本申请是申请日为2016年4月11日、中国专利申请号为201680021194.0且发明名称为“共熔萃取溶剂，使用所述溶剂、根据共熔生成法进行的萃取方法，和由所述萃取方法产生的萃取物”的中国专利申请的分案申请，并且本申请要求享有申请号为1553092和1562033的法国申请的优先权。本发明大体上涉及：-一种用于萃取植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的共熔溶剂；-所述共熔萃取溶剂用于实施自然生物学化合物萃取方法的用途；-使用所述溶剂萃取自然生物学化合物(如酚类化合物)的方法；-通过实施所述萃取方法而产生的自然生物学液体萃取物；和-所述自然生物学液体萃取物的用途。更具体地说，甜菜碱(三甲基甘氨酸)或甜菜碱水合形式、至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体和水的比例混合物使得本发明的实施成为可能，所述混合物适用于改进从所用生物材料中萃取自然化合物。
背景技术：
：：甜菜碱是首次在甜菜汁中发现的呈三甲基化形式的甘氨酸。这种自然分子凭借其结构和物理化学特性而在化妆品、医药、食品和营养/健康领域中备受关注。特别是其保湿、润肤和增湿特性使得其用于维持化妆品中的水含量以及保持皮肤的最佳水分平衡。这种有利作用归因于特定定位于人类皮肤细胞的界面处。另外，甜菜碱是一种自然渗透溶质，其保护人类细胞(像其保护细胞那样)抵抗渗透应力。当通过饮食摄入或通过营养药物补充时，这种分子通过实现某些肝酶的充分甲基化来起到护肝作用。还已经鉴别出与肝脂质代谢相关的病状是甜菜碱摄入不足的结果，甜菜碱摄入不足可以导致脂肪变性(craig,s.as.，人类营养中的甜菜碱(betaineinhumannutrition)，《美国临床营养学杂志(am.j.clin.nutr.)》，2004，80，539-549)。甜菜碱除其生理学和技术作用之外，还便宜(～10欧元/千克)、来源于生物且无毒性。甜菜碱是在甜菜加工生产蔗糖期间以可观数量产生的主要代谢物，占由此获得的糖蜜的高达30％。考虑到所牵涉到的工业级数量，甜菜碱原料的开发价值很小或无开发价值。用萃取糖之后所得的富甜菜碱甜菜汁除去道路上的冰是这种化合物在极低附加值领域中的多种用途实例之一。因此寻求在小众市场中的新应用。甜菜碱在化妆品行业中作为表面活性剂使用的椰油酰胺基丙基甜菜碱的制备中具有毫无疑问的价值，但是这种化学产品衍生自有机合成。在人造物日益受到贬低的背景下，这种开发途径似乎比以往折损更大。因此，消费者移向更自然选项的欲望所驱动的社会、经济和法规变化已经为在能量输入低(例如低温)的环保工艺中使用自然物质提供了动力。所属领域的技术人员经常遇到的一个问题是所关注的分子，尤其是含有被羟基取代的芳香族核心的自然化合物(酚类化合物、醇类、酚类酸和酯、类黄酮、鞣酸、芪和酚类萜)对热高度敏感。还知道皂素和三萜的糖类部分以及萜类和类胡萝卜素的相关共轭系统能够在超过60-70℃下发生异构化或氧化。甜菜碱的基本特征是季铵基团与羧酸的组合，其特别适于增溶和萃取极性或两亲性物质，具体地说，通过与待萃取的溶质形成氢键和/或离子键来实现萃取。在根据绿色化学和生态萃取原理指导的方法中，有利的是能够将甜菜碱用作活性成分和用作萃取流体与其它组分混合。然而，现有应用中似乎未出现将甜菜碱用于萃取化妆品、医药学或营养学所关注的自然物质，如酚类化合物、抗氧化剂、皂素、类胡萝卜素、萜类或其它物质，究其原因在于甜菜碱在环境温度下呈固体形式存在且因其物理状态而经受不起任何自然物质的萃取。然而，最近化学进展表明，当固体通过精确方式与一种或多种其它特定化合物按适合比例混合配制时，可以使固体达成液体状态。这特别适用于作为化合物混合物的深度共熔溶剂，所述化合物混合物的熔点比其组分在孤立存在时的熔点低得多。其名称取自希腊语“eutektos”，意思是“易熔融”，这个术语首次由英国医师guthrie在1884年使用。abbott等人在文献ep1324979中所述的这些溶剂在环境温度下通常是液体，而组成混合物的化合物在单独考虑时是固体化合物。通过形成共熔混合物来降低熔点的这种现象可归因于分子间氢键的建立，这具有增加化学物质之间的空间体积的作用，从而增强其移动性，使得其呈液态。近年来，已经特别关注自然物质纳入这些共熔溶剂的组合物中的用途，于是称这些共熔溶剂是自然深度共熔溶剂(nades)。其由有机酸、氨基酸、糖类、多元醇、胆碱和尿素组成(choi,y.h.，vanspronsen，dai,y.，verberne,m.，hollmann,f.，arends,i.w.c.e.，witkamp,g.j.，verpoorte,r.，自然深度共熔溶剂是了解细胞代谢和生理学中缺失的环节吗(arenaturaldeepeutecticsolventsthemissinglinkinunderstandingcellularmetabolismandphysiology)，《植物生理学(plantphysiol.)》，2011，156，1701-1705)。这些自然物质凭借如下事实而成为制备共熔混合物的理想组分：其富含于生物质中，其展现宽广的结构多样性，其是可生物降解的，其展现低毒性，其大部分可食用且其是自然的。其具体描述于同族wo2011/55829的文献中。然而，这些自然共熔溶剂对于工业规模的使用来说具有某些缺点。举例来说，所属领域的技术人员已知糖类和氨基酸的同时使用可形成因非酶褐变所致的有气味有色化合物，且这类萃取物不符合化妆品、医药、食品和营养药物市场的行业需求。虽然糖类可以无需与胺组合使用，或反之亦然，但是生物材料能够一方面与糖类搭配，或另一方面与胺搭配，促进非酶褐变反应的引发且进而妨碍了为配制消费品而获得的萃取物的使用。另外，同族专利wo2011/55829中所述的自然共熔混合物中的组分就法规立场来说可能始终就不适合。这特别适用于胆碱和其衍生物，根据欧洲法规n°1223/2009，化妆品中禁止使用胆碱和其衍生物。另一个事实是，在共熔混合物由糖类形成的情况下，相应萃取物的微生物稳定性通常不足以让人设想将其并入常见消费品中，否则储存足够长的时间便会出现腐败菌群或病原性微生物。另外，共熔混合物典型地仅由限定组分按照非常精确的比例形成，这意味着将这类和这一种分子(尽管是自然分子)混合不足以实现混合物熔点的降低，且从结晶的角度来看，预期所述混合物是稳定的(我们理解稳定性是至少一周)。另外，这些溶剂在环境温度下呈现高粘性的缺点(通常高于100cp)。举例来说，氯化胆碱和尿素的混合物(摩尔比1:2)在30℃下具有近似500cp的粘度(abbott,a.p.，capper,g.，davies,d.l.，rasheed,r.k.，tambyrajah,v.，氯化胆碱/尿素混合物的新颖溶剂特性(novelsolventspropertiesofcholinechloride/ureamixtures)，《化学通讯(chem.commun.)》2003，7，70-71)，就萃取产量而言，其不是没有问题，以致其不可能在工业上用作萃取溶剂。就分子相互作用而言，这种高粘度归因于共熔混合物的组分之间存在非常致密的氢键网络，由此降低了这些溶剂中存在的自由物质的移动性。这种粘度还可归因于离子(如果存在)尺寸、分子之间的空间体积小、静电效应和范德华力相互作用(vanderwaalsinteractions)。所有这些因素的组合对使用共熔混合物萃取植物(例如蔬菜)物质的目的构成了障碍，因为需要剪切力使萃取流体处于流动状态且使其渗入期望从中萃取所有或一部分物质的生物材料中，否则不足以实现最佳的萃取。作为推论，共熔混合物中的化学物质的低移动性对于溶解待萃取的物质来说是有问题的，结果引起萃取产量低、能量成本高、萃取时间长和/或溶剂量大。因此，当前似乎未出现使用基于甜菜碱的流体和低粘度共熔溶剂从生物材料中萃取成分或有效成分(如酚类化合物、抗氧化剂、皂素、类胡萝卜素、萜类或其它)的现有解决方案，其中后者还可以起到活性成分或有效成分的作用(我们理解活性成分是具有技术作用的物质，而有效成分是指能够发挥美容、药理学或营养作用的任何物质)。还不断地需要经证实且发现对植物萃取物具有强活性的自然萃取溶剂替代物。这是因为不同溶剂的萃取能力可以不同，这就产生了根据所用溶剂而得到各种/不同健康效益的可能。另外，使用新颖萃取溶剂(如本文所述的共熔溶剂)可以让人发现植物性药材的新颖活性和应用。活性氧种类(ros)对人类疾病的作用就预防疾病而言已经成为广泛研究的对象。抗氧化剂系统和氧化剂(包括ros)产生之间的不均衡所引起的氧化应激似乎与多种多因素疾病相关，尤其是癌症、心血管疾病和炎性病症。这些疾病发展机制通常涉及生理学关键分子(包括蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸)的氧化变异以及基因表达和炎性反应的调节。越来越多的证据表明，除生物体抗氧化剂防御之外，摄入抗氧化剂可以保护重要的生物分子免受氧化性损伤且由此降低与ros有关的许多慢性疾病的风险。暴露于太阳紫外线(uv)辐射是皮肤光致损伤和癌发生的一种致病因素，且迫切需要不同于光子吸收(或与光子吸收协同作用)的改进的分子光防护策略(watson等人，2014)。虽然uvr暴露对真皮细胞外基质(ecm)的组成和架构的时空后果已被充分表征，但是光致衰老的发病机制仍然不明确。若干个标记和路径共存：-ros牵涉到衰老过程-细胞外基质降解-皮肤屏障功能降低-诸如此类近期研究表明，转录因子nrf2(核因子-e2-相关因子2)和蛋白质dj-1协调组织了皮肤基因表达的光防护作用。的确，dj-1的下调减弱了nrf2的核易位(liu等人，2014)。dj-1/nrf2路径明显被细胞激活以对抗氧化应激诱发性损伤且这种路径充当氧化应激的蛋白质细胞标记物，突出显示了已经存在且正在影响细胞的氧化应激。活性萃取物和植物萃取物能够干扰这种路径，且因此，活性萃取物和植物萃取物的使用能够在这种路径激活之前发挥作用以防止氧化应激诱发性损伤。因此，有害细胞信号传导的局部抗氧化剂和抑制剂均可以有效消除表皮和真皮中的特异性uv介导性蛋白质降解的影响。本说明书中对此前明显已出版的文献的列举或论述不一定应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。技术实现要素：本发明是基于精确组合的发现，所述精确组合包含甜菜碱或甜菜碱水合形式和水以及至少一种选自有机酸和/或多元醇的氢键供体，以便在从植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核(且优选植物(例如))生物材料中萃取可对热敏感的行业所关注化合物(优选化妆品、医药或营养化合物)的步骤期间获得协同/增进。为了避免疑问，如本文所用，技术人员将了解术语“植物”意指例如树、灌木、药草、禾草、蕨类和藓类等种类的活有机体，其典型地生长于永久性地点，通过其根吸收水和无机物质，且使用绿色色素叶绿素通过光合成来在其叶子中合成营养。举例来说，术语植物可以指花和蔬菜(例如蔬菜)。在所关注的这些化合物当中，我们尤其可以提及酚类化合物，包括酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、芪和酚类醇，以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂和萜类，包括皂素。更具体地说，所关注的化合物包括酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、酚类醇以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素和萜类，包括皂素。在第一方面中，本发明提供一种用于萃取植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的共熔溶剂，其中所述溶剂是透明稳定的流体混合物，其包含：(a)甜菜碱或甜菜碱水合形式；(b)至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体化合物；和(c)水其条件是所述共熔萃取溶剂不包含任何外源糖和/或胺盐和/或阴离子。如本文所用，技术人员会了解术语“透明”可以意指溶剂是透明的且不含裸眼可见的固体颗粒。如本文所用，技术人员会了解术语“稳定”可以意指在一周内，溶剂内不形成固相(例如结晶相)。如本文所用，技术人员会了解术语“流体”可以意指溶剂展现流动性。举例来说，可以在约10℃到约80℃(如约20℃到约60℃，或约25℃到约45℃)的温度下展现流动性。如本文所用，技术人员会了解术语“外源”可以意指所指定的化合物/组分已经不存在于共熔溶剂内，即无额外贡献。如本文所用，技术人员会了解术语“糖”可以意指所属领域的技术人员已知的任何糖类化合物，其可以包括糖类，如葡萄糖、果糖和半乳糖。如本文所用，技术人员会了解术语“胺盐”可以意指指定具有单独抗衡离子的任何带正电胺。举例来说，术语“胺盐”可以指季铵盐，如胆碱。如本文所用，技术人员会了解术语“阴离子”可以意指任何带负电的物质。举例来说，术语“阴离子”可以指no3-、f-、cl-、br-、i-、bf4-、clo4-、cn-、so3cf3-或coocf3-。在一个特定实施例中，本发明提供一种用于萃取植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的共熔溶剂，其中所述溶剂是透明稳定的流体混合物，其基本上由以下组成：(a)甜菜碱或甜菜碱水合形式；(b)至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体化合物；和(c)水。如本文所用，技术人员会了解术语“主要由…组成”意指本发明的共熔溶剂基本上不含有其它组分，尤其不含已知用于共熔溶剂中的其它氢键供体。在另一个特定实施例中，本发明提供一种用于萃取植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的共熔溶剂，其中所述溶剂是透明稳定的流体混合物，其由以下组成：(a)甜菜碱或甜菜碱水合形式；(b)至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体化合物；和(c)水。在本发明的另一个实施例中，氢键供体化合物可以选自由以下组成的多元醇群组：甘油、赤藻糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、核糖醇、福寿草醇、丙二醇和戊二醇。在本发明的另一个实施例中，氢键供体化合物可以选自由以下组成的有机酸群组：乳酸、苹果酸、顺丁烯二酸、丙酮酸、反丁烯二酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、乌头酸、酒石酸、抗坏血酸、丙二酸、草酸、葡糖醛酸、神经氨酸、唾液酸、莽草酸、植酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、玻糖醛酸、羟基柠檬酸和内酯衍生物。在本发明的一个实施例中，氢键供体不是柠檬酸。在本发明的一个实施例中，甜菜碱(或甜菜碱水合形式)与至少一种氢键供体化合物(多元醇或有机酸)的临界摩尔比是1:1.5到1:3，且优选1:2。在本发明的另一个实施例中，为了获得根据本发明的溶剂而添加到混合物中的水的重量比例是1到50％，且优选15到30％或20到30％。在本发明的一个方面中，共熔萃取溶剂可以具有1:1.5到1:3(如1:2)的甜菜碱或甜菜碱水合形式与至少一种氢键供体比率；和1到50％且优选15到30％或20到30％的添加到混合物中的水比例。举例来说，所述溶剂可以具有1:1.5到1:3的甜菜碱或甜菜碱水合形式与至少一种氢键供体比率；和15到30％的添加到混合物中的水比例。在另一方面中，本发明提供如此前所定义的共熔萃取溶剂用于从植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料中且优选从植物(例如蔬菜)生物材料中萃取自然生物学化合物的用途，所述生物学化合物如酚类化合物，包括酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、芪和酚类醇，以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂和萜类，包括皂素。在另一个实施例中，本发明提供如此前所定义的共熔萃取溶剂用于从植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料且优选从植物(例如蔬菜)生物材料中萃取自然生物学化合物的用途，所述生物学化合物如酚类化合物，包括酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、酚类醇，以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素和萜类，包括皂素。在本发明用途的一个实施例中，植物(例如蔬菜)生物材料可以选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香、垫状卷柏(selaginellapulvinata)、松萝凤梨(tillandsiausnoides)和橄榄叶。在本发明用途的另一个实施例中，植物(例如蔬菜)生物材料可以选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香和橄榄叶。不希望受理论束缚，通过根据本发明的溶剂所得的协同/增进来源于一种自然物理化学现象，其在下文称为“共熔生成”且其相当于共熔混合物的形成，所述共熔混合物是在达到对应于共熔点的混合物的临界比例时产生。共熔点是相图上的点，所述点位于两条液相曲线的交叉点，从而得到一种组成，所述组成的混合物在其最低温度下呈液相。已经完全出乎意料地发现，三种化合物(a)甜菜碱(或甜菜碱水合形式)、(b)氢键供体和(c)水按明确限定的比例(如1:1.5到1:3或1:2)组合使得萃取自然物质有可能按照协同/增进的方式进行。缺乏(a)到(c)之一会导致回收率骤降。这个发现至关重要，原因在于迄今为止，尚无任何已知的理论模型、经验规则或作用机制来据以推断或预测基于甜菜碱的共熔混合物的任何萃取协同作用。至多在同族文献wo2011/55829中提及，大意是深度共熔溶剂通常由按等摩尔比(1:1)存在的两种化合物形成。本发明人已经惊人且出乎意料地表明，甜菜碱(或甜菜碱水合形式):氢键供体的摩尔比为1:1.5到1:3且优选1:2时，系统地达到这个临界点。因此，相图上的临界点对应于萃取混合物的临界组成，在临界组成下，自然物质的萃取效率最佳，这似乎是此前工作迄今皆不能展现的。另外，abbott等人所述的共熔混合物形成机制(同族专利us7183433；abbott,a.p.，capper,g.，davies,d.l.，rasheed,r.k.，tambyrajah,v.，氯化胆碱/尿素混合物的新颖溶剂特性(novelsolventspropertiesofcholinechloride/ureamixtures)，《化学通讯》2003，7，70-71)假定了熔点降低是氢键供体与胺盐的阴离子(带负电离子)之间建立氢键的结果。因此在下文呈现的结果中惊人地发现当不存在外源贡献的阴离子时，熔点的降低得以实现。就利用甜菜碱的两性特征的科学知识而言，这代表着一种进步。虽然许多作者过度关注胺盐，尤其在同族专利文献us7183433所述的共熔混合物和离子性液体中，但是本发明所涵盖的自然共熔混合物系统地包括不含阴离子(外源贡献)的胺，因为共熔生成机制不需要所述阴离子。就萃取组合物而言，本发明公开了按重量比例添加外源水(即，有所贡献且已经不存在于甜菜碱和氢键供体的混合物中)，所述外源水占甜菜碱:甘油和甜菜碱:乳酸二元混合物的1与50％之间，优选15与30％之间或20到30％，所述二元混合物具有1:1.5到1:3且优选1:2的甜菜碱:氢键供体临界摩尔比，以便将粘度降低到与行业用途和共熔混合物名称相容的阈值。具体地说，所属领域的技术人员已知，能够使共熔溶剂的超分子络合物特征形成的氢键因水体积比例大于50％而断裂(guti？rrezm.c.，ferrer,m.l.，mateo,c.r.，delmonte,f.，深度共熔溶剂的水溶液的冷冻干燥：达成自组装结构的深度共熔悬浮液的一种适合途径(freeze-dryingofaqueoussolutionsofdeepeutecticsolvents:asuitableapproachtodeepeutecticsuspensionsofself-assembledstructures)，《朗格缪尔(langmuir)》，2009，25，5509-5515)。使用如本文所定义的含有水、甜菜碱和选自多元醇和有机酸的氢键供体的三元混合物进行的本发明所述萃取方法使得甜菜碱与氢键供体之间的临界共熔生成摩尔比(二元混合物(甜菜碱:氢键供体)和三元混合物(水:甜菜碱:氢键供体)通用的比率)保持在1:1.5到1:3且优选1:2；且使用本发明的萃取方法所得的萃取物内所含的活性物质出现惊人的增加。因此，所述方法能够使活性物质产量倍增高达45倍且凭借在环境温度(如约10℃到约80℃，如约20℃到约60℃，或约25℃到45℃)下呈液态的不同共熔混合物提高了所得色谱分布图的丰富度，且所述不同共熔混合物是基于可按工业量获得的农业来源和/或生物来源自然化合物，如作为糖生产、油化学加工和生物技术的副产物的甜菜碱、多元醇(如甘油)和有机酸(如乳酸)。本发明的萃取方法由以下组成：在大气压下或在压力下，例如在约100到约500kpa的压力下，在20到60℃下，如约25℃到约45℃，在1至5小时(优选2小时)搅拌下，使浸没于共熔溶剂中的经研磨或未研磨生物材料浸软、浸透和/或浸渍。萃取相不涉及共熔萃取溶剂中所存在的任何化合物之间的任何化学转化，所述共熔萃取溶剂相对于生物材料和待萃取的自然物质而言完全呈惰性。举例来说，共熔萃取溶剂中存在的化合物均不与生物材料和待以共价方式萃取的自然物质发生反应；在本发明所述的萃取温度(＜60℃)下，自然物质之间仅发生非共价相互作用。如本文所用，技术人员会了解术语“研磨”可以意指生物材料在共熔萃取溶剂中浸软、浸透和/或浸渍之前已受到机械力以压碎、粉碎或摩擦碎成粉末。如本文所用，技术人员会了解术语“未研磨”可以意指生物材料在在共熔萃取溶剂中浸软、浸透和/或浸渍之前尚未受到任何机械力。通过在此所述的共熔生成法进行的本发明萃取方法经专门开发可在不向萃取流体或液体萃取物中添加外源防腐剂的情况下获得最佳的微生物稳定性。在生物材料于共熔溶剂中浸软、浸透和/或浸渍之后且在过滤和调理操作(例如通过袋式和/或板式过滤器过滤)完成时所得的所述萃取物从微生物学角度发现是稳定的，即，尽管在最初萃取步骤输入的生物材料中存在微生物负荷，但是所得萃取物不包含被视为对人体健康有危险和/或有毒性的微生物负荷。因此，共熔混合物和所得萃取物不含防腐剂，所属领域的技术人员已知防腐剂在某些已确认病例中能够在人体中产生毒性作用，尤其就内分泌干扰物来说。这些溶剂的良好微生物稳定性提供了间接改善其安全的方式，特别是考虑到仅使用无毒性共熔溶剂与然后着手添加潜在有毒抗微生物剂相矛盾的事实。在另一方面中，本发明提供一种根据本发明萃取自然生物学化合物的方法，其包含以下步骤：a.在搅拌的同时，将经研磨或未研磨的生物材料浸没于根据本发明的萃取溶剂中，然后b.使步骤a.中所得的混合物在20与60℃之间的温度下浸软或浸透或浸渍，然后过滤b.所得的萃取产物，借此获得来源于植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的自然生物学液体萃取物。b.中所得的萃取产物可以在c.步骤中使用所属领域的技术人员已知的任何技术过滤。因此，在另一方面中，本发明还提供了一种包含植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的自然生物学液体萃取物，所述液体萃取物是通过或可通过此前所定义的萃取方法或用途来获得。自然生物学液体萃取物可以在使用之前进一步提纯或萃取物可以不经任何进一步提纯即使用。可以使用的提纯实例包括(但不限于)色谱、蒸馏和/或蒸发。在一个特定方面中，本发明提供如本文所定义的自然生物学萃取物和共熔溶剂。典型地，共熔溶剂可以按约0.01到约50重量％或约0.1到约25重量％的量存在。当自然生物学液体萃取物是通过本发明的方法获得时，过滤步骤c.可以去除所存在的全部共熔溶剂。或者，过滤步骤可以让萃取产物内存在残余溶剂。因此，在另一个实施例中，本发明还提供了包含根据本发明的共熔溶剂的自然生物学液体萃取物。典型地，共熔溶剂可以按约0.01到约50重量％或约0.1到约25重量％的量存在。可以利用本发明方法萃取的自然生物学化合物可以包括得自植物和/或动物和/或原核生物材料的酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、芪和酚类醇，以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂和萜类，包括皂素。举例来说，可以利用本发明方法萃取的自然生物学化合物包括得自植物和/或动物和/或原核生物材料的酚类酸和酯、类黄酮、裂环环烯醚萜、酚类醇，以及抗氧化剂、类胡萝卜素、生物碱、脂质、苯丙素类、调味料和调味剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、萜类，包括皂素。在本发明方法的一个实施例中，植物生物材料可以选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香、垫状卷柏、松萝凤梨和橄榄叶。举例来说，植物生物材料可以选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香和橄榄叶。在另一方面中，本发明提供一种自然生物学液体萃取物，其特征在于其所来源的植物(例如蔬菜)生物材料可以选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香、垫状卷柏、松萝凤梨和橄榄叶。举例来说，植物(例如蔬菜)生物材料可以选自番红花、海茴香或含生草。根据本发明的萃取方法特别引人注目之处在于，其对生物材料萃取工艺发挥着协同/增进作用。另外，通过实施所述萃取方法所得的自然生物学液体萃取物增强了所述萃取物中所含的化合物的生物学和/或物理化学活性。举例来说，用樱花获得的结果清楚地表明，使用所研究共熔混合物获得的萃取物在多种多样的生物活性上具有优越性(相较于更多传统溶剂，如化妆品和芳香剂工业中广泛使用的氢化甘油混合物)，如光防护、胶原蛋白合成、消炎作用(tnfα路径)，或uv刺激后的1型基质金属蛋白酶(mmp-1)释放被抑制(防止光致衰老)。用番红花、海茴香和含生草获得的结果证明，与缺乏任何活性的其氢化甘油同系物相比，番红花、海茴香和含生草的共熔萃取物对黑色素合成起着强抑制作用(减少色素沉着的作用)(分别为约55％、33％和36％)。此外，木贼草的共熔萃取物的tnfα抑制(消炎反应)和其抗氧化活性远远优于相同植物的氢化甘油萃取物。这还适用于迷迭香，使用基于甜菜碱的共熔溶剂萃取所诱导的抗氧化活性比使用(1:1)水:甘油混合物重量的方法所产生的萃取物高2倍。另外，实例表明就纤维母细胞模型上的胶原蛋白合成和光防护作用而言，橄榄叶的共熔萃取物优于橄榄叶的氢化甘油萃取物。本发明人已经惊人且出乎意料地发现，使用用于萃取目的的共熔溶剂加强的这些生物学和/或物理化学活性相对来说与相应色谱分布图充分相关。具体地说，通过共熔萃取获得的分布图通常可利用“更多传统溶剂”获得。分布图不仅在定量方面(即萃取物内的特定量的某种分子)有差异，甚至在定性方面有更显著差异。举例来说，虽然传统溶剂通常可萃取的大部分分子存在于共熔萃取物中，然而，后者含有氢化甘油萃取物中缺乏的新活性物质。举例来说，因使用共熔溶剂而首次在樱花中鉴别出咖啡酰葡糖苷(caffeoylglucoside)、绿原酸(chlorogenicacid)和二咖啡酰奎宁酸(dicaffeoylquinicacid)，且在番红花中鉴别出堪非黄酮醇-3-o-乳酰基-槐糖苷(kaempferol-3-o-lactyl-sophoroside)异构体。这些新植物活性物质的发现突显了共熔萃取物的特性(无论其是生物学或物理化学特性)改进，且为利用展现新颖活性的萃取物开辟了新路径。举例来说，樱花的共熔萃取物中所发现的二咖啡酰奎宁酸是1型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)的选择性高效抑制剂，所述1型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)牵涉到获得性免疫缺陷综合症或aids的病因学(robinson等人，人类免疫缺陷病毒整合酶的二咖啡酰奎宁酸抑制剂：抑制人类免疫缺陷病毒整合酶的核心催化域(dicaffeoylquinicacidinhibitorsofhumanimmunodeficiencyvirusintegrase:inhibitionofthecorecatalyticdomainofhumanimmunodeficiencyvirusintegrase)，《分子药理学(mol.pharmacol.)》，1996，50，846-855)。在另一方面中，本发明提供如本文所定义的自然生物学液体萃取物的用途，其用于制造营养药物组合物、人类或动物用的膳食或食物产品、营养补充物、香料、医药、酒类或化妆用配制品，其旨在经口、肠胃外给药，或局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼施药。在另一方面中，本发明提供所述自然生物学液体萃取物的用途，其用于制造营养药物组合物、人类或动物用的膳食或食物产品、营养补充物、香料或调味剂、医药、酒类或化妆用配制品或组合物。举例来说，本发明提供所述自然生物学液体萃取物的用途，其用于制造营养药物组合物、膳食或食物产品、营养补充物、医药组合物，或化妆用配制品或组合物。在另一个实施例中，本发明还提供了液体萃取物用于营养药物组合物、人类或动物用的膳食或食物产品、营养补充物、香料或调味剂、酒类或化妆用配制品中的用途。在另一个实施例中，本发明提供了包含如本文所定义的自然生物学液体萃取物的医药组合物。在另一个实施例中，本发明提供了用于医药组合物中的所定义液体萃取物，且进一步提供了用作光防护、抗光致衰老、减少色素沉着、漂白、抗衰老、抗氧化剂、抗自由基、活性氧种类清除剂、晚期糖基化终产物清除剂、金属蛋白酶抑制剂、消炎剂、皮肤舒缓剂、胶原蛋白合成激活剂、保湿剂、皮肤屏障功能修复剂或细胞粘附和粘聚改进剂的液体萃取物或医药组合物。举例来说，液体萃取物或医药组合物可以用作光防护、抗光致衰老、减少色素沉着、漂白、抗衰老、抗氧化剂、抗自由基、活性氧种类清除剂、金属蛋白酶抑制剂、消炎剂、皮肤舒缓剂、胶原蛋白合成激活剂、保湿剂或皮肤屏障功能修复剂。典型地，在本发明的一个实施例中，本发明的组合物或配制品旨在经口或肠胃外给药，或用于局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼施药。在另一方面中，本发明提供了一种来源于樱花的自然生物学液体萃取物，其用作光防护、屏障功能保护基、抗氧化剂和抗光致衰老剂。举例来说，来源于樱花的自然生物学液体萃取物可以充当光防护剂和抗光致衰老剂。在另一个实施例中，本发明提供一种自然生物学液体萃取物，其来源于由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香、垫状卷柏、松萝凤梨和橄榄叶，所述液体萃取物用作光防护剂、屏障功能保护剂、抗氧化剂和抗光致衰老剂。本文中呈现的数据表明，共熔液体萃取物于水中的配制物例如能够获得0.001％与10％之间、优选在0.01％与1％(v)之间的高水平生物学和/或物理化学活性。本发明中所要求的某些共熔萃取物的活性高于其氢化甘油同系物，即使后者的最终液体配制物的浓度为十倍。对表4中所示的萃取流体的其它组合物进行测试，其通常可形成在环境温度下且当冷或热时结晶的混合物，因此使得从任何生物材料中萃取变得不可能。另外，用柠檬酸测试还表明难以从甜菜碱中获得稳定的萃取共熔混合物。表3表明二元混合物甜菜碱:柠檬酸的组成对介质的宏观外观的影响。虽然与比率20:80相比，50:50或40:60摩尔比可以使结晶相延迟一周之后形成，但是我们注意到这些条件无助于行业开发。在本文实例4中还可以发现，一般以从行业角度看潜在受关注形式呈现且通常包括糖类但不仅仅是糖类的多种共熔混合物在50℃下变为黄色、橙色或褐色，且发生聚合，变得混浊或结晶(表4)。少量混合物在4℃、环境温度和50℃下保持透明液态超过一个月；三元混合物甜菜碱:甘油:水(2:3摩尔比，外加25重量％水)和甜菜碱:乳酸:水(2:3摩尔比，外加25重量％水)形成了流体的一部分，其本身对旨在用于化妆品、医药或食品用途的配制物的颜色无影响。换句话说，萃取流体固有的任何颜色负荷没有添加到已经通过从生物材料中萃取着色物质而赋予的着色。在另一方面中，本发明提供了如所定义的自然生物学液体萃取物，其特征在于其加强了所述萃取物中所含的化合物的生物学和/或物理化学活性。最终，与化妆品、营养药物和医药工业中常用的更多传统溶剂(如水或氢化甘油混合物)相比，通过根据本发明中所要求的共熔生成法应用萃取方法所获得的液体萃取物中的所关注化合物的含量增加。而且，本发明的共熔溶剂和方法还可以与使用例如亚临界水的目前最先进强化萃取技术相媲美或甚至更好。获自大量生物材料的共熔萃取物具有如下潜在应用：光防护、抗光致衰老、减少色素沉着、漂白、抗衰老、抗氧化剂和抗自由基剂、活性氧种类清除剂、晚期糖基化终产物清除剂、金属蛋白酶抑制剂、消炎剂、皮肤舒缓剂、胶原蛋白合成激活剂、保湿剂、皮肤屏障功能修复剂或细胞粘附和粘聚改进剂。举例来说，所得萃取物可以用作光防护、抗光致衰老、减少色素沉着、漂白、抗衰老、抗氧化剂和抗自由基剂、活性氧种类清除剂、金属蛋白酶抑制剂、消炎剂、皮肤舒缓剂、胶原蛋白合成激活剂、保湿剂或皮肤屏障功能修复剂。凭借所述共熔溶剂的萃取能力，所萃取的生物材料可以显现新的生物学特性。举例来说，本发明人已经发现，针对樱花的共熔萃取物所发现的活性可以在光致衰老方面具有防护特性，且可以用作化妆品、营养药物和/或食品药剂。所属领域的技术人员已知，280nm与400nm之间的波长范围内的光辐射已知可诱导人体表皮发生褐变。280nm与320nm之间范围内的辐射(uv-b)引起皮肤出现红斑和灼伤，对自然晒黑产生不利影响。320nm与400nm之间的uv-a射线引起皮肤劣化，表现为弹性丧失且出现早衰，尤其是通过细胞外基质的分解。因此，出于美观和健康原因，因此非常需要控制这些令人不愉快的影响的方式。本发明中所述的樱花萃取物能够用作：(i)控制uv辐射所诱发的炎症反应的药剂；(ii)uv暴露之后的细胞外基质分解抑制剂；和(iii)暴露于uv的细胞的细胞存活保护剂。另外，由于共熔溶剂可食用且无毒性，因此相应萃取物可以按照0.001到20％或0.01到20％、优选0.01到10％或0.1到10％且理想的是0.05到5％或1到5％范围内的并入成品比例直接配制于食品和饮料(用于人类和动物)中，以及化妆品、营养药物、药妆品、酒类、芳香剂(香料和调味剂)和医药产品中。富含溶于共熔混合物中的所关注化合物的液体萃取物也可以通过口服或肠胃外路径直接消费，或通过局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼施药来消费。技术人员将了解，本文中关于本发明特定方面的所有参考文献包括提及本发明的所述方面的所有实施例和一个或多个实施例的组合。因此，可以将本发明的特定方面的所有实施例与本发明的所述方面的一个或多个其它实施例组合以形成其它实施例，而这些其它实施例不偏离本发明的教导。实验方法1.共熔溶剂的制备称取共熔混合物的不同组分(甘油、乳酸、柠檬酸和甜菜碱)，不按特定次序置于锥形瓶中。然后在保持物理化学和微生物完整性的浓度(按重量计)下添加自来水，但优选去矿物质水或蒸馏水，所述浓度在1与50％之间，优选在15与35％之间，且理想的是，占混合物的25重量％。本文中所选的共熔混合物是甜菜碱:柠檬酸(2:3mol)、甜菜碱:甘油(2:3mol)和甜菜碱:乳酸(2:3mol)，其各自含有25重量％的水，但是应了解可以使用甜菜碱和所定义的氢键供体的其它组合。将混合物加热到50℃ /-2℃且在磁力搅拌下均质化。一旦介质完全溶解且熔融，则将其放在环境温度下，然后储存于容器中直到使用。2.通过在50℃浸软而进行的固体/液体萃取除迷迭香之外，研磨各种预干燥的植物(例如蔬菜)基质(ika人工研磨机)，然后浸没于传统溶剂(水、水/甘油、水/乳酸、水/柠檬酸)或共熔溶剂中(参见实例)。所有萃取均应用植物(例如蔬菜)基质(20m)的5％比率。混合物在100ml玻璃烧杯中、在磁力搅拌下、在50℃下加热2小时。执行一遍，之后，介质通过25μm袋式过滤器或板式过滤器进行热过滤，然后再通过5-7μm板式过滤器过滤。3.通过亚临界水来加强萃取研磨预干燥的植物(例如蔬菜)基质(ika人工研磨机)，然后在150ml玻璃反应容器中浸没于水中。萃取应用植物(例如蔬菜)基质(20m)的5％比率。为了使温度均一化，反应器用蒸馏水(700ml)包围且放入微波腔室中。借助于高性能微波反应器(1.2kw，ultraclave，意大利麦尔斯通(milestone,italy))执行萃取。开始萃取之前，通过将容器放在真空下来去除氧气，然后使反应器空间和萃取介质在氮气中、在30巴的初始压力下饱和。分别借助于氮气流动和微波加热来达到设定点压力和温度。萃取温度设定在125℃且初始压力设定在30巴。这两种参数通过外部传感器来控制。当温度达到125℃设定点值时(根据我们的经验，在15分钟内)，萃取单程执行30分钟。一旦萃取完成，则使介质通过25μm袋式过滤器或板式过滤器进行热过滤，然后再通过5-7μm板式过滤器过滤。4.通过高效液相色谱(hplc)来量化所关注的化合物由此获得的液体萃取物不经初步浓缩或干燥即直接通过hplc分析。4.1.迷迭香液体萃取物中的迷迭香酸的比例使用分析标准(extrasynthèse参考物：4957s)和通过绘制校准曲线来执行迷迭香酸的量化和鉴别。agilent1100hplc装置装备有uv-可见光dad检测器或等效物。通过hplc级乙腈和hplc级水的混合物，通过添加99％三氟乙酸(tfa)，使用洗脱梯度。使用以下色谱条件：-zorbaxeclipsexdbc18柱，1.8μm，4.6mmx50mm或等效物。-移动相：时间(分钟)％乙腈0.1％tfa％水0.1％tfa01585215852.518822.710003.51000-流量：2ml/分钟-检测：328nm-温度：60℃-注射体积：2μl-压力：210巴±5巴观测以下滞留时间：化合物滞留时间(分钟)迷迭香酸2.0毛地黄黄酮3-葡萄糖苷酸2.34.2.橄榄叶液体萃取物中的橄榄苦苷的比例：使用分析标准(extrasynthèse参考物：0204)和通过绘制校准曲线来执行橄榄苦苷的量化和鉴别。agilent1100hplc装置装备有uv-可见光dad检测器或等效物。通过hplc级乙腈和hplc级水的混合物，通过添加99％三氟乙酸(tfa)，使用洗脱梯度。使用以下色谱条件：-zorbaxeclipsexdbc18柱，1.8μm，4.6mmx50mm或等效物。-移动相：时间(分钟)％乙腈 0.1％tfa％水 0.1％tfa020802.620802.710003.51000-流量：1.5ml/分钟-检测：230nm-温度：40℃-注射体积：2μl-压力：210巴±5巴观测以下滞留时间：化合物滞留时间(分钟)橄榄苦苷2.65.通过高效液相色谱对液体萃取物进行化学表征为了鉴别和量化所产生的各种萃取物中所存在的化合物，应用下文中的色谱条件。·分析柱：atlantist3150x4.6mmc18-5μm或等效物·温度：30℃·流量：0.6ml/min·压力：60-100巴·检测：根据待量化的化合物-350或280nm。·注射体积：7μl·移动相：a：乙腈:h2o(450/50v:v) 0.1％乙酸b：h2o 0.1％乙酸时间(分钟)溶剂a(％)溶剂b(％)5595155952070303080206.稳定性测试获得共熔混合物之后，监测其在三种不同温度(4℃、环境温度、50℃)下随时间变化的行为，以便评估其对配制品(例如化妆品使用)的影响。具体地说，在行业背景下，萃取物在工业制程期间和在消费者使用期间必须能够保持其颜色完整性。7.测试作为抗氧化剂的物理化学功效使用ou等人在aoac官方杂志中出版的如下参考文献方法测定萃取物截获过氧自由基的能力：使用荧光素作为荧光探针，根据氧自由基吸收能力(orac)测定总抗氧化能力：首次操作2012.23，《aoac国际杂志(journalofaoacinternational)》，2013，96，1372-1376)。为了供参考，aoac是美国农业部(usda)官方农业化学家协会。临时制备含有所期望浓度的抗氧化剂(0到40μm)的所有磷酸盐缓冲溶液(ph7.2)。用多通道移液管将五十毫升各种溶液转移到fluotrac96孔微量盘(greiner)中。然后将100μl含有0.126μm荧光素二钠盐的磷酸盐缓冲溶液(ph7.2)加到每个孔顶部。为了改进可重复性，微量盘在温度可控的恒温振荡器(phmt系列，英国希普莱的格兰特仪器有限公司(grantinstrumentsltd,shepreth,england))中，在1200rpm的回旋式搅拌下，在37℃下预加热20分钟。然后使用多通道移液管添加50μl含有aaph溶液的新鲜制备磷酸盐缓冲溶液。最后，每个孔含有200μl最终混合物，所述最终混合物由含有0.063m荧光素二钠盐、12.7mmaaph和浓度递增的抗氧化剂(0到10μm)的磷酸盐缓冲溶液组成。立即记录荧光降低到515nm(λex：490nm)。在37？0.1℃下每分钟测量一次，历时2小时，其中在使用微量盘读取器进行每次测量之前搅拌5秒。然后根据ou等人的如下文献对结果进行计算(每克液体萃取物trolox当量μmol(orac值))：使用荧光素作为荧光探针对改进的氧自由基吸收能力进行开发和验证(developmentandvalidationofanimprovedoxygenradicalabsorbancecapacityusingfluoresceinasthefluorescentprobe)，《农业与食品化学杂志(j.agric.foodchem.)》2001，49，4619-4626)。8.生物学功效测试根据使用的每种细胞类型，针对非细胞毒性浓度执行所有功效测试。8.1.消炎活性(抑制tnfα)消炎活性的试管内测试是基于角化细胞在暴露于阳光之后能够诱发的强炎性反应。使用hacat细胞(人类永生化角化细胞，生命技术公司(life-technology)，n°p612451，批号09543)，其继代次数低于50。在以下细胞培养基中培养细胞：含有l-谷酰胺酸的dmεm(达尔伯克氏最低必需培养基(dulbecco′sminimumessentialmedium)，泛生物技术公司(panbiotech)，批号97487)，其补充有青霉素(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml；泛生物技术公司，批号20145241)，和10％失活的胎牛血清(泛生物技术公司，批号p440011)，pη7.2。配置使用生理盐水溶液(hbss，sigma)的阴性对照组和使用10μm地塞米松(dexamethasone)的阳性对照组。将1.105个细胞/毫升(500微升/孔)放入48孔培养盘中培养且在37℃(5％cο2)下培育24小时。此培育期结束时，将细胞放入含有待测试的萃取物的无血清培养基中培养1小时，随后进行uv刺激。使用装备有氙气灯(1100w)的suntestcps 模拟器(法国穆斯勒的阿特拉斯材料测试技术公司(atlasmaterialtestingtechnologybv,moussyleneuf,france)执行照射。辐照度设定在750w/m2，组合的光剂量为约15mj/cm2，历时1分钟。然后再培养细胞24小时。这个培养期结束时，从培养物中回收上清液以便测量细胞释放的tnf-α。为了这个目的，使用elisarab068人类tnf-α试剂盒(西格玛-奥德里奇公司)。然后使用infinitem200pro微量盘读取器(tecan)测量每个孔在450nm下的光学密度(od)。然后将所得结果与未处理的孔进行比较，以便表达相对于阳性对照组的防护增量(％)：8.2.黑色素生成抑制活性(减少色素沉着的作用)针对这个测试所配置的生物学模型是nhem-lp细胞类型(对于人类黑色素细胞来说，稍微有色素沉着)。将这些细胞在37℃和5％co2下放入m254培养基中培养，所述培养基补充有hmgs-2(无pma)、胰岛素(5μg/ml)、青霉素(50μg/ml)、链霉素(50μg/ml)和健大霉素(gentamycin)(25μg/ml)。在第一种情形中，评估受测试的共熔萃取物的非细胞毒性浓度。出于此目的，测试不同培育时间。这些后续刺激完成时，将nhem-lp细胞与mtt(四唑鎓盐)一起培育，其通过线粒体酶琥珀酸脱氢酶浓缩为蓝色甲臜晶体。使用微量盘读取器(versamax，分子仪器公司(moleculardevices)测量用dmso溶解甲臜晶体之后的光密度。将黑色素细胞放入24孔盘中培养24小时。24小时之后更换培养基且用已经(或尚未)预刺激的培养基置换。阳性对照组由以下组成：在l-酪氨酸(1mm)存在下，用类脂酸(5μg/ml)刺激细胞。培养盘上还存在对照(非刺激孔)。然后培育细胞10天，其中在培育3天和7天之后进行两次新鲜处理。培育结束时，回收上清液且对细胞层上的黑色素合成进行量化。出于此目的，使用0.5nnaoh溶液，通过细胞溶解来萃取黑色素。然后测量405nm光学密度。使用根据标准(标准曲线为0.39到100μg/ml)预验证的校准曲线进行量化。根据下式计算抑制百分比：8.3.光防护作用使用可评估光防护作用的试管内测试来鉴别出在细胞暴露于细胞毒性剂量的太阳辐射的细胞存活率方面具有光防护特性的化合物或萃取物。使用两种方案：-暴露于太阳辐射之前，用受测试的萃取物对细胞进行预处理，-暴露于太阳辐射之后，用萃取物对细胞进行后处理。暴露之后的第24小时，使用作为弱阳离子染料的中性红测量细胞毒性，所述染料渗透细胞膜且在细胞内溶酶体中积聚。对hacat角化细胞的细胞系(人类永生化角化细胞，生命技术公司，n？p6110401，批号09i006)进行这种试管内测试，所述细胞的继代次数低于50。在以下培养基中培养细胞：含有l-谷酰胺酸的dmεm(达尔伯克氏最低必需培养基(dulbecco′sminimumessentialmedium)，泛生物技术公司(panbiotech)，批号5530513)，其补充有青霉素(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml；泛生物技术公司，批号9230112)，和10％失活的胎牛血清(泛生物技术公司，批号p290907)，pη7.2。配置使用生理盐水溶液(hbss,sigma)的阴性对照和使用trolox(sigma)的阳性对照，其浓度为10、20和50μg/ml。将1.105个细胞/毫升(500微升/孔)放入48孔培养盘中培养且在37℃(5％cο2)下培育24小时。在预处理方案中，用100μl含有不同浓度的萃取物的生理盐水溶液置换培养基，在37℃(5％co2)下与细胞接触1小时。此培育期结束时，抽出刺激物用100μlhbss置换。然后使用装备有氙气灯(1100w)的suntestcps 模拟器(法国穆斯勒的阿特拉斯材料测试技术公司(atlasmaterialtestingtechnologybv,moussyleneuf,france)执行照射。辐照度设定在750w/m2，组合的光剂量为约20mj/cm2，历时4分钟。细胞然后用惯用培养基置换培养18-22小时。在后处理方案中，用100μlhbss生理盐水溶液置换培养基。然后使用装备有氙气灯(1100w)的suntestcps 模拟器(法国穆斯勒的阿特拉斯材料测试技术公司执行照射。辐照度设定在750w/m2，组合的光剂量为约20mj/cm2，历时4分钟。然后使用具有不同非细胞毒性浓度的萃取物刺激细胞且用惯用培养基置换培养18-22小时。在两种方案中，培育18到22小时之后，然后洗涤细胞，放入含有50μg/ml中性红的培养基中且在37℃和5％co2下培育3小时。然后移出培养基来洗涤细胞且排除过量的中性红。向细胞中添加脱色溶液(50％乙醇、1％乙酸、49％蒸馏水；每孔50μl)。48孔盘然后在环境温度下避光搅拌15-20分钟。使用infinitem200pro微量盘读取器(tecan)在540nm下测量细胞膜损伤程度(中性红的释放增加)。然后测量每个孔的光学密度(od)。然后将所得结果与未处理孔(hbss，100％细胞存活率)进行比较，以便表达相对于阳性对照的防护增量(％)：防护增量(％)＝测试孔细胞存活率％-照射孔细胞存活率％8.4.抑制1型基质金属蛋白酶的释放(针对光致衰老的防护作用)1型基质金属蛋白酶是涉及组织重塑的各种生理学机制的间质性胶原蛋白酶。其尤其在光致衰老中负责皮肤组织的架构和组织响应于uv的分解。抗mmp-1试管内测试是基于角化细胞在uv刺激之后释放mmp-1的能力。hacat细胞(人类永生化角化细胞，生命技术公司，n？p6110401，批号091006)用于以下细胞培养基中，所述细胞的继代次数低于50：含有l-谷酰胺酸的dmεm(达尔伯克氏最低必需培养基(dulbecco′sminimumessentialmedium)，泛生物技术公司(panbiotech)，批号97487)，其补充有青霉素(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml；泛生物技术公司，批号20145241)，和10％失活的胎牛血清(泛生物技术公司，批号p440011)，pη7.2。配置使用生理盐水溶液(hbss，sigma)的阴性对照组和使用抗坏血酸(25μm)的阳性对照组。将1.105个细胞/毫升(500微升/孔)放入48孔培养盘中培养且在37℃(5％cο2)下培育24小时。此培育期结束时，将细胞放入含有受测试的萃取物的无血清培养基中培养1小时，随后进行uv刺激。使用装备有氙气灯(1100w)的suntestcps 模拟器(法国穆斯勒的阿特拉斯材料测试技术公司(atlasmaterialtestingtechnologybv,moussyleneuf,france)执行照射。辐照度设定在750w/m2，组合的光剂量为约15mj/cm2，历时1分钟。然后再培养细胞24小时。这个培养期结束时，从培养物中回收上清液以便测量细胞释放的mmp-1。为了这个目的，使用elisaraybio人类mmp-1试剂盒(西格玛-奥德里奇公司)。然后使用infinitem200pro读盘器(tecan)测量每个孔在450nm下的光学密度(od)。然后将所得结果与未处理的孔进行比较，以便表达相对于阳性对照组的防护增量(％)：8.5.胶原蛋白合成的激活胶原蛋白是细胞外基质中的主要结构蛋白，其起着维持皮肤完整性的作用，具体地说，赋予皮肤耐久性和密度且赋予其健康和年轻外观。胶原蛋白测量测试提供了一种量化细胞外基质中的可溶性胶原蛋白的方式，所述胶原蛋白是在经待评估的萃取物处理的皮肤细胞内合成。通过sircol测试(biocolor，uk)、从而利用天狼星红(siriusred)对羟基脯氨酸残基的染色和键结能力来检测胶原蛋白。将继代次数低于5的原代人类纤维母细胞(biopredic)放入以下培养基中培养：含有l-谷酰胺酸的dmεm(达尔伯克氏最低必需培养基(dulbecco′sminimumessentialmedium)，泛生物技术公司(panbiotech)，批号5842156)，其补充有青霉素(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml；泛生物技术公司，批号9870214)，和10％失活的胎牛血清(泛生物技术公司，批号p342518)，pη7.2。配置使用生理盐水溶液(hbss，sigma)的阴性对照组和使用抗坏血酸(50μg/ml)的阳性对照组。将5.105个细胞/毫升(1000微升/孔)放入24孔培养盘中培养且在37℃(5％cο2)下培育24直到达成汇合。此培育期结束时，将细胞放入含有不同浓度的受测试萃取物的无血清培养基中培养72小时。然后应用使用sircol方法的检测方案。更确切地说，收集培养基，与100μl含有聚乙二醇的tris-hcl缓冲液(ph7.6)离心，然后在0与4℃之间培育整夜。然后以12000rpm将样品离心10分钟，以便回收上清液，添加1mlsircol染料试剂。在环境温度下搅拌30分钟之后，试管以12000rpm再离心10分钟。移出上清液之后，添加750μl含有乙酸/氯化钠/清洁剂的混合物的试剂。再离心之后，移出上清液，添加250μl碱性试剂(0.5m氢氧化钠)。搅拌之后，从每个孔中转移200μl到96孔微量盘中，以便使用infinitem200pro微量盘读取器(tecan)测量555nm吸光度。然后将所得结果与未处理的孔进行比较，以便表达相对于阳性对照组的防护增量(％)：附图说明图1描绘了获自如下文所述的实例1的结果，其为甜菜碱单水合物与乳酸(氢键供体)之间的二元相图。甜菜碱单水合物和乳酸的比例以摩尔％给定。图2描绘了获自如下文所述的实例2的结果，其为甜菜碱单水合物与甘油(氢键供体)之间的二元相图。甜菜碱单水合物和甘油的比例以摩尔％给定。图3描绘了获自如下文所述的实例3的结果，其为甜菜碱单水合物与柠檬酸(氢键供体)之间的二元相图。甜菜碱单水合物和柠檬酸的比例以摩尔％给定。图4描绘了获自如下文所述的实例5的结果，其表明了迷迭香酸的回收产量取决于由水和/或甜菜碱和/或乳酸组成的萃取流体。图5描绘了获自如下文所述的实例6的结果，其表明了迷迭香酸的回收产量取决于由水和/或甜菜碱和/或甘油组成的萃取流体。图6描绘了获自如下文所述的实例7中所得的迷迭香液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，230nm)，其中1是未鉴别的化合物，2是迷迭香酸，3是毛地黄黄酮-3-o-葡萄糖苷酸，4是毛地黄黄酮-3′-(4"-乙酰基葡萄糖苷酸)异构体，5是迷迭香酚，6是鼠尾草酚且7是鼠尾酸甲酯。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图7描绘了如下文所述的实例7中所得的迷迭香液体萃取物的抗氧化能力，其以氧自由基吸收能力orac值(μmoltroloxeq/g样品)表示。图8描绘了如下文实例8中所述从橄榄叶获得橄榄苦苷的回收产量，所述回收产量取决于由水和/或甜菜碱和/或甘油组成的萃取流体。图9描绘了如实例10中所述使用亚临界水从橄榄叶获得的橄榄苦苷的回收产量。图10描绘了实例11中使用甜菜碱:甘油:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的橄榄叶液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，280nm)。1是羟基酪醇，2是毛地黄黄酮-7-o-葡糖苷，3未鉴别，4是毛地黄黄酮葡糖苷，5是橄榄苦苷且6是橄榄苦苷异构体。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图11a和11b描绘了细胞与实例11中使用不同萃取溶剂所得的橄榄叶液体萃取物一起培育之后，细胞所达成的胶原蛋白增量(a)和防护增量(b)。*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，t检验。图12描绘了实例12中使用甜菜碱:甘油:水、甜菜碱:乳酸:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的樱花液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，350nm)。1是咖啡酰葡糖苷，2是绿原酸，3是香豆酰葡糖苷，4是芸香苷，5是堪非黄酮醇芸香糖苷，6是二咖啡酰奎尼酸，7未鉴别，8是异鼠李素，9是类黄酮c17h14o7且10是类黄酮c18h16o8。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图13描绘了细胞暴露于樱花液体萃取物(基于实例12中所得的樱花液体萃取物)之后的uv照射后光防护(a)、抑制1型基质金属蛋白酶(mmp-1)的释放(b)、消炎活性相对于tnfα(c)、胶原蛋白合成(d)。*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，t检验。图14描绘了人类皮肤外植体暴露于樱花液体萃取物(基于实例12中所得的樱花液体萃取物)之后的uv照射后光防护(通过紧密连接蛋白zo-1合成)(a)、兜甲蛋白合成(b)，以及先是发生抗氧化活性，随后发生dj-1/nrf2路径的细胞募集(c和d)。*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，t检验。图15描绘了实例13中使用甜菜碱:乳酸:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的木贼草液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，280nm)。1是未鉴别的酚类，2是未鉴别的生物碱，3是堪非黄酮醇二己糖苷鼠李糖苷，4是咖啡酰酒石酸，5是咖啡酰酒石酸异构体，6是菜豆酸，7是棉黄甘，8是原芫花素-4′-o-葡糖苷，9是香豆酸，10是阿魏酸(ferulicacid)衍生物，11未鉴别，12未鉴别且12是堪非黄酮醇三己糖苷鼠李糖苷。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图16描绘了实例13中使用不同萃取溶剂获得的木贼草萃取物的消炎活性，其表明了角化细胞hacat暴露于uv之后，tnf-α的释放受到抑制。图17描绘了实例13中使用不同萃取溶剂获得的木贼草液体萃取物的抗氧化能力，所述抗氧化能力以氧自由基吸收能力orac值(μmoltroloxeq/g样品)表示。图18描绘了实例14中使用甜菜碱:甘油:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的海茴香(海莲子)液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，280nm)。1是3-咖啡酰奎宁酸，2是5-咖啡酰奎宁酸，3是4-咖啡酰奎宁酸，4是1-咖啡酰奎宁酸，5是5-对香豆酰奎宁酸，6是5-阿魏酰奎宁酸，7是芸香苷，8是槲皮素-3-o-葡糖苷，9是二咖啡酰奎宁酸异构体和10是未鉴别的黄酮。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图19描绘了轻度色素沉着人体皮肤(在1mml-酪氨酸存在下刺激)的黑色素细胞在暴露于实例14中使用不同萃取溶剂所得的海茴香液体萃取物之后出现的黑色素合成抑制。***p<0.0001，t检验。图20描绘了实例15中使用甜菜碱:甘油:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的车前草液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，350nm)。1是肉苁蓉苷f，2是羟基毛蕊花苷，3是二羟基毛蕊花苷，4是羟基毛蕊花苷异构体，5是苯乙醇苷糖苷，6是毛蕊花苷，7是异毛蕊花苷，8是毛地黄黄酮二葡萄糖苷酸，9是毛地黄黄酮葡萄糖苷酸且10是野黄芩黄素。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图21描绘了实例16中使用甜菜碱:乳酸:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的番红花液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，350nm)。1是堪非黄酮醇-3-o-槐糖苷-7-o-葡糖苷，2是堪非黄酮醇-3-o-槐糖苷，3是堪非黄酮醇-3-o-乳酰槐糖苷，4是堪非黄酮醇-3-o-乳酰槐糖苷异构体且5是堪非黄酮醇糖基甘油基鼠李糖基。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图22描绘了实例16中使用不同萃取溶剂所得的番红花液体萃取物对黑色素合成(a)和1型基质金属蛋白酶(mmp-1)释放(b)(细胞暴露于uv之后)的抑制作用。***p<0.001，t检验。图23描绘了实例17中使用甜菜碱:甘油:水、甜菜碱:乳酸:水或氢化甘油作为萃取溶剂所得的含生草液体萃取物的色谱分布图(lc/uv，280nm)。1未鉴别，2是原儿茶酸，3是云杉素，4未鉴别，5是黄杉素，6是黄杉素甲基醚，7是水飞蓟素且8是异水飞蓟素。黑色迹线是当使用共熔溶剂萃取时获得的结果且灰色迹线是当使用水:甘油萃取时获得的结果。图24描绘了轻度色素沉着人体皮肤(在1mml-酪氨酸存在下刺激)的黑色素细胞在暴露于实例17中使用不同萃取溶剂所得的含生素液体萃取物之后出现的黑色素合成抑制。***p<0.001，t检验。具体实施方式实例以下实例仅仅是本文所述的本发明方法的说明性实例。所用的所有设备、试剂和溶剂都是标准实验室设备，例如玻璃器皿、加热装置和hplc装置。必须谨记，这些实例表明了甜菜碱:氢键供体比率为2:3时存在萃取协同性。然而，当所得值取整为整数时，比率2:3变成1:2。实例1.甜菜碱:乳酸二元混合物的摩尔比临界条件表1.甜菜碱:乳酸二元混合物的目测外观取决于摩尔比甜菜碱(％)乳酸(％)清晰度7030立即形成沉淀物6040立即形成沉淀物5050一周之后形成晶体4060液体且透明3070液体且透明2080一天之后形成晶体当改变甜菜碱和乳酸的摩尔比例时，观察到组成在40:60与30:70％之间的窄范围内时，混合物是透明的。低于和高于此阈值，混合物均会展现不稳定介质的特征，其中在混合(甜菜碱:乳酸摩尔比为70:30、60:40和50:50)后立即形成晶体，或在环境温度下储存一周(比率20:80)后形成晶体。令人关注的是注意到，此组成范围正好对应于混合物相图上出现的熔点最大降幅(图1)。此最大降幅(或共熔点)归因于复杂的共熔生成现象，其针对甜菜碱和氢键供体的混合物的作用机制据我们所知尚无法阐明。尽管如此，我们仍然可以提出如下假设：通过甜菜碱与乳酸之间的氢键和/或离子键的建立所形成的超分子组合体有助于通过增加自由空间的体积来使分子网络重排。图1清楚地描绘了甜菜碱:乳酸比率为约33:66时发生了共熔生成，这意味着一个甜菜碱分子与两个乳酸分子按非共价方式发生相互作用。因此应了解，比率偏离这一平衡会引起混合物失去稳定且使得熔点大幅度提高。为了萃取目的，因此需要使用甜菜碱和乳酸摩尔比精确地在50:50％与30:70％之间、优选40:60与30:70％之间的混合物。这些摩尔比具有环境温度与-40℃之间的熔点且优选在环境温度下和在50℃下呈液态透明的，这是使用其作为萃取流体的前提条件。实例2.甜菜碱:甘油二元混合物的摩尔比临界条件表2.甜菜碱:甘油二元混合物的目测外观取决于摩尔比甜菜碱(％)甘油(％)目测外观7030立即形成沉淀物，然后结晶6040立即形成沉淀物，然后结晶5050立即形成沉淀物，然后结晶4060液体且透明3070液体且透明2080液体且透明甜菜碱的宏观观察结果：具有不同摩尔比的甘油混合物表明，为了获得可以用于固体/液体萃取的透明混合物，需要最低60％甘油(表2)。70:30、60:40和50:50的甜菜碱:甘油摩尔比都引起了裸眼可见的固体颗粒的立即形成，其使介质失去稳定，然后快速结晶。这些结果也分别通过此混合物的相图来确认，所述相图指出了对应于40:60甜菜碱:甘油比率的共熔点(图2)。根据仅能够按所涉及分子种类之间的精确定量比率形成的共熔混合物的超分子组合体特征，共熔生成以形成透明混合物的临界条件不是偶然的和可能的结果，如在实例1中。在本文所给的实例中，一个甜菜碱单水合物分子与两个甘油分子发生相互作用，如图2所示。最后，添加60％甘油可以降低甜菜碱的熔点且获得熔点降至-40℃的液体共熔混合物。实例3.甜菜碱:柠檬酸二元混合物的摩尔比临界条件的不存在表3.甜菜碱:柠檬酸二元混合物的目测外观取决于摩尔比甜菜碱(％)柠檬酸(％)清晰度7030一周之后形成晶体6040一周之后形成晶体5050一周之后形成晶体4060一周之后形成晶体3070一周之后形成晶体2080立即形成晶体不同于实例1和2中所述的混合物，甜菜碱:柠檬酸二元混合物就摩尔比和宏观外观而言不呈现临界条件。如表3中可见，混合物的实际上所有组成范围都会在一周之后引起不稳定的介质结晶。其用于萃取目的的用途系统地引起单独的混合物或混合物与生物材料一起发生块体固化，或甚至在过滤后引起液体萃取物发生块体固化。尽管如此，图3仍表明与孤立采用的纯组分相比，在较宽的组成范围内实现了熔点的降低。凭借此事实，其满足共熔混合物的基本准则之一。这个实例不仅说明了从甜菜碱获得稳定共熔混合物的难度，而且还确定不是所有的共熔溶剂都适用于固体/液体萃取，这与文献中通常所提出的观点相反。实例4.获得若干种共熔混合物的测试和50℃下的稳定性研究稳定性测试，尤其在50℃下进行的稳定性测试，可以突显某些共熔混合物的不稳定性和劣化，例如包含至少一种选自葡萄糖、果糖、蔗糖以及其混合物的糖的共熔混合物。表4.包括至少一种糖的共熔混合物的稳定性监测 ：稳定、无色；-：不稳定、结晶；--：不稳定、黄色/橙色；---：不稳定、褐色实例5.共熔生成对三元混合物甜菜碱:乳酸:水从迷迭香中萃取迷迭香酸的能力的影响这个实例中所呈现的结果清楚地表明在共熔混合物形成之后获得了协同性(图4)。具体地说，对于三元共熔混合物甜菜碱:乳酸:水(2:3摩尔比；25重量％的水)而言，在50℃浸软2小时的条件下从迷迭香中单程萃取到的迷迭香酸的回收率最大。甜菜碱与乳酸之间的摩尔比在此对应于实例1中所形成的共熔物。将25％水添加到混合物中使得超分子络合物负责协同性的能力有可能得到维持，同时大大降低混合物的粘度有利于萃取方法。另外，使用水以及使用水:甜菜碱和水:乳酸二元混合物进行的对照萃取(在相同条件下使用相同重量浓度的甜菜碱或乳酸进行)表明，协同性仅当在共熔混合物存在下放置迷迭香时获得。后者使得迷迭香酸的萃取产量得到惊人的提高，分别为水和水:甜菜碱和水:乳酸混合物的约47、31和2.5倍。实例6.共熔生成对三元混合物甜菜碱:甘油:水从迷迭香中萃取迷迭香酸的能力的影响实例6表明了使用甜菜碱和甘油(2:3摩尔比)与25重量％水的三元共熔混合物获得了针对迷迭香酸产量的协同作用，所述迷迭香酸是迷迭香在50℃浸软2小时的条件下萃取所得(图5)。甜菜碱与甘油之间的摩尔比对应于实例2中所形成的共熔物。将25％水添加到混合物中使得超分子络合物负责协同性的能力有可能得到维持，同时大大降低混合物的粘度有利于萃取方法。另外，使用水以及使用水:甜菜碱和水:甘油二元混合物进行的对照萃取(在相同条件下使用相同重量浓度的甜菜碱或甘油进行)表明，协同性仅当在共熔混合物存在下放置迷迭香时获得。后者使得迷迭香酸的萃取产量得到惊人的提高，分别为水的约22倍以及水:甜菜碱和水:甘油混合物的15倍。实例7.使用甜菜碱:乳酸:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的迷迭香萃取物的化学分布图和抗氧化活性的比较。如图6所示，用共熔混合物甜菜碱:乳酸:水所得的迷迭香萃取物的分布就二萜烯(141相对于8μg/ml)、酚类化合物(850相对于232μg/m)和迷迭香酸(340相对于3μg/ml)而言远比氢化甘油萃取物丰富。因此，富含所关注的化合物(具体地说，多酚内抗氧化剂)的共熔萃取物展现的抗氧化活性显著大于氢化甘油萃取物(图7)。使用测量抗氧化能力的参考测试(即，氧自由基吸收能力或orac方法)测定此活性。我们尤其注意到，相关的迷迭香的共熔萃取物(甜菜碱:乳酸:水)中存在高浓度的迷迭香酸。这种分子呈现出特定的结构特征，其具有两个儿茶酚核心(邻二苯酚)，就抗氧化活性而言，这是最佳的分子结构，原因在于其促进了酚羟基之间建立分子内氢键。我们在表5中还已经表明，对获得共熔萃取物的这种方法进行工业规模的开发是可能的，且另外产生了类似于使用实验室规模方法所观察到的结果，就本发明所要求的方法的再现性而言，这是一项重要准则。表5另外，各种结果表明了迷迭香共熔萃取物作为抗氧化剂用于化妆品、食品(人类和动物)、医药或营养药物应用的潜力。实例8.共熔生成对三元混合物甜菜碱:甘油:水从橄榄叶中萃取橄榄苦苷的能力的影响。这个实例中所呈现的结果表明，甜菜碱和甘油(2:3的摩尔比)与25重量％水之间形成共熔混合物之后获得了协同性(图8)。甜菜碱:甘油摩尔比对应于实例2中形成的共熔物。将25％水添加到混合物中使得超分子络合物负责协同性的能力有可能得到维持，同时大大降低混合物的粘度有利于萃取方法。另外，使用水:甜菜碱(65:35，按重量计)和水:甘油(60:40，按重量计)二元混合物进行的对照萃取(虽然在相同条件下且在相同的重量浓度下进行)表明，协同性仅当在共熔混合物存在下放置橄榄叶时获得。后者使得橄榄苦苷回收率分别相对于水:甜菜碱和水:甘油混合物以及水而言出现惊人的提高(2.8倍与9倍之间)。实例9.共熔生成对三元混合物甜菜碱:二醇:水提高萃取效率的能力的影响。使用各种二醇进行以下萃取实验。这个实例中的术语《二醇》涉及戊二醇、丙烷二醇和丙二醇的使用。以下萃取使用若干植物物种，包括迷迭香叶、橄榄叶、垫状卷柏地上部分和松萝凤梨地上部分。表6：橄榄叶表7：迷迭香叶表8：垫状卷柏地上部分表9：松萝凤梨地上部分实例10.用于从橄榄叶中萃取橄榄苦苷的亚临界水和共熔混合物的比较对共熔生成萃取方法与目前最先进的萃取技术(如亚临界水)进行比较，所述亚临界水由过热到125℃且通过施加30到45巴压力保持液态的水相组成。图9表明与亚临界水相比，由甜菜碱和乳酸或甘油(2:3，摩尔比)与25重量％水组成的三元共熔混合物从植物(例如蔬菜)基质(如橄榄叶)产生的橄榄苦苷更多。此结果令人关注的原因在于橄榄苦苷像大部分酚类化合物一样对热敏感且因此发生热氧化。另外，从生态萃取和绿色化学的角度看，考虑到节能和实施环保工艺，工艺的温度和压力均降低是有利的。实例11.使用甜菜碱:甘油:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的橄榄叶萃取物的化学分布图和生物活性的比较。图10中所示的色谱分布图表明共熔萃取物(甜菜碱:甘油:水)的植物(例如蔬菜)活性物质浓度高于氢化甘油萃取物。对于橄榄苦苷来说，此结果是特别惊人的。在实验室规模上，根据实例2中所示的共熔生成现象，将甜菜碱添加到水:甘油混合物中使得橄榄苦苷浓度达成三倍(或四倍)。当将共熔生成萃取方法转变成工业规模时(如表10所示)，此增幅甚至达到5.4倍。类似地，在实验室规模和工业规模上获得的橄榄叶共熔萃取物中的酚类化合物的总含量分别是使用水:甘油混合物(50:50；w:w)的传统液体萃取物的2.6倍和3.4倍。表10这些结果可以解释为，在0.01到0.1％范围内的浓度的橄榄叶共熔萃取物培育之后，人类皮肤纤维母细胞上的胶原蛋白合成出现惊人的增加(图11a)和对hacat细胞的光防护(图11b)。举例来说，0.1％共熔萃取物的水性配制物在胶原蛋白合成方面的活性是使用氢化甘油萃取物的相同调配物的18倍。这种改进的功效因此有可能降低共熔萃取物的所需浓度，从而呈现出某些优势。具体地说，当使用浓度低十倍的共熔萃取物调配物(0.01％)时，就细胞外基质中的胶原蛋白增量而言的其生物学功效相当于且通常甚至大于具有十倍多浓度的氢化甘油萃取物。另外，如图11b中所示，在uva照射之前，就用萃取物对细胞进行预防性光防护处理而言，我们发现生物活性增强4.7倍，这是非常大的。这些数据说明共熔萃取物用作光防护剂、uv滤光剂、抗衰老剂和保湿剂的潜力(胶原蛋白具有持水特性并且还发挥着皮肤屏障功能)。另外，考虑到橄榄苦苷的已知抗氧化活性(laguerre等人，通过esi-ms表征橄榄叶酚类且通过cat分析来评估其抗氧化能力(characterizationofoliveleafphenolicsbyesi-msandevaluationoftheirantioxidantcapacitiesbycatassay)，《美国油脂化学家学会杂志(j.am.oilchem.soc.)》2009，86，1215-1225)，图10中所呈现的色谱分布图指出了在各种配制物中使用这些改进的萃取物作为抗氧化剂的可能性。实例12.使用甜菜碱:甘油:水和甜菜碱:乳酸:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的樱花萃取物的化学分布图和生物活性的比较。这个实例中所呈现的结果充分地说明如下事实：使用本发明中所要求的共熔溶剂萃取植物(例如蔬菜)物质使得通过水:甘油类型的传统溶剂而“无法获得”的萃取物有可能获得。在用共熔混合物萃取与用氢化甘油混合物萃取之间，这尤其适用于图12中所示的色谱分布图和表11中所示的数据。所述萃取物完全不同。共熔生成法萃取在这种情况下有可能生成新颖的樱花萃取物，包括许多新化合物(与传统萃取物相比)，如根据质谱鉴别出的绿原酸，或香豆酸葡糖苷、芸香苷、二咖啡酰奎宁酸或异鼠李素。在数量上，与氢化甘油萃取物相比，针对共熔溶剂甜菜碱:甘油:水和甜菜碱:乳酸:水记录到多酚含量显著增加(浓度分别为4.3倍和13.7倍)。表11就生物活性而言，共熔萃取物在光防护、1型基质金属蛋白酶(mmp-1)抑制、消炎活性和胶原蛋白合成方面再次展现惊人的优越性。虽然记录到甜菜碱:乳酸:水混合物存在类似的数据，但是在此仅呈现获自甜菜碱:甘油:水混合物的萃取物的结果。如图13的(a)中所示，共熔萃取物作为光防护剂的活性远大于氢化甘油萃取物；甚至可以说后一萃取物缺乏所有功效。类似的结论也可以基于所得如下结果：涉及光致衰老的1型细胞外基质金属蛋白酶(mmp-1)的抑制(图13的(b))、作为重要发炎路径标记的tnfα的抑制(图13的(c))，以及可溶于细胞外基质中的胶原蛋白的合成(图13的(d))。此外，基于uv诱导人体皮肤外植体模型，樱花共熔萃取物不仅能够使涉及皮肤屏障功能的紧密连接蛋白zo-1(闭锁小带(zonaocculdens))和兜甲蛋白合成、引起皮肤水合作用的细胞粘附和粘聚增加(图14的(a)和(b))，而且因为皮肤细胞不需要招募dj-1/nrf2路径对抗uv损伤而具有抗氧化活性(图14的(c)和(d))。使用本发明中所要求的溶剂和萃取方法使得这些活性中的每一种都得到了非常显著量的增加。这些结果为这些萃取物开启了新颖应用之路，如用作消炎、舒缓、抗衰老、光防护和抗氧化剂、uv滤光剂、保湿剂或抗光致衰老剂。实例13.使用甜菜碱:乳酸:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的木贼草萃取物的化学分布图和生物学和物理化学活性的比较类似于樱花，木贼草实例说明了通过共熔生成法萃取提供获得新颖萃取物的方式的事实。图15对两条色谱迹线进行了比较，至少可以说其彼此间不叠置。在其它差异中，我们可以提及堪非黄酮醇二己糖苷鼠李糖苷、棉黄苷、原芫花素-4′-o-葡糖苷和菜豆酸存在于共熔萃取物(甜菜碱:乳酸:水)中的浓度高于氢化甘油萃取物。表12还展现了所得萃取物中的酚类含量的差异。表12分批总酚类(μg/ml)水:甘油(50:50；w:w)395.1甜菜碱:乳酸(40:60；mol:mol) 水(25％w)387.4然而，仅基于与这些萃取物有差异的分布图，难以得到关于这类萃取物和这一种萃取物的优越性的结论。因此，对从木贼草中所萃取的自然物质针对引起tnfα产生的促炎性级联的抑制作用进行生物活性测试(图16)。在相等的重量浓度(0.01％)下，显而易见的是，木贼草的共熔萃取物的活性大于由简单的水:甘油混合物所得的萃取物。还发现了剂量反应，这有利于根据所寻求的生物学功效程度来调整配方。总体上，当浓度增加10倍时，活性增强5倍。还对萃取物之间的抗氧化活性进行了比较性分析。图17表明了木贼草共熔萃取物在减少衍生自偶氮引发剂的过氧自由基方面的功效是氢化甘油萃取物的1.6倍。木贼草共熔萃取物因此有望作为消炎剂和抗氧化剂应用于许多领域(主要是医药、营养药物和化妆品)。就化妆品领域而言，这些萃取物可以用作舒缓剂(通过其抗tnfα特性)和用作抗氧化剂和抗衰老剂(通过其自由基减少特性)。实例14.使用甜菜碱:甘油:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的海茴香(海莲子)萃取物的化学分布图和生物活性的比较首先参见本文所呈现的所有色谱分布图，在根据共熔生成与使用传统溶剂(如水和甘油(50:50；w:w))的萃取方法之间，海茴香的分布图差异最小。就酚类化合物而言，两种萃取物总体相当，其中所述酚类化合物在氢化甘油萃取物和共熔萃取物中的浓度分别是195和181μg/ml(图18)。表13还展现了所得总酚类化合物的差异。表13与水和甘油萃取物相比，共熔萃取物所含的1-咖啡酰奎宁酸和5-香豆酰奎宁酸更少，但所含的二咖啡酰奎宁酸和5-阿魏酰奎宁酸更多。然而，对于其它化合物，如5-咖啡酰奎宁酸，两种萃取物呈现了基本上类似的浓度。由于这些不同分子具有个数(每个分子一个或两个环)和结构(阿魏酸相对于香豆酸相对于咖啡酸)不同的酚类核心，因此分布图的差异，甚至明显适当性质的差异也会造成生物学和/或物理化学活性出现非常显著的差异。这可以见于图19中，其中0.1％海茴香共熔萃取物的水性配制物对33％的人体表皮黑色素细胞(轻度色素沉着)上的黑色素合成展现了抑制作用，而氢化甘油萃取物则缺乏所有活性。这是一个重要结果，因为作为化妆品中使用最广泛的减少色素沉着的自然药剂的熊果苷释放出毒性化合物(氢醌)(参考)。这为开发自然且不含熊果苷的新颖漂白剂提供了有利背景。在这个意义上，这个实例中所呈现的结果完全证明了本发明所要求的海茴香共熔萃取物应用于皮肤漂白的潜力。另外，后者凭借存在于共熔萃取物中的羟基琥珀酰胺酸(咖啡酸、阿魏酸、香豆酸等)的奎尼酸酯的儿茶酚核心的确定反应性，皆指定作为抗氧化剂应用于化妆品、营养药物、医药或食品工业中。实例15.使用甜菜碱:甘油:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的车前草萃取物的化学分布图的比较实例15证明了如下事实：使用甜菜碱:甘油:水共熔混合物的萃取所产生的色谱分布图就总毛蕊花苷而言在总体上比氢化甘油萃取物更丰富(图20)。通过向水-甘油混合物中添加甜菜碱(如表14所示)，总毛蕊花苷浓度从197增加到397μg/ml(双倍)。在这种情形下，化合物6(毛蕊花苷)是一种非常强的抗氧化剂(laguerre等人，2009)，其含有两个儿茶酚核心，如同实例6和7中所呈现的迷迭香酸。表14更确切地说其是咖啡酸和羟基酪醇的异糖苷酯，其涉及多种生物学和/或物理化学活性。另外，以惊人的方式，使萃取方法适应工业规模使得总毛蕊花苷含量有可能增加超过三倍且使酚类化合物增加近双倍。另外，以实验室规模获得的车前草共熔萃取物与氢化甘油萃取物之间的总酚类化合物对比表明了有利于共熔萃取物的2.3倍差异。实例16.使用甜菜碱:乳酸:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的番红花萃取物的化学分布图的比较图21中所示的色谱分布图主要在堪非黄酮醇糖基-甘油基鼠李糖苷的存在以及堪非黄酮醇-3-o-乳酰基槐糖苷的两种异构体的存在方面有差异(如表15所示)。表15番红花中的这些活性组分能够通过液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(lc-esi/ms)鉴别出来。这些活性组分在获自氢化甘油萃取物的分布图中几乎不存在，这可以解释图22中所得到的结果，表明共熔萃取物抑制黑色素合成以及抑制细胞外基质释放金属蛋白酶的功效增强，但是在后一种情况下，抑制的方式更适度。如果假定类黄酮部分是涉及这两种活性的生物化学决定性的唯一一种，那么可以表明，堪非黄酮醇糖基-甘油基鼠李糖苷和堪非黄酮醇-3-o-乳酰基槐糖苷的异构体形式的存在对于获得生物活性相对于氢化甘油型传统萃取物增强的萃取物来说是至关重要的。这些结果还证明了番红花共熔萃取物用作减少色素沉着剂、光防护剂和抗衰老剂的潜力。另外，考虑到组成其的分子(类黄酮)的化学性质，这些共熔萃取物的自由基稳定化活性远高于传统萃取物，且因此其适用作抗氧化剂。实例17.使用甜菜碱:甘油:水和甜菜碱:乳酸:水三元混合物或氢化甘油混合物作为萃取溶剂所得的含生草萃取物的化学分布图的比较通过共熔生成法萃取获得的萃取物(不论其是甜菜碱:甘油:水或甜菜碱:乳酸:水)所呈现的分布图完全不同于通过色谱所观察到的获自水和甘油萃取的萃取物(图23)。这些数据证明通过使用如本发明中所要求的深度共熔溶剂所诱导的特征有别于更传统的方法。在这种情形下，图23中所示的共熔萃取物含有多得多的黄杉素(和其甲基醚)、原儿茶酸和黄酮木脂素，如水飞蓟素和异水飞蓟素(如表16所示)。令人关注的是注意到，就酚类化合物的总浓度而言，使用甜菜碱:乳酸:水和甜菜碱:甘油:水混合物所得的萃取物分别是使用水:甘油混合物的2倍和3倍。表16就生物活性而言，图23中所示的色谱分布图的共熔萃取物(甜菜碱:甘油:水)将黑色素合成抑制近36％，而氢化甘油萃取物完全缺乏活性(图24)。这是通过分布图所得到的逻辑结果，已知可抑制细胞黑色素生成的黄杉素(an等人，类黄酮、黄杉素和毛地黄黄酮尽管增加酪氨酸蛋白含量但减少细胞黑色素生成(flavonoids,taxifolinandluteolinattenuatecellularmelanogenesisdespiteincreasingtyrosineproteinlevels)，《植物疗法研究(phytother.res.)》2008，22，1200-1207)实际上与化妆品中作为减少色素沉着剂广泛使用的熊果苷同样有效。就这一点而言，应该指出熊果苷因其释放氢醌而并非具有令人满意的活性，熊果苷的存在已受禁(特别是在化妆品中不得超过1ppm)。在熊果苷不存在的情况下，这类活性由此证明含生草共熔萃取物用于化妆品领域的巨大潜力，其不仅在减少色素沉着剂的范围内，而且鉴于原儿茶酸和黄杉素是有效的自由基清除剂(各自具有儿茶酚核心，儿茶酚核心控制氧化应激的作用机制已经在上文中解释)而用作抗氧化剂和抗衰老剂。最后，实例17证明共熔溶剂完全适合于从复苏植物中萃取生物学或化学活性化合物的事实。当前第1页1 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技术特征：1.一种通过萃取方法所获得的包含植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的自然生物学液体萃取物，其中所述方法包括以下步骤：
a.在搅拌的同时，将经研磨或未研磨的生物材料浸没于共熔萃取溶剂中，其中所述共熔萃取溶剂是透明稳定的流体混合物，其包含：
(i)甜菜碱(三甲基甘氨酸)或甜菜碱的水合形式；
(ii)至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体化合物；和
(iii)水；
其中甜菜碱或甜菜碱水合形式与所述至少一种氢键供体的比率是1:1.5到1:3且添加到所述混合物中的水的比例是15到30重量％；
条件是所述共熔萃取溶剂不含任何外源糖和/或胺盐和/或阴离子；
b.使步骤a.中所得的混合物在20℃与60℃之间的温度下浸软或浸透或浸渍；然后
c.过滤b.所得的萃取产物，借此获得来源于所述植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的自然生物学液体萃取物。
2.根据权利要求1所述的液体萃取物，其还包含如所述步骤a.中所限定的共熔溶剂。
3.根据权利要求2所述的液体萃取物，其中所述共熔溶剂的存在量是约0.01重量％到约50重量％或约0.1重量％到约25重量％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体萃取物，其中所述植物生物材料选自由以下组成的群组：樱花、木贼草、车前草、番红花、海茴香、含生草、迷迭香、橄榄叶、垫状卷柏和松萝凤梨。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的萃取物用于制备营养药物组合物、人类或动物用膳食或食物产品、营养补充物、香料或调味料、医药、酒类或化妆用配制品的用途，这些物旨在经口或肠胃外给药或局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼施用。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的液体萃取物用于营养药物组合物、人类或动物用膳食或食物产品、营养补充物、香料或调味料、酒类或化妆用配制品中的用途。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的液体萃取物，其用于医药组合物中。
8.一种医药组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的液体萃取物。
9.根据权利要求1-4或7中任一项所述的液体萃取物或根据权利要求8所述的医药组合物用于光防护、抗光致衰老、减少色素沉着、漂白、抗衰老、抗氧化剂和抗自由基剂、活性氧种类清除剂、晚期糖基化终产物清除剂、金属蛋白酶抑制剂、消炎剂、皮肤舒缓剂、胶原蛋白合成激活剂、保湿剂、皮肤屏障功能修复剂或细胞粘附和粘聚改善剂的用途。
10.根据权利要求5或6所述的用途，或根据权利要求7所述的液体萃取物或根据权利要求8所述的医药组合物，其经口或肠胃外给药，或局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼施用。
11.根据权利要求4所述的来源于樱花的自然生物学液体萃取物，其用作光防护剂、屏障功能保护剂、抗氧化剂和抗光致衰老剂。
技术总结本发明涉及一种用于萃取植物(例如蔬菜)和/或动物和/或原核生物材料的共熔溶剂，使用所述溶剂萃取自然生物学液体提取物的方法；通过实施所述萃取方法而产生的自然生物学液体萃取物；和所述自然生物学液体萃取物的用途，其中所述共熔溶剂为甜菜碱(三甲基甘氨酸)或甜菜碱水合形式、至少一种选自由多元醇和有机酸组成的群组的氢键供体和水的比例混合物。
技术研发人员：亚历克西斯·拉沃德;迈克尔·拉盖尔;西蒙娜·比尔蒂克;安妮·西尔维·法比亚诺·蒂克西埃;马克·罗莱;法丽达·奇麦德;安东尼·查尔斯·比利
受保护的技术使用者：纳图瑞克斯有限公司;阿维尼翁沃克吕斯国立大学
技术研发日：2016.04.11
技术公布日：2021.08.03
