本发明属于生物育种技术领域，具体涉及与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记、检测引物、试剂盒及应用。
背景技术：
血液生化指标对动物机体的正常生长发育至关重要，能够直接反应动物生理功能，有重要的指示作用。其中血清alp(碱性磷酸酶)在骨骼生长发育过程中发挥着重要作用，主要由肝脏和成骨细胞分泌，能够反映骨代谢的活跃程度，参与骨骼钙化过程，而骨骼能够直接影响动物的经济性状。在机体快速生长发育期，alp水平升高1-2倍。目前，关于alp的研究主要集中在人类疾病上，临床上测定alp主要用于骨骼、肝胆系统疾病的鉴别和诊断，在鸡上的相关研究较少。鸡的腿病严重影响了家禽业的健康发展，其中肢体内外翻畸形(vvd)是常发腿病之一，由基因型效应和环境效应的共同作用来调控。前期研究发现患vvd肉鸡血清中alp显著低于腿部健康鸡，为了维护家禽肢体健康、减少家禽产业经济损失，借助快速、简便、有效的鸡血清alp的分子遗传标记，可以应用于大群体的检测，加快vvd遗传改良和育种进程。
st3gal4在oa患者(osteoarthritis，oa)的软骨组织中高度表达，能够介导软骨细胞外机制的降解、凋亡和增殖。此外，研究发现mir-193b与st3gal4具有靶标关系，且过表达st3gal4会影响cd44唾液酸化，降低其与润滑素的结合能力，介导nf-κb通路的活性。这些研究表明mir-193b/st3gal4轴通过nf-κb途径调节cd44唾液酸化，对oa的发生起着关键作用。在人类疾病的相关研究中发现，st3gal4的产物可以通过影响肝酶浓度，增加患肝硬化、ii型糖尿病和心血管疾病的风险，且st3gal4基因上rs11220462处的snp与胆固醇(t-cho)和低密度脂蛋白(ldl-c)浓度显著相关。血液生化指标中血清alp指标具有中高等遗传力。因此，了解st3al4基因遗传变异与alp的关系可能会为众多与血液生化指标异常引起的相关疾病提供新见解。然而，关于st3gal4基因的研究目前主要集中在人上，在鸡上并未展开st3gal4基因多态性与alp相关的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记，该分子标记包括snp位点1、snp位点2、snp位点3和snp位点4四个完全连锁的多态性位点。
本发明的第二个目的在于提供上述分子标记或其中的至少一个snp位点的应用。
本发明的第三个目的在于提供用于检测上述分子标记的基因型的引物。
本发明的第四个目的在于提供用于检测上述分子标记的基因型的试剂盒。
本发明的第五个目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。
本发明的第六个目的在于提供评价鸡血清碱性磷酸酶水平的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记，所述分子标记包括snp位点1、snp位点2、snp位点3和snp位点4四个完全连锁的多态性位点，构成g-c-a-c和a-t-g-a两种单倍型；
所述snp位点1位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1378位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第139位碱基，多态性为g或a；
所述snp位点2位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1440位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第201位碱基，多态性为c或t；
所述snp位点3位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1528位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第289位碱基，多态性为a或g；
所述snp位点4位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1554位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第315位碱基，多态性为c或a。
上述分子标记或其中的至少一个snp位点的应用，为以下任一所示：
1)在评价鸡血清碱性磷酸酶水平方面的应用；
2)在鸡分子辅助选择育种方面的应用。
优选的，选择snp位点1作为标签snp分子标记，对snp位点1的基因型进行检测，当待测鸡的基因型为gg时，待测鸡为低水平血清alp个体，当待测鸡的基因型为aa时，待测鸡为高水平血清alp个体。进一步优选的，排除gg基因型的鸡个体。
用于检测权上述分子标记的基因型的引物，其核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。
用于检测上述分子标记的基因型的试剂盒，所述试剂盒包含核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物，以及hinfl内切酶。
上述引物或试剂盒的应用，为以下任一所示：
1)在评价鸡血清碱性磷酸酶水平方面的应用；
2)在鸡分子辅助选择育种方面的应用。
评价鸡血清碱性磷酸酶水平的方法，包括如下如下步骤：检测上述分子标记或其中的至少一个snp位点的基因型。
优选的，采用核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物，以待测鸡基因组dna为模板进行pcr扩增，对pcr产物用hinfl内切酶进行酶切，若酶切产物为589bp，突变处碱基为纯合gg型，若酶切产物为451/138bp，则突变处碱基为纯合aa型，若酶切产物为589/451/138bp，则突变处碱基为杂合ga型；当待测鸡的基因型为gg时，待测鸡为低水平血清alp个体，当待测鸡的基因型为aa时，待测鸡为高水平血清alp个体。
优选的，pcr的反应程序为：95℃5min；95℃15s，63℃15s，72℃10s，共35个循环；72℃5min。
优选的，pcr的反应体系为：2×taqpcrmastermix5.00μl，ddh2o3.00μl，p-f0.5μl，p-r0.5μl，dna模板1.0μl。
优选的，酶切反应体系为15ul，包括pcr产物10ul、缓冲液buffer1.5ul以及hinfl0.25ul。
优选的，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物的大小，以判断分子标记的基因型。进一步优选的，所述琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂的质量分数为2.0％，电压为120v，电泳时间为30min。
上述评价鸡血清碱性磷酸酶水平的方法，能够应用于选育高水平alp的鸡个体，其患vvd的几率降低，有利于鸡的生长发育和种质资源改良。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记，所述分子标记包括snp位点1、snp位点2、snp位点3和snp位点4四个完全连锁的多态性位点，构成g-c-a-c和a-t-g-a两种单倍型。本研究利用gbs双酶切简化基因组测序技术对248只哈伯德肉鸡进行基因分型，质控和去除性染色体上的snp后，共余233只鸡的256599个snps。基于以上基因分型数据对该群体的体重、胫长、胫围、胆固醇、甘油三酯、血钙、血磷等指标进行全基因组关联分析，发现鸡st3gal4基因的第2内含子区第1378位碱基存在一个g-a突变，与alp显著相关。然后以471个哈伯德肉鸡为研究对象，对该区域进行pcr扩增、直接测序，发现了4个完全连锁的多态性位点，基因分型后关联分析发现与alp高度相关。
对本发明提供的分子标记或其中的至少一个snp位点的基因型进行检测，能够早期、快速、有效、低成本的预测鸡的血清alp水平和生产性能。本发明提供的分子标记中四个snp位点完全连锁，对任意一个位点分型均可检测alp水平。本发明选中其中一个位点作为标签(snp位点1)，并选择合适的内切酶对该位点进行酶切分型，方便快捷，不需要通过测序即可进行基因分型，可用于鸡的辅助选择和分子育种，在鸡改良育种方面具有广阔的应用前景。
另外，本发明对表型记录详细的f2资源群st3gal4基因第2内含子区第1378位碱基(snp位点1)进行了大规模的snp分型工作以验证以上snp位点的准确性，进一步对snp分型结果与f2资源群经济性状进行关联分析，发现该分子标记与鸡的血清alp水平密切相关。aa基因型群体的alp水平显著高于ga基因型，ga基因型alp水平显著高于gg基因型，a等位基因为优势基因。血清alp(碱性磷酸酶)在骨骼生长发育过程中发挥着重要作用，主要由肝脏和成骨细胞分泌，能够反映骨代谢的活跃程度，参与骨骼钙化过程，而骨骼能够直接影响动物的经济性状。本发明提供了用于检测该分子标记的基因型的引物、试剂盒，为筛选出纯合高alp水平、低vvd患病率的优良鸡品种奠定了基础。
本发明进一步提供了基于st3gal4基因分子标记的鸡血清碱性磷酸酶水平评价方法，能够应用于选育高水平alp的鸡个体，其患vvd的几率降低，有利于鸡的生长发育和种质资源改良，为肉鸡抗病育种工作奠定重要的理论基础，具有很大的经济应用价值和科研价值。
附图说明
图1为连锁不平衡及单倍型分析图谱；
图中，a为基于d'值的连锁不平衡分析模块；b为基于r2值的连锁不平衡分析模块；c为单倍型；模块中的数字为百分比，d'和r2的数值越大，连锁程度越高，无数字的模块d'值和r2值为1。
图2为不同基因型突变位置序列峰图；
图中，a为野生纯合基因型gg；b为突变杂合型ga；c为突变纯合型aa。
图3为hinfl内切酶分析示意图；
图4为三种基因型hinfl酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料。
实施例1与鸡血清alp相关的单倍型域的鉴定
以248只哈伯德肉鸡为研究对象进行全基因组关联分析，通过简化基因组测序对该群体进行基因分型，质控和去除性染色体上的snp后，共余233只鸡的256599个snps。基于以上基因分型数据对该群体的体重、胫长、胫围、胆固醇、甘油三酯、血钙、血磷等指标进行全基因组关联分析，发现鸡st3gal4因的第2内含子区第1378位碱基存在一个g-a突变，与alp显著相关。然后以471个哈伯德肉鸡为研究对象，对该区域设计引物进行pcr扩增、测序，引物序列见表1，pcr的反应程序为：95℃5min；95℃15s，63℃15s，72℃10s，共35个循环；72℃5min。pcr的反应体系为：2×taqpcrmastermix5.00μl，ddh2o3.00μl，p-f0.5μl，p-r0.5μl，dna模板1.0μl。haploview软件分析4个完全连锁的多态性位点(snp位点1-4：475471g>a、475533c>t、475621a>g、475647c>a)。
snp位点1、snp位点2、snp位点3和snp位点4四个完全连锁的多态性位点构成g-c-a-c和a-t-g-a两种单倍型，g-c-a-c单倍型为低水平alp,a-t-g-a单倍型为高水平alp；单倍型域和单倍型如图1所示，关联分析发现与alp高度相关(表2)。
snp位点1位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1378位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第139位碱基，多态性为g或a；
snp位点2位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1440位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第201位碱基，多态性为c或t；
snp位点3位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1528位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第289位碱基，多态性为a或g；
snp位点4位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1554位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第315位碱基，多态性为c或a。
表1st3gal4基因目的区域扩增引物
表2：哈伯德群体中475471g>a突变位点与经济性状的关联分析
注：同一行中，具有不同小写字母(a，b)的值代表p<0.05，具有不同大写字母(a，b，c)的值代表p<0.01。
实施例2鸡血清碱性磷酸酶水平评价方法的建立及验证
该实施例提供了上述分子标记在评价鸡血清碱性磷酸酶水平方面的应用，具体的，提供了一种基于该分子标记评价鸡血清碱性磷酸酶水平的方法：采用核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物，以待测鸡基因组dna为模板进行pcr扩增，对pcr产物用hinfl内切酶进行酶切，若酶切产物为589bp，突变处碱基为纯合gg型，若酶切产物为451/138bp，则突变处碱基为纯合aa型，若酶切产物为589/451/138bp，则突变处碱基为杂合ga型；当待测鸡的基因型为gg时，待测鸡为低水平血清alp个体，当待测鸡的基因型为aa时，待测鸡为高水平血清alp个体。
根据实施例1中的引物序列为模板，在475471g>a突变位置上下游设计引物进行序列扩增和hinfl酶切，该位置碱基为a时则能被hinfl酶切，为g时则不能被hinfl酶切，借此用于分型(如图3)。本实施例中的引物序列同表1，扩增鸡st3gal4基因一段长为589bp的片段。pcr的反应程序为：95℃5min；95℃15s，63℃15s，72℃10s，共35个循环；72℃5min。pcr的反应体系为：2×taqpcrmastermix5.00μl，ddh2o3.00μl，p-f0.5μl，p-r0.5μl，dna模板1.0μl；酶切反应体系为15ul，包括pcr产物10ul、缓冲液buffer1.5ul以及hinfl0.25ul，本实施例中的酶切反应体系见表3。酶切后将15μl酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳120v，30min后，可根据电泳条带位置具体进行分型。
部分实验结果如图4所示，当突变位置碱基为gg基因型时产物大小为589bp，当突变位置碱基为aa基因型时产物大小为451/138bp，当突变位置为ga基因型时产物大小为589/451/138bp。
表3st3gal4酶切反应体系
本发明对st3gal4基因第2内含子区第1378位碱基以表型记录详细的f2资源群为研究对象进行了大规模的snp酶切分型工作验证该snp位点的准确性，进一步对snp分型结果与f2资源群经济性状进行关联分析发现该分子标记与鸡的alp高度相关(表4)。aa基因型群体的alp水平显著高于ga基因型，ga基因型alp水平显著高于gg基因型。
表4固始-安卡f2资源群475471g>a突变位点与血液生化指标关联分析结果
以上结果进一步证实了上述的关联分析结果：本发明在鸡st3gal4基因第2内含子区第1378位碱基的g-a突变(图2)的snp位点1与鸡血清alp水平显著相关，其中等位基因a与高水平alp正相关，等位基因g与低水平alp正相关。血清alp(碱性磷酸酶)在骨骼生长发育过程中发挥着重要作用，主要由肝脏和成骨细胞分泌，能够反映骨代谢的活跃程度，参与骨骼钙化过程，而骨骼能够直接影响动物的经济性状。当snp分子标记的基因型为gg时，待测鸡为低水平alp个体，患vvd的几率大，当snp分子标记的基因型为aa时，待测鸡为高水平alp个体，患vvd的几率降低。当该方法用于育种时，排除gg基因型的鸡个体，能够选育出高水平alp的鸡个体，其患vvd的几率降低，有利于鸡的生长发育和种质资源改良。因此，本发明提供的分子标记，能够能够早期、有效的预测鸡的血清alp水平和生产性能，可以用于鸡的辅助选择育种，在鸡种质资源改良方面具有广阔的应用前景。
实施例3检测引物
本实施例提供了检测实施例1获得的鸡st3gal4基因分子标记基因型的引物，引物核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。
实施例4检测试剂盒
本实施例提供了检测实施例1获得的鸡st3gal4基因分子标记基因型的试剂盒，所述试剂盒包含核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物，以及hinfl内切酶。此外，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。
<110>河南农业大学
<120>与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记、检测引物、试剂盒及应用
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>589
<212>dna
<213>鸡（gallusgallus）
<220>
<221>snp位点1
<222>(139)
<223>n为g或a
<220>
<221>snp位点2
<222>(201)
<223>n为c或t
<220>
<221>snp位点3
<222>(289)
<223>n为a或g
<220>
<221>snp位点4
<222>(315)
<223>n为c或a
<400>1
ccctttccagtccccattccactccagggccacccaaaatccagcctgcagttgggaacg60
cgatgctggcacacacctgaccccaacgaaggagccctgctgcgggctggggttggctcc120
ttaccctcgccccacctgnctcctcgttatctgggtaattaaggctgatgcagtgcagct180
gtggggaaggcagtttctctntccagagagcagaaggggtgctgctgtgcgcggacactt240
ttctctgggaggaattggactttttcttctccaaactgtggggaggacntggaaattggg300
aagtctggggacagngaagggggcagagagcccctgagcacatggtgagcagtgctgggc360
cccgagatcccccagcctcacactgaggctctccctttttccttcaccagaagaattgag420
gatggccccatagccccgcagcccccggagctgctgccccctctgctcgcaccacgtgga480
agaactgtaagtaccgctgggggggcacccgtggggctgacgtggtgggggtctgcgtgt540
gctgctgtgggccactgtagggaaggacccaatggggttacctgacccc589
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>上游引物p-f
<400>2
ccctttccagtccccattcc20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>下游引物p-r
<400>3
ggggtcaggtaaccccattg20
1.与鸡血清碱性磷酸酶水平相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括snp位点1、snp位点2、snp位点3和snp位点4四个完全连锁的多态性位点，构成g-c-a-c和a-t-g-a两种单倍型；
所述snp位点1位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1378位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第139位碱基，多态性为g或a；
所述snp位点2位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1440位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第201位碱基，多态性为c或t；
所述snp位点3位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1528位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第289位碱基，多态性为a或g；
所述snp位点4位于鸡st3gal4基因的第2内含子区第1554位碱基，即seqidno:1所示核苷酸序列5’端起第315位碱基，多态性为c或a。
2.权利要求1所述的分子标记或其中的至少一个snp位点的应用，为以下任一所示：
1)在评价鸡血清碱性磷酸酶水平方面的应用；
2)在鸡分子辅助选择育种方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，选择snp位点1作为标签snp分子标记，对snp位点1的基因型进行检测，当待测鸡的基因型为gg时，待测鸡为低水平血清alp个体，当待测鸡的基因型为aa时，待测鸡为高水平血清alp个体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，排除gg基因型的鸡个体。
5.用于检测权利要求1所述分子标记的基因型的引物，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。
6.用于检测权利要求1所述分子标记的基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示的引物，以及hinfl内切酶。
7.如权利要求5所述的引物或如权利要求6所述的试剂盒的应用，为以下任一所示：
1)在评价鸡血清碱性磷酸酶水平方面的应用；
2)在鸡分子辅助选择育种方面的应用。
8.评价鸡血清碱性磷酸酶水平的方法，其特征在于，包括如下如下步骤：检测如权利要求1所述的分子标记或其中的至少一个snp位点的基因型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示的引物，以待测鸡基因组dna为模板进行pcr扩增，对pcr产物用hinfl内切酶进行酶切，若酶切产物为589bp，突变处碱基为纯合gg型，若酶切产物为451/138bp，则突变处碱基为纯合aa型，若酶切产物为589/451/138bp，则突变处碱基为杂合ga型；当待测鸡的基因型为gg时，待测鸡为低水平血清alp个体，当待测鸡的基因型为aa时，待测鸡为高水平血清alp个体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，pcr的反应程序为：95℃5min；95℃15s，63℃15s，72℃10s，共35个循环；72℃5min。
技术总结