一种基于嵌合P54抗原表位的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及应用的制作方法

一种基于嵌合p54抗原表位的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒p54抗体检测的阻断elisa试剂盒及其应用，适用于非洲猪瘟病毒p54抗体的特异、快速、准确检测。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)感染引起的烈性、高度传染性动物传染病。其急性症状以高热、网状内皮系统出血及高死亡率为特征。家猪和野猪所有品种及各年龄段均易感。钝缘蜱属软蜱，特别是o.moubata和o.erraticus，是asfv的贮存媒介和传播媒介。此前该病仅限于非洲发生，直到上世纪中叶传到欧洲、南美及加勒比海地区，2007年传入东欧并逐渐蔓延至俄罗斯西伯利亚地区。2018年8月3日，我国确诊首例asf疫情。随后该病在全国大范围暴发，并给我国养猪业带来巨大冲击。
3.asf是全球养猪行业的“头号杀手”，强毒株引发的超急性和急性感染死亡率高达100％。由于asfv复杂的生物学特性，目前尚未有效的商品化疫苗，因此通过血清学方法和病原学方法对asf疫情进行监测和诊断变得至关重要。由于国内发生的asf疫情均属急性或亚急性，感染猪只大多急性死亡，而且采取对密切接触猪群进行扑杀等防控手段，因此目前国内大多采用普通pcr和荧光pcr等分子生物学方法对asfv进行检测，血清学方法应用较少。但随着时间的推移，asfv不断突变，国内asf疫情也可能发生变化，隐性感染和耐过猪只不断增多。非洲猪瘟耐过猪有这几种情况出现：血清抗体阴性或阳性，血液抗原为阴性或阳性，其中血液抗原阴性、血清抗体阳性非洲猪瘟耐过猪会间歇性排毒并导致非洲猪瘟阴性猪感染发病，说明抗原检测外，进行抗体检测非常必要。耐过猪和隐性或无症状感染猪的识别关键指标是抗体检测。疫苗尚未上市，但仍有养殖者迫切希望疫苗有突破性进展，一旦疫苗免疫后，除了最重要的生产性能指标，最直接体现免疫作用的方式是抗体检测，这就需要开展asfv血清学检测。研究表明，asfv p54等蛋白具有强抗原性，在感染猪只体内相应的抗体滴度较高，可作为抗原建立相应的血清学检测方法用于asfv的抗体或抗原检测。
4.目前asfv血清学检测方法主要包括间接elisa和阻断elisa。鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验，因此商品化elisa试剂盒都是以原核或真核表达的asfv单个蛋白或多个蛋白包被酶标板，其敏感性和特异性在检测非洲猪瘟病毒抗体水平上有一定的局限性。
5.本发明是通过将asfv p54蛋白抗原表位嵌合入蓝舌病病毒核心样颗粒，以近似病毒结构的形式充分展示asfv p54蛋白抗原表位，并以该嵌合蓝舌病病毒核心样颗粒为包被抗原，以针对该asfv p54蛋白抗原表位的单克隆抗体为阻断抗体，从而建立用于检测非洲猪瘟病毒p54抗体的阻断elisa试剂盒，具有很好的特异性和敏感性。
6.有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于寻求一种安全性高、敏感性好、特异性强、能够快速、简便地检测非洲猪瘟病毒p54抗体的阻断elsia试剂盒。
8.该试剂盒的优点之一是使用了以嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒为包被抗原，提高了检测的敏感性和特异性。
9.为实现上述目的，本发明首先提供一种嵌合p54蛋白抗原表位的重组蓝舌病病毒vp7蛋白，所述vp7蛋白的41
‑
47位柔性序列被替换为ediqfinpyq；
10.在一些优选的实施方式中，所述重组蓝舌病病毒vp7蛋白序列如seq id no.1所示。
11.进一步的，本发明还提供一种嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒，所述核心样颗粒由蓝舌病病毒vp3蛋白和上述重组蓝舌病病毒vp7蛋白组装而成。
12.在一些优选的实施方式中，所述vp3蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。
13.进一步的，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒p54抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包含上述的蓝舌病病毒核心样颗粒；
14.在一些优选的实施方式中，所述酶标板包被有上述的蓝舌病病毒核心样颗粒；
15.在另一些优选的实施方式中，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的单克隆抗体。
16.进一步的，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒p54抗体检测试剂盒，为阻断elisa试剂盒，包括酶标板和酶标阻断抗体；其中，所述酶标板的包被抗原为嵌合有非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的单克隆抗体；
17.在一些的实施方式中，所述p54抗原表位为ediqfinpyq；
18.在一些优选的实施方式中，该抗原表位嵌合在蓝舌病毒vp7蛋白的a41
‑
47位；
19.在一些更优选的实施方式中，所述嵌合后的vp7蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述嵌合后的vp3蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示
20.在一些实施方式中，所述酶标板的包被方法是：将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1
‑
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成1.0
‑
2.0μg/ml进行包被，并用含有1
‑
3％牛血清白蛋白封闭。
21.在一些优选的实施方式中，所述酶标板的包被方法具体是：将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成2.0μg/ml的包被工作液，然后按照100μl/孔加到96孔酶标板，4℃下放置12h，按照200μl/孔加入含有2％牛血清白蛋白的封闭液，37℃封闭处理2～3h，甩干后，待酶标板干燥后2～8℃密封保存。
22.在一些实施方式中，所述酶标抗体为针对非洲猪瘟病毒病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75的单克隆抗体；优选的，所述酶标抗体工作浓度为1:2000
‑
1:4000；更优选的，为1:4000。
23.在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括0.1mg/ml的四甲基联苯胺tmd显色液和2m的硫酸溶液终止液；优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的非洲猪瘟阳性血清；所述阴性对照为无特定病原spf猪血清。
24.进一步的，本发明还提供如下应用：
25.上述的重组蓝舌病病毒vp7蛋白，或上述的蓝舌病病毒核心样颗粒在制备用于检测非洲猪瘟病毒感染或非洲猪瘟疫苗接种后动物抗体水平的试剂盒中的应用；
26.或检测非洲猪瘟病毒感染或非洲猪瘟疫苗接种后动物抗体水平中的应用；
27.或上述试剂盒在检测非洲猪瘟病毒感染或非洲猪瘟疫苗接种后动物抗体水平中的应用。
28.进一步的，本发明还提供一种嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒的阻断elisa的检测试剂盒的制备方法，包括：
29.将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1
‑
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成1.0
‑
2.0μg/ml进行包被，并用含有1
‑
3％牛血清白蛋白封闭。
30.在一些优选的实施方式中，所述酶标板的包被方法具体是：将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成2.0μg/ml的包被工作液，然后按照100μl/孔加到96孔酶标板，4℃下放置12h，按照200μl/孔加入含有2％牛血清白蛋白的封闭液，37℃封闭处理2～3h，甩干后，待酶标板干燥后2～8℃密封保存。
31.进一步的，本发明还提供一种嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒的阻断elisa的检测方法，包括以下步骤：
32.(1)包被缓冲液为0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液，以前述包被液稀释嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒至2μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被12h，pbst洗涤3次；
33.(2)每孔加入200μl含2％bsa的封闭液，37℃封闭2h，pbst洗涤3次；
34.(3)将待检血清按照1：2的比例进行稀释后，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃孵育1h，pbst洗洗涤3次；
35.(4)将hrp标记的针对非洲猪瘟病毒p54抗原表位ediqfinpyq的特异性单克隆抗体进行1：4000稀释后，100μl/孔，37℃孵育45min，pbst洗3次；
36.(5)每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应。
37.(6)酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值。
38.(7)判定标准为：当阻断率pi≥22.78％时判定为阳性，pi≤18.92％时判定为阴性，18.92％＜pi＜22.78％时判定为可疑，需重复检测1次，如果仍低于22.78％则判为血清抗体阴性。
39.相比于现有技术，本发明至少具有如下有益技术效果：
40.(1)本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p54抗体检测的elisa试剂盒。该试剂盒是利用嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒作为包被抗原，核心样颗粒为一种类似病毒空心颗粒，不含病毒核酸基因组，不具感染性，相较于以全病毒或灭活病毒作为包被抗原，最大程度地避免了病毒扩散的风险；而且鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验。本发明为制备非洲猪瘟检测用抗原提供一种新的思路和方法。
41.(2)同时，由于核心样颗粒保持着与真病毒类似的形态，而且每一个核心样颗粒由
780个vp7蛋白与120个vp3蛋白构成，780个vp7蛋白形成的亚单位类似于一件毛刷外衣位于核心样颗粒的外层，因此与以通过原核表达或真核表达获得的非洲猪瘟病毒p54蛋白作为包被抗原相比，核心样颗粒能够更多更好地展示非洲猪瘟病毒p54的抗原表位，从而进一步提升检测的敏感性和特异性。
42.(3)本发明考虑到蓝舌病病毒只对反刍动物比如牛、羊等易感，不会感染猪，所以以蓝舌病核心样颗粒作为载体，不会对非洲猪瘟病毒抗体检测造成影响，因此本发明创新性的采用了蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白组装的clps作为包板载体，实现对非洲猪瘟病毒抗体检测。
43.(4)本发明以酶标的非洲猪瘟病毒p54抗原表位的特异性单克隆抗体作为阻断酶标抗体，进一步提高了检测的敏感性和特异性。
44.(5)本发明通过对构建的检测体系优化，包括多种参数选择和优化，实现有效检测。
45.(6)本发明敏感性试验结果显示，具有良好的敏感性；特异性试验结果显示，与目前常见的猪病原如猪口蹄疫病毒o型、猪口蹄疫病毒a型、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬、猪水泡性口炎病毒、猪瘟病毒、猪塞内卡病毒等均不发生交叉反应。
46.综上所述，本试剂盒采用嵌合有非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒作为包被抗原和以针对非洲猪瘟病毒p54抗原表位的特异性单克隆抗体作为阻断酶标抗体构建的阻断elisa抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中非洲猪瘟病毒的特异性抗体的含量，与进口试剂盒的符合率为100％，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1蓝舌病病毒核心样颗粒示意图与组成；
49.图2 8种重组杆状病毒感染sf9细胞后的western blot检测结果(绵羊蓝舌病阳性血清为一抗)
50.1：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)感染sf9细胞后的表达结果；
51.2：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)感染sf9细胞后的表达结果；
52.3：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)感染sf9细胞后的表达结果；
53.4：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)感染sf9细胞后的表达结果；
54.5：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)感染sf9细胞后的表达结果；
55.6：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)感染sf9细胞后的表达结果；
56.7：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)感染sf9细胞后的表达结果；
57.8：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)感染sf9细胞后的表达结果；
58.9：野生杆状病毒感染sf9细胞后的表达结果(空白对照)；
59.m：蛋白marker；
60.图3 8种重组杆状病毒感染sf9细胞后的western blot检测结果(针对非洲猪瘟病毒p54抗原表位的单克隆抗体为一抗)
61.1：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)感染sf9细胞后的表达结果；
62.2：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)感染sf9细胞后的表达结果；
63.3：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)感染sf9细胞后的表达结果；
64.4：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)感染sf9细胞后的表达结果；
65.5：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)感染sf9细胞后的表达结果；
66.6：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)感染sf9细胞后的表达结果；
67.7：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)感染sf9细胞后的表达结果；
68.8：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)感染sf9细胞后的表达结果；
69.9：野生杆状病毒感染sf9细胞后的表达结果(空白对照)；
70.m：蛋白marker；
71.图4 8种重组杆状病毒感染sf9细胞后蔗糖梯度离心的western blot检测结果(绵羊蓝舌病阳性血清为一抗)
72.1：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
73.2：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
74.3：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
75.4：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
76.5：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
77.6：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；；
78.7：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
79.8：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
80.9：野生杆状病毒感染sf9细胞后的表达结果(空白对照)；
81.m：蛋白marker；
82.图5 8种重组杆状病毒感染sf9细胞后蔗糖梯度离心的western blot检测结果(针对非洲猪瘟病毒p54抗原表位的单克隆抗体为一抗)
83.1：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
84.2：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
85.3：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
86.4：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果
87.5：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
88.6：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
89.7：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
90.8：rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)感染sf9细胞后的蔗糖梯度离心结果；
91.9：野生杆状病毒感染sf9细胞后的表达结果(空白对照)；
92.m：蛋白marker；
93.图6重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)感染sf9细胞后蔗糖梯度离心产物的透射电镜结果。
具体实施方式
94.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
95.以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
96.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
97.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
98.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
99.本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
100.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
101.如下实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。
102.实例1蓝舌病病毒vp7蛋白结构分析与柔性结构区域的预测
103.蓝舌病病毒核心样颗粒由蓝舌病病毒结构蛋白vp3和vp7组装而成，其60个vp3二聚体(120个vp3蛋白)组装形成直径为55nm的核心样颗粒的内核，260个vp7三聚体(780个vp7蛋白)类似于一件毛刷外衣位于核心样颗粒的外层，结构组成如图1。为此，本发明以vp7蛋白为改造目标。
104.本发明采用garnier－robson法、chou－fasman法和karplus－schulz法等工具对蓝舌病病毒vp7蛋白进行结构分析，以此预测vp7蛋白的柔性结构区域。最终，本发明筛选出8个可能的柔性结构区域，其位置和氨基酸残基序列见表1
105.表1 vp7蛋白的柔性结构区域
[0106][0107]
实例2嵌合非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒vp7氨基酸序列
[0108]
本研究团队对非洲猪瘟病毒p54蛋白二级结构进行分析，确定p54蛋白氨基酸序列中66ediqfinpyq75为保守抗原表位，经ncbi比对分析，几乎所有非洲猪瘟病毒p54蛋白都含该段氨基酸序列；且本研究团队筛选制备获得了针对该段抗原表位的单克隆抗体(p54
‑
2e4号mab)。为此，本发明以ediqfinpyq氨基酸序列分别替换案例1中蓝舌病病毒vp7蛋白的8个可能的柔性结构区域，从而获得8个嵌合非洲猪瘟病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒vp7氨基酸序列，具体替代方式见表2
[0109]
表2替代方式
[0110][0111]
实例3嵌合核心样颗粒的制备与鉴定
[0112]
(1)重组杆状病毒的构建
[0113]
通过基因合成和亚克隆技术，将蓝舌病病毒vp3基因插入至载体pfastbac
tm dual，构建重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3；随后将突变后的vp7基因(rvp7(47
‑
51)、rvp7(78
‑
84)、rvp7(113
‑
119)、rvp7(136
‑
142)、rvp7(155
‑
161)、rvp7(175
‑
179)、rvp7(182
‑
188))和rvp7(233
‑
239)分别插入到载体的另一个多克隆位点中，从而构建获得了8种重组质粒pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)、pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)、pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)、pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)、pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)、pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)和pfastbac
‑
dual
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)。将测序正确的重组质粒转化入dh10bac，通过蓝白斑、菌落pcr进行筛选，获得8种重组杆状病毒质粒bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)、bacmid
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)和rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)。
[0114]
通过转染试剂盒将上述8种重组杆状病毒质粒转染sf9细胞。转染后48h～72h可以观察到明显的细胞病变；转染72h，收集细胞培养上清，即获得8种重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(78
‑
84)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(113
‑
119)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(136
‑
142)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(155
‑
161)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(175
‑
179)、rbac
‑
vp3
‑
rvp7(182
‑
188)和rbac
‑
vp3
‑
rvp7(233
‑
239)。
[0115]
(2)重组杆状病毒的表达
[0116]
在28℃，130rpm条件下，大量悬浮培养sf9细胞；待细胞密度达到2
×
106/ml，5moi接种分别接种前述6种重组杆状病毒，继续培养48h后收集sf9细胞，加入适量的裂解缓冲液，放置4℃过夜，反复冻融3次后，4℃，10000r/min离心10min，收集上清。分别以绵羊蓝舌病病毒阳性血清和针对非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75的单克隆抗体(2e5)为一抗，进行western blot检测。结果见图2和图3。图2为以绵羊蓝舌病病毒阳性血清为一抗的western blot检测结果，该结果显示，8种重组杆状病毒感染细胞后的表达产物均有两条大小在100ku和38ku左右特异性蛋白条带，其大小分别与蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白一致，说明该8种重组杆状病毒均能有效表达蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白；图3为针对非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75的单克隆抗体(2e5)为一抗的western blot检测结果，该结果显示，8种重组杆状病毒感染细胞后的表达产物均有一条在38ku左右能与该单克隆抗体结合的特异性蛋白条带，其大小与蓝舌病病毒vp7蛋白一致，进一步说明该8种重组杆状病毒均能有效表达蓝舌病病毒vp7蛋白，且该蛋白成功嵌合了非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75。
[0117]
(3)蔗糖梯度离心结果
[0118]
为进一步确认，前述8种重组杆状病毒感染细胞后共表达的vp3和嵌合vp7蛋白能否有效组装形成嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒，本发明按照前述方法大量收集前述8种重组杆状病毒细胞裂解上清，并用不连续蔗糖密度梯度超速离心进行纯化。用tris
‑
hcl
‑
nacl缓冲液配置30％和60％蔗糖，依次加入24ml裂解上清液、6ml 30％和6ml 60％蔗糖，于4℃，21500r/min水平转头超速离心3h。收集中间夹层蛋白，并进行western blot检测。并用1％磷钨酸负染液负染后，透射电镜下观察8种重组杆状病毒共表达后是否组装形成核心样颗粒。以btv阳性血清为一抗的western blot结果(见图4)显示，只有重组病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)组出现两条大小在100ku和38ku左右的特异性蛋白条带，与蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白一致；而其他重组病毒组经蔗糖梯度离心后均没有出现特异性蛋白条带；以非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75的单克隆抗体为一抗(5e5)的western blot结果(见图5)显示，只有重组病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)组出现一条大小在38ku左右的特异性蛋白条带，与vp7蛋白一致；而其他重组病毒组都没有特异性的条带出现。同时经负染后，透射电镜检测结果显示，只有重组病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)组能
够观察到大量的典型的核心样颗粒，其他重组病毒组均为观察到核心样颗粒。
[0119]
表3蔗糖梯度离心结果
[0120][0121]
综合重组杆状病毒的表达结果和蔗糖梯度离心结果，虽然前述8种重组杆状病毒均可在sf9中共表达蓝舌病病毒vp3和嵌合的vp7蛋白，但是蔗糖梯度离心结果显示只有重组杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)在sf9细胞共表达蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白可组装形成典型形态的核心样颗粒(见图6)，其他7种重组杆状病毒在共表达后不能组装形成核心样颗粒。由此，本发明成功地筛选到了vp7蛋白的可被嵌合其他蛋白抗原表位的柔性结构区域：47gvtm51，并成功构建一种可嵌合表达非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的昆虫杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)，该病毒感染sf9细胞后，可共表达蓝舌病病毒vp3蛋白和嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的vp7蛋白，两者可组装形成嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的核心样颗粒。
[0122]
上述嵌合非洲猪瘟病毒p54抗原表位的vp7氨基酸序列如seq id no.1所示：
[0123]
mdtiaaraltvmracatlqearivleanvmeilgiainryngltlrediqfinpyqptslaqrnemffmcldmmlsaaginvgpispdytqhmatigvlatpeipftteaaneiarvtgetstwgparqpygffleteevyqpgrwfmraaqvvtpvvcgpdmiqvslnagargdvqqifqgrndpmmiylvwrrienfsmpqgnsqrtlagvtvsvggvdmragriiawdgqavlqihnptqqnamvqiqvvfyismdktlnqypaltaeifnvysfrdhtwhglrtailnrttlpnmlppifppndrdsiltilllstladvysvlrpefaihgvnpmpgpltraiaraaya。
[0124]
蓝舌病病毒vp3氨基酸序列如seq id no.2所示：
[0125]
maaqneqrperikttpylegdvlssdsgpllsvfalqeimqkvrqvqadymtatrevdftvpdvqkilddikalaaeqvykivkvpsisfrhivmqsrdrvlrvdtyyeemsqvgdvitedepekfystiikkvrfirgkgsfilhdiptrdhrgmevaepevlgvefknvlpvltaehramiqnaldgsiiengnvatrdvdvfigacsepvyriynrlqgyieavqlqelrnsigwlerlghrkritysqevltdfrrqdtiwvlalqlpvnpqvvwdvprssianlimniatclptgeyiapnprissitltqritttgpfailtgstptaqqlndvrkiylalmfpgqiildlkidpgermdpavrmvagvvghllftaggrftnltqnmarqldialndyllymyntrvqvnygptgepldfqigrnqydcnvfradfatgtgyngwatidveyrepapyvhaqryirycgidsrelinpttygigmtyhcynemlrmlvaagkdseaayfrsmlpfhmvrfarinqiinedlhsvfslpddmfnallpdliagahqnadpvvldvswislwfafnrsfepthrnemlevapliesvyasels
vmkvdmrhlslmqrrfpdvliqarpshfwkavlndspeavkavmnlshshnfinirdmmrwvmlpslqpslklaleeeawaaandfedlmltdqvymhrdmlpeprlddierfrqegfyytnmleappeidrvvqytyeiarlqanmgqfraalrrimddddwvrfggvlrtvrvkfydarppddvlqglpfsydtnergglayatikyatettifyliynvefsntpdslvlinptytmtkvfinkrivervrvgqilavlnrrfvaykgkmrimditqslkmgtklaaptv
[0126]
实例4基于嵌合蓝舌病病毒核心样颗粒的非洲猪瘟病毒p54抗体检测试剂盒
[0127]
1)嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的核心样颗粒的大量制备
[0128]
以重组昆虫杆状病毒rbac
‑
vp3
‑
rvp7(47
‑
51)按照实例3(2)的方法大量感染sf9细胞，48h后收集并裂解细胞，离心后收集细胞裂解上清，进一步的按照实例3(3)方法通过蔗糖梯度离心纯化获得嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的核心样颗粒，并测定纯化获得的核心样颗粒的浓度，测定结果为10mg/ml。
[0129]
2)辣根过氧化物酶(hrp)标记的针对非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的单克隆抗体的制备
[0130]
将针对非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(hrp)进行偶联，用ph7.4的pbs缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，
‑
20℃以下保存。
[0131]
3)核心样颗粒包被浓度与酶标单克隆抗体的最佳稀释倍数的确定
[0132]
按照棋盘滴定法进行，将实例1纯化获得的嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的核心样颗粒用包被液稀释成0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml,每个浓度在酶标板中横向包被12孔，100μl/孔，4℃过夜。pbst洗涤3次后，加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h；pbst洗涤3次；纵向分别加入1：1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:16000倍稀释的本实验制备的hrp标记的抗ehdv vp7特异性单克隆抗，37℃孵育1h；pbst洗涤3次；加入底物tmb，100μl/孔，室温避光显色10min后，以50μl/孔加入2mol/l h2so4终止反应，用酶标仪读取各孔od
450nm
值。选择od
450
值在1.0左右的抗原浓度与酶标物稀释度为最佳工作条件。结果如表1，抗原包被浓度在1.0
‑
2.0ug/ml时效果较好，酶标单抗稀释度在1:2000
‑
1:4000时效果较好，优选的，最适的抗原包被浓度及酶标单抗稀释度分别为2.0μg/ml和1:4000。
[0133]
表4核心样颗粒包被浓度与酶标单抗稀释度的确定
[0134][0135]
4)最适包被液的确定
[0136]
为确定最佳的包被液，将包被液分别设置为0.05m ph9.6的碳酸氢盐缓冲液(cb)、0.2m ph7.4的磷酸氢盐缓冲液(pbs)、0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液(tb)，按照上述确定的clps包被浓度(2.0μg/ml)进行包被，其余步骤按照前述的操作步骤进行，其中酶标单抗稀释度为，选择od
450
值在最接近1.0的为最佳包被液。结果如表5，0.1
‑
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液效果较好，其中，最适的抗原包被液为0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液。
[0137]
表5最适包被液的确定
[0138][0139]
5)最适封闭液的确定
[0140]
为确定最适封闭液，选择3种常用的封闭液分别为0.5％bsa、1％bsa、2％bsa、3％bsa、2.5％脱脂乳、5％脱脂乳、0.5％明胶、1％明胶、1％兔血清、5％兔血清、1％马血清、5％马血清进行封闭，其余步骤按照前述的操作步骤进行。试验结果见表6，1
‑
3％bsa作为封闭液时，od
450
值在最接近1.0，其中2％bsa效果最好，因此确定封闭液为2％bsa。
[0141]
表6最适封闭液的确定
[0142][0143][0144]
6)待检血清的最佳稀释度确定
[0145]
按照上述优化的最适抗原包被浓度、最适包被液进行包被，最适封闭液进行4℃过夜封闭，洗涤3次后，先分别加入1:2、1：5、1：10、1：20和1：40稀释的非洲猪瘟阳性血清和阴性血清，37℃孵育45min；洗涤3次，加入最佳浓度的酶标单抗，按照上述方法加入显色液，终止液并进行读数，并计算阳性血清的阻断率(percentage inhibition，pi)，pi＝[(阴性血清od
450nm
－检测血清od
450nm
)/阴性血清od
450nm
]
×
100％)，以pi最大时作为最适的待检血清最佳稀释度。结果如表7所示；1：2
‑
1:5稀释血清为较佳稀释，其中1：2稀释血清为最佳稀释。
[0146]
表7待检血清的最佳稀释度确定
[0147][0148]
7)待检血清的最佳孵育时间的确定
[0149]
使用上述确定的最适反应条件，分别检测非洲猪瘟阳性血清和阴性血清各1份，每份血清重复2孔，37℃分别作用30min、45min、60min、90min，其他步骤不变，计算不同作用时间阳性血清的平均pi，以pi最大的作为待检血清的最佳孵育时间。结果见表8，待检血清的最佳孵育时间为60
‑
90min，优选90min。
[0150]
表8待检血清的最佳孵育时间的确定
[0151][0152][0153]
8)酶标单抗的最佳孵育时间的确定
[0154]
按上述最优条件，改变酶标单抗的孵育时间分别为37℃30min、45min、60min、90min，分别检测非洲猪瘟阳性血清和阴性血清，并计算不同条件下阳性血清的平均pi，以pi最大的作为酶标单抗的最佳孵育时间。结果见表9，酶标单抗的最佳孵育时间为45
‑
60min，优选45min效果最佳。
[0155]
表9酶标单抗的最佳孵育时间的确定
[0156][0157]
9)最佳显色时间的确定
[0158]
按照上述最优条件检测非洲猪瘟阳性血清和阴性血清，在加入tmb显色液后，分别
在显色5min、10min和15min时终止反应，计算不同条件下阳性血清的平均pi，以pi最大的作为最佳显色时间。结果见表10，最佳显色时间为5
‑
10min，其中10min最佳。
[0159]
表10最佳显色时间的确定
[0160][0161]
10)基于ehdv核心样颗粒的阻断elisa方法
[0162]
根据步骤1)
‑
9)摸索的阻断elisa最佳反应条件为：
[0163]
在96孔酶标板加入用0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释至2.0μg/ml的ehdv核心样颗粒，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗涤3次；每孔加入200μl含2％bsa的pbst封闭液，37℃封闭2h；pbst洗涤3次；每孔加入100μl以pbst稀释的待检血清(1:2)或标准阳性血清或标准阴性血清，37℃孵育90min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl 1：4000稀释的hrp标记的针对非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位(ediqfinpyq)的单克隆抗体37℃孵育45min；pbst洗涤3次；每孔加入100μl tmb底物，室温避光孵育10min，每孔加入终止液50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
值，计算阻断率pi值。
[0164]
实例5临界值的确定结果
[0165]
按照确定的阻断elisa操作程序检测100份已知非洲猪瘟阴性血清，读取od
450nm
值，结果经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率为11.2％，标准差(s)为3.86％，当阻断率pi≥22.78％时判定为阳性，pi≤18.92％时判定为阴性，18.92％＜pi＜22.78％时判定为可疑，需重复检测1次，如果仍低于22.78％则判为血清抗体阴性。
[0166]
实例6敏感性试验
[0167]
使用按照实例4的方法制备的3批阻断elisa抗体检测试剂盒(2020asf01、2020asf02和2020asf03)，按照实施例4的使用方法对10份非洲猪瘟强阳性血清和40份非洲猪瘟弱阳性血清进行检测，实验结果见表11，本发明的试剂盒共检测出50份，结果表明本试剂盒对50份已知阳性血清的敏感性为100％。
[0168]
表11敏感性试验
[0169][0170]
实例7特异性试验
[0171]
为确定本发明的特异性，用实例4所建立的方法分别于不同时间段包被的酶标板(2020asf01、2020asf02和2020asf03)，并按照实例4的阻断elisa方法分别检测100份健康猪血清、3份猪o型口蹄疫阳性血清、3份a型猪口蹄疫阳性血清、4份猪圆环2型阳性血清、3份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、2份猪伪狂犬阳性血清、2份猪水泡性口炎阳性血清、1份猪瘟阳性血清、1份猪塞内卡阳性血清。
[0172]
试剂盒的特异性检测结果如下表(表12)显示，对100份健康猪血清的检测结果显示，3批试剂盒的特异性均为100.0％。对3份猪o型口蹄疫阳性血清(fmd
‑
o)、3份a型猪口蹄疫阳性血清(fmd
‑
a)、4份猪圆环2型阳性血清(pc
‑
2)、3份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(prrs)、3份猪伪狂犬阳性血清(pr)、2份猪水泡性口炎阳性血清(svd)、1份猪瘟阳性血清(csf)、1份猪塞内卡阳性血清(sv)的检测结果均为阴性，因此3批试剂盒对这8种共20份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
[0173]
表12本发明试剂盒特异性试验结果
[0174][0175]
实例8重复性试验
[0176]
取同一批次包被的酶标板3条和3次不同批次包被的酶标板各1条，用非洲猪瘟阴性血清4份、阳性血清4份进行批内、批间重复试验，计算批内和批间的变异系数。重复性试验结果表明，8份血清在批内和批间试验中的变异系数在5.42％
‑
8.11％之间，均小于10％，证明该阻断elisa检测方法具有良好的重复性。
[0177]
实例9符合性试验
[0178]
用本发明建立的阻断elisa检测方法与商品化试剂盒同时检测了160份临床血清样品，结果如表13所示；结果显示本发明的阻断elisa方法和商品化试剂盒阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总符合率为100％；与商品化试剂盒相比有100％符合率，可用于临床检测非洲猪瘟血清样品。
[0179]
表13阻断elisa检测结果与商品化试剂盒检测符合率
[0180][0181]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

技术特征：
1.一种嵌合p54蛋白抗原表位的重组蓝舌病病毒vp7蛋白，其特征在于，所述vp7蛋白的41
‑
47位柔性序列被替换为ediqfinpyq；优选的，所述重组蓝舌病病毒vp7蛋白序列如seq id no.1所示。2.一种嵌合非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒，其特征在于，所述核心样颗粒由蓝舌病病毒vp3蛋白和权利要求1所述重组蓝舌病病毒vp7蛋白组装而成。3.根据权利要求2所述的蓝舌病病毒核心样颗粒，其特征在于，所述vp3蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。4.一种非洲猪瘟病毒p54抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求2
‑
3任一所述的蓝舌病病毒核心样颗粒；优选的，所述酶标板包被权利要求2
‑
3任一所述的蓝舌病病毒核心样颗粒；更优选的，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的单克隆抗体。5.一种非洲猪瘟病毒p54抗体检测试剂盒，为阻断elisa试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标阻断抗体；其中，所述酶标板的包被抗原为嵌合有非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒；优选的，所述抗原表位嵌合在蓝舌病毒vp7蛋白的a41
‑
47位；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的针对非洲猪瘟病毒病毒p54抗原表位的单克隆抗体；优选的，所述p54抗原表位的单克隆抗体为p54抗原表位为ediqfinpyq的单克隆抗体；更优选的，所述嵌合后的vp7蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。6.根据权利要求4
‑
5任一所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板的包被方法是：将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1
‑
0.2m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成1.0
‑
2.0μg/ml进行包被，并用含有1
‑
3％牛血清白蛋白封闭。7.根据权利要求6所述抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板的包被方法具体是：将嵌合有非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的核心样颗粒用0.1m ph8.0的tris盐酸缓冲液稀释成2.0μg/ml的包被工作液，然后按照100μl/孔加到96孔酶标板，4℃下放置12h，按照200μl/孔加入含有2％牛血清白蛋白的封闭液，37℃封闭处理2～3h，甩干后，待酶标板干燥后2～8℃密封保存。8.根据权利要求4
‑
6任一所述抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为针对非洲猪瘟病毒病毒p54蛋白抗原表位66ediqfinpyq75的单克隆抗体；所述酶标抗体工作浓度为1:2000
‑
1:4000；优选的，为1:4000。9.根据权利要求4
‑
6任一所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括0.1mg/ml的四甲基联苯胺tmd显色液和2m的硫酸溶液终止液；优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的非洲猪瘟阳性血清；所述阴性对照为无特定病原spf猪血清。10.权利要求1所述的重组蓝舌病病毒vp7蛋白，或权利要求2
‑
3中任一项所述的蓝舌病病毒核心样颗粒在制备用于检测非洲猪瘟病毒感染或非洲猪瘟疫苗接种后动物抗体水平的试剂盒中的应用。
技术总结
本发明公开一种基于嵌合有非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位的蓝舌病病毒核心样颗粒的非洲猪瘟病毒P54抗体检测方法及其试剂盒。本发明以嵌合核心样颗粒为包被抗原，以类似原始病毒形态更好地呈现抗原表位，同时以抗原表位特异性的单克隆抗体为阻断酶标抗体，具有更好的特异性和更优的敏感性。本发明安全性高、敏感性好、特异性强、准确度高且操作便捷，与进口试剂盒相比，检测符合率达100％。检测符合率达100％。检测符合率达100％。


技术研发人员：黄超华 花群义 曹琛福 吴江 史卫军 林彦星 林永涛 翁巧玉 曾少灵 杨俊兴
受保护的技术使用者：深圳海关动植物检验检疫技术中心
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29