本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种基于pcr和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法。
背景技术：
脑膜炎是严重威胁生命的脑膜和蛛网膜下腔炎症，由于它们在解剖学上的接近，炎症也可能累及大脑皮质和脊髓，需要立即就医和处理。脑膜炎症会引起血管痉挛，并可能导致脑小动脉和动脉的血栓形成以及可能的脑静脉阻塞。细菌和嗜中性粒细胞的多种炎性产物可穿过血脑屏障，引起神经元坏死或压迫颅神经。脑膜炎在世界范围内发生，并在各个年龄段的个体中发展，并导致高的发病率和死亡率。
脑膜炎病原体包括细菌、真菌、病毒等，传统培养的方法周期长、灵敏度低，并且常规临床微生物实验室不能培养病毒，不能完全满足临床的需求。准确而迅速的检测中枢神经系统感染哪些病原体，对于临床工作具有体重要的应用价值。
nanopore测序为单分子实时测序技术，具有低成本、高通量、非标记和测序长度长、快速等优势。
技术实现要素：
本发明的目的是检测中枢神经系统是否感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和/或herpessimplexvirus2。
本发明首先保护一种高通量检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体的方法，包括如下步骤：
(1)获得10种病原体的marker基因；
10种病原体分别为enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2；
(2)完成步骤(1)后，分别合成用于扩增10种病原体marker基因的特异引物对且各个特异引物对的靶序列长度为400-600bp；每个特异引物对由上游引物和下游引物组成；
(3)完成步骤(2)后，分别以来源于中枢神经系统的待测组织的cdna为模板，采用步骤(2)合成的10个特异引物对进行多重pcr扩增，得到pcr扩增产物；
(4)完成步骤(3)后，将所有pcr扩增产物混合，进行nanopore扩增子测序，得到测序数据；
(5)完成步骤(4)后，将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
所述步骤(1)中，获得10种病原体的marker基因的步骤依次可如下：
(1-1)从数据库下载所述10种病原体的cds序列；
(1-2)将所有cds序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因；
(1-3)去除600bp以下的cds序列；
(1-4)使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的cds序列；
(1-5)根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因；筛选原则为：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与nt数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。
所述步骤(1-1)中，数据库可为ncbi数据库。
上述方法中，enterovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。neisseriameningitidis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:4所示。mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。nocardiafarcinica的marker基因的核苷酸序列如seqidno:6所示。herpessimplexvirus1的marker基因的核苷酸序列如seqidno:7所示。humanherpesvirus6的marker基因的核苷酸序列如seqidno:8所示。listeriamonocytogenes的marker基因的核苷酸序列如seqidno:9所示。herpessimplexvirus2的marker基因的核苷酸序列如seqidno:10所示。
所述步骤(2)中，用于扩增enterovirus的marker基因的特异引物对由seqidno:11所示的单链dna分子和seqidno:12所示的单链dna分子组成。用于扩增lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的特异引物对由seqidno:13所示的单链dna分子和seqidno:14所示的单链dna分子组成。用于扩增neisseriameningitides的marker基因的特异引物对由seqidno:15所示的单链dna分子和seqidno:16所示的单链dna分子组成。用于扩增cytomegalovirus的marker基因的特异引物对由seqidno:17所示的单链dna分子和seqidno:18所示的单链dna分子组成。用于扩增mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的特异引物对由seqidno:19所示的单链dna分子和seqidno:20所示的单链dna分子组成。用于扩增nocardiafarcinica的marker基因的特异引物对由seqidno:21所示的单链dna分子和seqidno:22所示的单链dna分子组成。用于扩增herpessimplexvirus1的marker基因的特异引物对由seqidno:23所示的单链dna分子和seqidno:24所示的单链dna分子组成。用于扩增humanherpesvirus6的marker基因的特异引物对由seqidno:25所示的单链dna分子和seqidno:26所示的单链dna分子组成。用于扩增listeriamonocytogenes的marker基因的特异引物对由seqidno:27所示的单链dna分子和seqidno:28所示的单链dna分子组成。用于扩增herpessimplexvirus2的marker基因的特异引物对由seqidno:29所示的单链dna分子和seqidno:30所示的单链dna分子组成。
所述步骤(3)中，所述待测组织可为脑脊液。
所述步骤(4)中，测序数据可为将nanopore扩增子测序获得的原始数据进行过滤获得的。所述过滤可为去掉长度小于300bp的read。
本发明还保护上述任一所述方法在检测中枢神经系统感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2中的至少一种的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护一种用于检测中枢神经系统感染何种病原体的试剂盒，由特异引物对1—特异引物对10组成；特异引物对1由seqidno:11所示的单链dna分子和seqidno:12所示的单链dna分子组成；特异引物对2由seqidno:13所示的单链dna分子和seqidno:14所示的单链dna分子组成；特异引物对3由seqidno:15所示的单链dna分子和seqidno:16所示的单链dna分子组成；特异引物对4由seqidno:17所示的单链dna分子和seqidno:18所示的单链dna分子组成；特异引物对5由seqidno:19所示的单链dna分子和seqidno:20所示的单链dna分子组成；特异引物对6由seqidno:21所示的单链dna分子和seqidno:22所示的单链dna分子组成；特异引物对7由seqidno:23所示的单链dna分子和seqidno:24所示的单链dna分子组成；特异引物对8由seqidno:25所示的单链dna分子和seqidno:26所示的单链dna分子组成；特异引物对9由seqidno:27所示的单链dna分子和seqidno:28所示的单链dna分子组成；特异引物对10由seqidno:29所示的单链dna分子和seqidno:30所示的单链dna分子组成。
上述试剂盒中，所述病原体可为enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2中的至少一种。
应用所述试剂盒检测中枢神经系统感染何种病原体的使用方法为：(1)以来源于中枢神经系统的待测组织的cdna为模板，采用试剂盒中的10个特异引物对进行多重pcr扩增，得到pcr扩增产物；(2)将pcr扩增产物nanopore扩增子测序，得到测序数据；(3)将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体。enterovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。neisseriameningitidis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:4所示。mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。nocardiafarcinica的marker基因的核苷酸序列如seqidno:6所示。herpessimplexvirus1的marker基因的核苷酸序列如seqidno:7所示。humanherpesvirus6的marker基因的核苷酸序列如seqidno:8所示。listeriamonocytogenes的marker基因的核苷酸序列如seqidno:9所示。herpessimplexvirus2的marker基因的核苷酸序列如seqidno:10所示。所述来源于中枢神经系统的待测组织可为脑脊液。
所述试剂盒可以同时检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体，其使用方法与上述检测单个中枢神经系统的区别仅在于nanopore扩增子测序。检测若干中枢神经系统的nanopore扩增子测序方法为：将多重pcr扩增扩增得到的各个pcr扩增产物混合，之后nanopore扩增子测序。
本发明还保护上述任一所述试剂盒在检测中枢神经系统感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2中的至少一种的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
实验证明，采用本发明提供的方法检测脑脊液，可以准确判断中枢神经系统感染的病原体类型。本发明为中枢神经系统感染提供准确而迅速的病原学诊断，具有很高的临床应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，脑脊液的提供者对实验均知情同意。
实施例1、高通量同时检测多个脑脊液样本感染哪些病原体的方法的建立
一、脑脊液的rna的获得
1、采集脑脊液(采集过程中避免污染)，置于dna/rnashield(zymo，catalogcode为r1100-50)中保存。
2、完成步骤1后，将脑脊液剪成小块，得到目标样本。
3、取glasspowerbeadtube，加入200μl步骤2得到的目标样本和600μlpm1/β-me，置于qiagen匀浆器中最大转速震荡10min；之后室温、13000g离心1分钟，收集上清液。
4、取2ml收集管，加入步骤3收集的上清液和150μlirs液体涡旋混匀，4℃孵育5分钟；之后13000g离心1分钟，收集上清液(避免接触沉淀)。
5、取2ml收集管，加入步骤4收集的上清液、600μlpm3液体和600μlpm4液体，涡旋混匀，得到混合液体。
6、取mbspincolumn柱子，加入步骤5得到的混合液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后加入600μlpm5液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后加入600μlpm4液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后13000g离心2分钟。
7、完成步骤6后，将所述mbspincolumn柱子放到一新的2ml收集管中，加入50μlrnase-free水，孵育3分钟；之后13000g离心1分钟，收集液体，即为脑脊液的rna。
脑脊液的rna置于-70℃保存。
二、脑脊液的cdna的获得
1、制备逆转录反应体系。
逆转录反应体系为10μl，由0.5μlprimescripttmrtase(浓度为200u/μl)、2μl5×primescripttmbuffer、0.5μlrandom6mers(浓度为100μm)、1μl脑脊液的rna(浓度为1μg/μl)和rnasefreeddh2o组成。
2、取所述逆转录反应体系，进行逆转录，得到脑脊液的cdna。
逆转录反应条件为：37℃1h。
三、用于扩增病原体marker基因的特异引物对的制备
1、从ncbi数据库下载引起中枢神经系统感染的10种病原体的cds序列。
10种病原体分别为enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2。
2、将步骤1下载的所有cds序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因。
3、完成步骤2后，去除600bp以下的cds序列。
4、完成步骤3后，使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的cds序列。
5、完成步骤4后，根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因。
筛选原则如下：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与nt数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。
10种病原体的marker基因如下：enterovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；neisseriameningitidis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:3所示；cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:4所示；mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:5所示；nocardiafarcinica的marker基因的核苷酸序列如seqidno:6所示；herpessimplexvirus1的marker基因的核苷酸序列如seqidno:7所示；humanherpesvirus6的marker基因的核苷酸序列如seqidno:8所示；listeriamonocytogenes的marker基因的核苷酸序列如seqidno:9所示；herpessimplexvirus2的marker基因的核苷酸序列如seqidno:10所示。
6、设计并人工合成用于扩增病原体marker基因的特异引物对(由上游引物和下游引物组成)，特异引物对的靶序列长度均为500bp左右。
扩增每个病原体marker基因的特异引物对的引物序列见表1。
表1
四、pcr扩增
1、制备反应体系。反应体系为50μl，由25μl2×superplexpremix(takara)、2.5μl上游引物混合液(由表1中10个病原体的上游引物混合而成)、2.5μl下游引物混合液(由表1中10个病原体的下游引物混合而成)、5μl脑脊液的cdna和pcr-gradewater组成。反应体系中，各个上游引物和各个下游引物的浓度均为4μm。
2、取反应体系，进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
反应程序为：95℃2min；95℃10sec，55℃10sec，35cycles；72℃15sec；4℃hold。
每个脑脊液样本进行上述步骤一至四，得到相应的pcr扩增产物。
五、nanopore扩增子测序
将步骤四得到的多个脑脊液样本的pcr扩增产物进行nanopore扩增子测序，得到原始数据。具体步骤如下：
1、pcr扩增产物定量并采用琼脂糖凝胶电泳测dna完整度。
结果表明，步骤四得到的pcr扩增产物均为20-30kb左右。
2、分别取步骤四得到的pcr扩增产物，用水稀释至1-3ng/μl，得到产物稀释液。
3、完成步骤2后，取产物稀释液，打断并加pcr接头，得到tagmenteddna。具体为：将3μl产物稀释液和1μlfrm(转座酶)轻弹混匀，瞬离；之后30℃1min(打断)，80℃1min(灭活)，4℃∞。
4、完成步骤3后，进行pcr扩增，得到pcr样品。
反应体系为50μl，由20μl去离子水、4μltagmenteddna、1μlrlb(barcode)和25μllongamptaq2×mastermix(neb)组成。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，65℃6min，30cycles；65℃6min，4℃∞。
5、磁珠纯化，获得建库纯化产物
(1)将30μlxp磁珠和50μlpcr样品混匀，静置10min(让dna挂到磁珠上，不要放在磁力架上)。
(2)瞬离后放到磁力架上，直至澄清。
(3)去除上清(留一点)(在磁力架上操作)。
(4)加入500μl75％(v/v)酒精水溶液洗涤，旋转ep管。
(5)去除上清，再用75％(v/v)酒精水溶液洗涤一次，去除上清，瞬离，再吸干净，开盖放置30s，晾干。
(6)用10mmtris-hclph8.0with50mmnacl洗脱dna。
洗脱液由980μlh2o、10μl5mmnacl和10μl1mtris-hcl组成。
从磁力架上取下ep管，加入13μl10mmtris-hclph8.0with50mmnacl洗脱dna，室温放置2min。
(7)将ep管重新放回磁力架上，液体澄清后，吸取10μl放入一个干净的ep管中(不要碰到磁珠)。
(8)qubit定量浓度。
6、混样测序
(1)将10μldna文库(总量50-100fmol)和1μlrap(马达蛋白接头)混合，室温放置5min。
dna文库为多个脑脊液样本的建库纯化产物等量混合而成。
(2)配制primingmix(测序mix)。将30μlflt直接加到1管fb中。
(3)将1000μl加样枪调到780μl，1μl慢慢的往上调排气泡，枪尖里有液体即可(大约调到800μl)。
(4)用1000μl的加样枪吸取800μl的primingmix，缓慢注入flowcell里，避免气泡，放置5min。
(5)配文库。由34μlsqb、25.5μllb、4.5μl水和11μldna文库(来自上个步骤)组成。
(6)轻轻的打开spotonsampleport的盖，用1000μl的加样枪吸取200μl的primingmix，从primingport缓慢注入flowcell里，避免气泡。
(7)用200μl的加样枪吸取75μl文库一滴一滴加入到spotonsampleport里。
(8)盖上盖上机(放10min左右loading后上机)。
7、minknow操作
(1)experiment：输入实验名。
(2)kit：选择对应的建库kit。
(3)basecalling：fastbasecalling(电脑性能不够好时用此模式)
basecallingandbarcoding处于“on”状态。
(4)runoptions：
time:72hbiasvoltage(mv):-180activechannelselection:“on”，1.5h扫描1次；
(5)startrun。
六、生物信息学分析
1、数据过滤
取步骤五得到的原始数据，去掉长度小于300bp的read。
2、比对
将步骤1获得的数据分别与10种病原体的marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则脑脊液感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则脑脊液未感染该病原体。
实施例2、检测实施例1建立的方法准确性
待测样本1为临床已确诊为感染neisseriameningitidis的患者1的脑脊液。
待测样本2为临床已确诊为感染cytomegalovirus的患者2的脑脊液。
待测样本3为临床已确诊为感染listeriamonocytogenes的患者3的脑脊液。
待测样本4为健康人1的脑脊液。
待测样本5为健康人2的脑脊液。
按照实施例1建立的方法检测待测样本1—待测样本5。结果表明，待测样本1感染neisseriameningitidis，待测样本2感染cytomegalovirus，待测样本3感染listeriamonocytogenes，待测样本4和待测样本5均未感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2。
检测结果与预期结果完全一致。
由此可见，实施例1建立的方法具有较高的准确性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110>北京大学人民医院
<120>一种基于pcr和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法
<160>30
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>6585
<212>dna
<213>enterovirus
<400>1
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1.一种高通量检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体的方法，包括如下步骤：
(1)获得10种病原体的marker基因；
10种病原体分别为enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2；
(2)完成步骤(1)后，分别合成用于扩增10种病原体marker基因的特异引物对且各个特异引物对的靶序列长度为400-600bp；每个特异引物对由上游引物和下游引物组成；
(3)完成步骤(2)后，分别以来源于中枢神经系统的待测组织的cdna为模板，采用步骤(2)合成的10个特异引物对进行多重pcr扩增，得到pcr扩增产物；
(4)完成步骤(3)后，将所有pcr扩增产物混合，进行nanopore扩增子测序，得到测序数据；
(5)完成步骤(4)后，将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，获得10种病原体的marker基因的步骤依次如下：
(1-1)从数据库下载所述10种病原体的cds序列；
(1-2)将所有cds序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因；
(1-3)去除600bp以下的cds序列；
(1-4)使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的cds序列；
(1-5)根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因；筛选原则为：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与nt数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：enterovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；neisseriameningitidis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:3所示；cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如seqidno:4所示；mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如seqidno:5所示；nocardiafarcinica的marker基因的核苷酸序列如seqidno:6所示；herpessimplexvirus1的marker基因的核苷酸序列如seqidno:7所示；humanherpesvirus6的marker基因的核苷酸序列如seqidno:8所示；listeriamonocytogenes的marker基因的核苷酸序列如seqidno:9所示；herpessimplexvirus2的marker基因的核苷酸序列如seqidno:10所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，
用于扩增enterovirus的marker基因的特异引物对由seqidno:11所示的单链dna分子和seqidno:12所示的单链dna分子组成；
用于扩增lymphocyticchoriomeningitisvirus的marker基因的特异引物对由seqidno:13所示的单链dna分子和seqidno:14所示的单链dna分子组成；
用于扩增neisseriameningitides的marker基因的特异引物对由seqidno:15所示的单链dna分子和seqidno:16所示的单链dna分子组成；
用于扩增cytomegalovirus的marker基因的特异引物对由seqidno:17所示的单链dna分子和seqidno:18所示的单链dna分子组成；
用于扩增mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的特异引物对由seqidno:19所示的单链dna分子和seqidno:20所示的单链dna分子组成；
用于扩增nocardiafarcinica的marker基因的特异引物对由seqidno:21所示的单链dna分子和seqidno:22所示的单链dna分子组成；
用于扩增herpessimplexvirus1的marker基因的特异引物对由seqidno:23所示的单链dna分子和seqidno:24所示的单链dna分子组成；
用于扩增humanherpesvirus6的marker基因的特异引物对由seqidno:25所示的单链dna分子和seqidno:26所示的单链dna分子组成；
用于扩增listeriamonocytogenes的marker基因的特异引物对由seqidno:27所示的单链dna分子和seqidno:28所示的单链dna分子组成；
用于扩增herpessimplexvirus2的marker基因的特异引物对由seqidno:29所示的单链dna分子和seqidno:30所示的单链dna分子组成。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述待测组织为脑脊液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，测序数据为将nanopore扩增子测序获得的原始数据进行过滤获得的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述过滤为去掉长度小于300bp的read。
8.权利要求1至7任一所述的方法在检测中枢神经系统感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2中的至少一种的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
9.一种用于检测中枢神经系统感染何种病原体的试剂盒，由特异引物对1—特异引物对10组成；特异引物对1由seqidno:11所示的单链dna分子和seqidno:12所示的单链dna分子组成；特异引物对2由seqidno:13所示的单链dna分子和seqidno:14所示的单链dna分子组成；特异引物对3由seqidno:15所示的单链dna分子和seqidno:16所示的单链dna分子组成；特异引物对4由seqidno:17所示的单链dna分子和seqidno:18所示的单链dna分子组成；特异引物对5由seqidno:19所示的单链dna分子和seqidno:20所示的单链dna分子组成；特异引物对6由seqidno:21所示的单链dna分子和seqidno:22所示的单链dna分子组成；特异引物对7由seqidno:23所示的单链dna分子和seqidno:24所示的单链dna分子组成；特异引物对8由seqidno:25所示的单链dna分子和seqidno:26所示的单链dna分子组成；特异引物对9由seqidno:27所示的单链dna分子和seqidno:28所示的单链dna分子组成；特异引物对10由seqidno:29所示的单链dna分子和seqidno:30所示的单链dna分子组成。
10.权利要求9所述试剂盒在检测中枢神经系统感染enterovirus、lymphocyticchoriomeningitisvirus、neisseriameningitidis、cytomegalovirus、mycobacrteriumtuberculosis、nocardiafarcinica、herpessimplexvirus1、humanherpesvirus6、listeriamonocytogenes和herpessimplexvirus2中的至少一种的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
技术总结