所需的细胞孔，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90μl加入每孔细胞中，放入37度的细胞培养箱中过夜培养；已知滴度的对照病毒加入1-5号稀释液，待测样品加入1号和2号稀释液。第三天，去除含慢病毒的培养基，加入1ml的完全培养基；4天后，抽提rna准备做rt-qpcr。总rna根据本领域常规手段进行提取。
反转录cdna
a)取一灭菌的无rna酶的eppendorf管，每个样本加入如下组分得到mix1。
b)轻轻混匀后，25℃孵育10min。
c)42℃孵育60min。
d)85℃孵育5min终止反应。所得到的cdna保存在-20℃备用。
real-timepcr检测：目的基因的检测用引物序列(5’-3’)：
内参基因的检测用引物序列(5’-3’)：
pcr体系中各组分的体积如下：
pcr反应条件：
结果：
上表说明，转染野生型基因的慢病毒和转染突变编码基因的慢病毒滴度基本相同，可以用于后续的体外效果比较的平行试验。
实施例3突变体和野生型hek293t细胞体外效果的比较
一、慢病毒感染靶细胞
第一天，以合适的比例接种靶细胞hek293t(购自上海中科院细胞库)于培养皿中。
第二天，感染前，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mlpolybrene的新鲜培养基按合适的moi值稀释病毒原液，吸除对照组和处理组原有的培养基，含有慢病毒阴性对照(nc-)稀释液加到对照组细胞中，含有慢病毒液稀释液加到处理组细胞中。
第三天，更换培养液，在感染16h后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液。
第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，细胞基本稳定(4igb7-h3(cd276)wt稳转株puro全致死浓度1.5μg/ml，维持浓度0.75μg/ml；4igb7-h3(cd276)mt稳转株blast全致死浓度8μg/ml，维持浓度4μg/ml)。
二、流式染色验证基因过表达效果
实验材料：hek293t细胞；培养基；血清(gibico)；抗生素：青霉素和链霉素(penicillin，streptomycin)；胰酶：0.25％trypsin(gibico)；高纯度质粒抽提试剂盒(qiagen)；流式抗体；
实验仪器：co2培养箱(thermo)；荧光显微镜(olympus)；生物安全柜(thermo)，bdfacscalibur流式细胞仪。
1、病毒感染：包装好过表达慢病毒和慢病毒阴性对照感染目的细胞，通过流式抗体染色方法检测过表达载体的过表达效果。
2、通过流式抗体细胞染色检测目的基因的表达
a.细胞直接收在流式管里，细胞吸除上层培养基，加入500μlpbs(1％bsa)清洗细胞，1000rpm，5min，将液体直接倒出，留100μl左右的pbs(1％bsa)，没有100μl直接不足100μl，重悬细胞；
b.加入合适体积的荧光标记一抗到已经准备好的细胞悬液里，混匀(不要用枪头混匀，推动混匀)，4℃避光孵育30-50min；
c.加入1mlpbs(1％bsa)清洗细胞，1000rpm，5min，将液体直接倒出，留300μl左右的pbs(1％bsa)，没有300μl直接补足300μl，重悬细胞。
d.流式细胞仪分析。
hek293t细胞结果如图4所示，经流式验证，4igb7-h3(cd276)wt稳转株和4igb7-h3(cd276)mt稳转株与对照组相比较，表达量升高，有过表达效果，由此说明4igb7-h3(cd276)wt和4igb7-h3(cd276)mt稳转株细胞构建成功。
三、细胞增殖测定
细胞：hek293t，dmem培养基 10％胎牛血清(gibico)；0.25％trypsin(gibico)；荧光显微镜(olympus)；生物安全柜(thermo)；co2培养箱(thermo)；离心机(thermo)；cck-8(fluka)；自动化酶免分析仪(北京天石医疗用品制作所)。
1、第一天，准备4个96孔板，在96孔板中接种细胞悬液(2000细胞每孔)，每组细胞3个复孔。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％co2)。
2、瞬转后，取其中一个96孔板，向每孔加入5μlcck8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。其他3块96孔板在瞬转24h、48h、72h小时后进行同样的操作。
3、将培养板在培养箱内孵育3小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
hek293t细胞实验结果和数据
其中，con代表空细胞，nc代表感染野生型对照慢病毒和突变型对照慢病毒的细胞系，wt代表感染4igb7-h3(cd276)wt野生型慢病毒的细胞系，mt代表感染4igb7-h3(cd276)mt突变型慢病毒的细胞系，wt mt代表同时感染4igb7-h3(cd276)wt野生型慢病毒和4igb7-h3(cd276)mt突变型慢病毒的细胞系。
上表数据的统计学分析结果如下：
wt和mt方差分析
上表中，ss代表离均差平方和，df代表自由度。ms代表均方，f代表f统计量，p-value代表p值，fcrit代表f临界值。
图5进一步显示了上表的细胞增殖趋势。
结论：上述细胞系培养72h后经cck8检测验证，4igb7-h3(cd276)wt稳转株、4igb7-h3(cd276)mt稳转株和同时感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒和4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的细胞系与对照细胞相比，细胞增殖能力增强；4igb7-h3(cd276)wt稳转株与4igb7-h3(cd276)mt稳转株相比，p＝2.37e-8<0.01有显著统计学意义。由此可见，转染了人4igb7-h3的突变编码基因的hek293t细胞比转染了4igb7-h3野生型基因的细胞增殖快，说明突变编码基因在hek293t细胞中比野生型基因具有更强的例如促进增殖的生物学功能。
实施例4突变体和野生型jurkat细胞体外效果的比较
一、慢病毒感染靶细胞
本实施例中，慢病毒感染的靶细胞为jurkat细胞(购自上海中科院细胞库)，感染方法同实施例3。至第五天选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，细胞基本稳定。在jurkat细胞中，4igb7-h3(cd276)wt稳转株puro全致死浓度1.5μg/ml，维持浓度0.75μg/ml；4igb7-h3(cd276)mt稳转株blast全致死浓度7μg/ml，维持浓度3.5μg/ml。
二、流式染色验证基因过表达效果
流式染色验证基因过表达效果时，除了细胞采用jurkat细胞以外，其它条件同实施例3。
jurkat细胞中结果如图6所示，单独感染4igb7-h3(cd276)wt稳转株和4igb7-h3(cd276)mt稳转株与对照组相比较，表达量升高，有过表达效果。同时感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒和4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的细胞系(4igb7-h3(cd276)wt mt)和对照组相比较，表达量升高，也有过表达效果，由此说明4igb7-h3(cd276)wt、4igb7-h3(cd276)mt稳转株以及4igb7-h3(cd276)wt mt稳转株细胞构建成功。
以下为图6中的缩略语说明：
a，jurkat不染：jurkat空细胞，无荧光标记；
b，jurkat：jurkat空细胞；
c，nc染：pgk-puro pgk-blasticidin，感染野生型对照慢病毒和突变型对照慢病毒的jurkat细胞；
d，4igb7-h3(cd276)wt：单独感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒的jurkat细胞；
e，4igb7-h3(cd276)mt：单独感染4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的jurkat细胞；
f，4igb7-h3(cd276)wt mt：同时感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒和4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的jurkat细胞；
jurkatigg：同型对照；
wt-igg：同型对照。
三、细胞增殖测定
同样地，除了细胞采用jurkat细胞以外，其它条件同实施例3对应的实验。
jurkat细胞实验结果和数据见下表及图7：
图7中，jurkat指未转染病毒的空细胞，nc指感染野生型对照慢病毒和突变型对照慢病毒的jurkat细胞系，wt为感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒的jurkat细胞系，mt为感染4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的jurkat细胞系，wt mt(或称杂合型)为同时感染4igb7-h3(cd276)wt野生型表达慢病毒和4igb7-h3(cd276)mt突变型表达慢病毒的jurkat细胞系。
上表数据的统计学分析结果如下：
wt和mt方差分析
上表中，ss代表离均差平方和，df代表自由度。ms代表均方，f代表f统计量，p-value代表p值，fcrit代表f临界值。
图7的结果表明，上述细胞系培养72h后经cck8检测验证，wt mt(即杂合型)稳转株与jurkat细胞以及wt细胞相比较细胞增殖减慢，由此可以表明杂合型对t细胞增殖的抑制性增强；wt mt稳转株与wt稳转株相比，p＝0.000236<0.01有显著统计学意义。
jurkat细胞属于人急性t淋巴细胞白血病细胞系，可模拟t淋巴细胞功能，在t淋巴细胞信号转导、细胞因子和受体表达的体外研究中应用广泛，其体外实验结果揭示突变编码4igb7-h3与抑制性受体结合对t淋巴细胞的增殖的抑制作用增强。由此可推知，本发明的如seqidno:1所示的新的人4igb7-h3的突变编码基因在t、b细胞增殖、活化、辅助t细胞分化，信号转导及效应细胞的细胞因子分泌过程中起重要作用，对肿瘤逃避免疫监视中难以诱导肿瘤特异性t细胞激活的主要原因起到了解决及治疗作用。其在制备基因组工程、基因重组、以t细胞和树突状细胞为基础的治疗恶性肿瘤和传染性疾病的免疫治疗药物、疫苗以及蛋白替补疗法、缓解过敏等中有突出而广泛的应用前景。
sequencelisting
<110>白素梅
<120>人4igb7-h3的突变编码基因及其调节免疫的应用
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<223>编码人4igb7-h3的突变基因
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accaccctgttgctgtagccaa22
1.一种人4igb7-h3的突变编码基因，其特征在于，所述人4igb7-h3的突变编码基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。
2.如权利要求1所述的突变编码基因编码的蛋白或其受体或配体；优选地，所述蛋白的第一个c样结构域末端包含pqrspt基序。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求1所述的人4igb7-h3突变编码基因；优选地，所述重组表达载体为病毒表达载体或原核表达载体或真核表达载体；更优选地，所述病毒表达载体为慢病毒表达载体或腺相关病毒表达载体或逆转录病毒载体或腺病毒载体或单纯孢疹病毒。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的重组表达载体；优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
5.一种分离的mrna，其特征在于，所述mrna由如seqidno:1所示的核苷酸序列转录而得；优选地，所述mrna为ivtmrna。
6.一种细胞，包含如权利要求5所述的分离的mrna和rna感应器和/或mrna免疫识别结构元件；较佳地，所述细胞包括免疫细胞和非免疫细胞；更佳地所述免疫细胞包括树突状细胞和淋巴细胞，所述淋巴细胞包括b细胞和t细胞，所述t细胞包括辅助性t细胞、抑制性t细胞、效应t细胞、细胞毒t细胞、迟发性变态反应t细胞、天然t细胞和记忆t细胞；其中，辅助性t细胞分为th1、th2、th17或treg。
7.一种分离的mirna，其特征在于，所述分离的mirna靶向seqidno:1和/或seqidno:2所示的核苷酸；优选地，所述分离的mirna靶向seqidno:1和/或seqidno:2所示的核苷酸的第2142个位点。
8.一种靶向药物，其特征在于，所述靶向药物靶向如权利要求1所述的人4igb7-h3的突变编码基因，所述靶向药物为反义rna、sirna、环状rna、lncrna或shrna；或者靶向如权利要求2所述的蛋白或其受体或配体，所述靶向药物例如为抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的人4igb7-h3突变编码基因、权利要求2所述的蛋白或其受体或配体、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的宿主细胞、权利要求5所述的分离的mrna、权利要求6所述的细胞、权利要求7所述的分离的mirna或权利要求8所述的靶向药物；优选地，所述药物化合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
10.一种如权利要求1所述的人4igb7-h3的突变编码基因、权利要求2所述的蛋白或其受体或配体、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的宿主细胞、权利要求5所述的分离的mrna、权利要求6所述的细胞、权利要求7所述的分离的mirna、权利要求8所述的靶向药物或权利要求9所述的药物组合物在制备调节t细胞活化和/或调节t细胞增殖的药物中的用途；
进一步地，在制备调节免疫或免疫治疗的药物中的用途；优选地，所述调节免疫或免疫治疗的药物为预防和/或治疗肿瘤、传染性疾病或缓解过敏的药物；更优选地，所述肿瘤优选为胃癌、肠癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、乳房癌和淋巴癌中的一种或多种；
所述药物优选为疫苗。
技术总结