本发明涉及细胞工程和基因工程技术领域，更具体地说，它涉及asxl2在高原低氧下调控精子形成基因表达中的应用。
背景技术：
我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原，高原地区常住人口6000～8000万，是我国社会经济发展的重要地区和戍守边疆的前沿阵地。高原低氧(低张性缺氧)环境对男性生殖功能有显著负面影响，大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(elongatingspermatid/spermatozoa，也称为长形精子)尾部畸形现象已有报道。
高原低氧可引起精子尾部畸形(abnormalityofthespermatozoatail，ast)，造成精子前向运动能力降低，损害高原男性生殖健康，严重者可导致男性不育。ast是弱畸形精子症的一个亚型，也称为鞭毛多形态异常，表现为无鞭毛、短鞭毛、卷曲鞭毛、弯曲鞭毛和/或不规则鞭毛口径的异常鞭毛表型，是导致精子活动能力严重受损的重要原因。已有研究表明，低氧男性移居者和模型动物出现ast，导致精子活力下降，精子穿透卵母细胞率降低。此前的研究发现，小鼠在模拟海拔5800米(约10％氧含量)低氧环境暴露10周后，成熟精子的鞭毛容易发生口径不规则等类似于ast表型，进一步检测发现精子前向运动活力与精子穿透卵母细胞率降低。
由此可知，高原低氧环境容易引发小鼠引发小鼠ast表型，但目前尚无低氧对精子形成过程影响的系统性分子机制研究，也未有关于有效防治高原低氧环境引起的精子尾部畸形的有效措施，因此深入研究高原低氧ast的表观遗传机制，探索有效控制ast发生的策略，对于设计高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义，对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供asxl2在高原低氧下调控精子形成基因表达中的应用，为高原低氧环境引起的精子尾部畸形的治疗提供了新的思路。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：asxl2基因调控精子形成基因表达在制备防治精子尾部畸形药物中的应用。
所述asxl2基因招募prc2复合物后与prc2复合物中的催化亚基ezh2结合形成asxl2-ezh2复合体，asxl2-ezh2复合体抑制过渡区组装分子的表达以减少精子尾部畸形的发生。
所述过渡区组装分子包括cep162基因和arhgef18蛋白。
所述asxl2-ezh2复合体通过对靶基因cep162相关组蛋白进行h3k27me3修饰直接参与过渡区组装分子的表达调控。
所述asxl2基因结合到cep162基因启动子上游-200bp至1bp的点位上。
所述精子为人类、羊驼、大鼠与小鼠精子中的任意一种。
所述精子为精原干细胞、精母细胞、圆形精细胞、成熟精子中的任意组合。
本发明通过对单细胞测序结果的进一步的分析发现，在精子差异表达基因中，cep162(qn1/kiaa1009，162kda中心粒蛋白)、arhgef18(sa-rhogef/rho-鸟嘌呤核苷酸交换因子)高度富集，且低氧上调精子cep162基因与arhgef18的mrna水平。
本发明在常氧与低氧组小鼠精子中进行asxl2的chip-qpcr检测。实验结果显示，常氧下asxl2在cep162启动子上显著富集，富集片段位于cep162的启动子上游-200～ 1(pcr引物位于-200- 1)。
本发明结合生物信息学分析，研究发现cep162启动子区存在asxl2结合位点，而低氧处理下asxl2在cep162启动子上结合明显减少。
本发明通过chip-qpcr方法检测了prc2复合物催化亚基ezh2在cep162基因启动子区的定位，结果发现ezh2可结合到cep162启动子区。研究结果显示，asxl2和ezh2均参与调控tz组装分子表达。
本发明通过co-ip实验，实验结果显示常氧与低氧下asxl2与prc2中的催化亚基ezh2结合形成复合体，通过对靶基因cep162相关组蛋白进行h3k27me3修饰，直接参与tz组装分子的表达调控，从而调控精子尾部畸形的发生。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明预测了asxl2基因差异表达同时存在于圆形精细胞与精子，低氧抑制精子asxl2基因转录；低氧下asxl2与cep162启动子结合减少；此外，常氧与低氧下asxl2与ezh2均相互结合。
本发明还预测了常氧下asxl2通过招募ezh2至核小体，继而催化cep162和arhgef18等过渡区组装分子的基因相关的核小体组蛋白h3发生h3k27me3修饰，进一步抑制cep162与arhgef18基因转录与鞭毛末段过渡区组装和低氧ast；但是低氧抑制asxl2基因表达，其作用机制与常氧相反，最终导致低氧ast。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例中低氧诱发精子鞭毛畸形与活力减少的实验结果图；
图2为本发明实施例中低氧下大鼠睾丸圆形精细胞与附睾尾精子中差异富集基因表达结果图；
图3为本发明实施例中低氧诱发精子鞭毛末段过渡区组装的实验结果图；
图4为本发明实施例中低氧下精子中asxl2、ezh2分别与cep162启动子结合的实验结果图；
图5为本发明实施例中常氧与低氧下精子中asxl2与ezh2互相结合的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例1-6和附图1-5，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：实验准备与实验设计
1.低氧ast模型复制、鉴定及样本采集
①模型复制：将实验小鼠随机分为常氧对照组和模拟高原低压低氧模型组。模型组小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力：约360mmhg)，连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧ast模型。
②低氧ast模型鉴定：液化并收集附睾尾中精子，采用精子分析系统评估精子活力、精子形态学指标；衣红与巴氏染色及透射电镜分别观察精子畸形与鞭毛超微结构，判断低氧ast模型是否复制成功。
③精子样本采集：打开腹腔，小心取出附睾组织，摘取双侧附睾尾进行液化与裂红后得到精子，取一部分精子进行固定用于if和ihc等病理学检测；取一部分精子提取总蛋白，用于co-ip分别检测逆向转运分子关联与过渡区组装分子关联及变化；剩余精子于液氮中保存，用于后续rt-qpcr和wb等检测。
2.小鼠精子成熟培养及低氧处理
分别将小鼠圆形精细胞系(63423，atcc，manassas,virginia，usa)与小鼠睾丸支持细胞系(crl-1715，atcc)共培养于改良dmem培养基(补加1μm睾酮、500miu/ml重组fsh、5μg/ml肾上腺素、10％胎牛血清)中，在32℃、5％co2培养箱中6h得到成熟精子，低氧处理后采用fcm(流式细胞术，hochest33342与dye780双染)分选精子并用于后续体外实验。细胞采用低氧工作站进行低氧处理，设定为1％o2，5％co2，94％n2。
3.细胞样品if染色
将细胞接种于激光共聚焦皿中，处理结束后进行固定，染色，激光共聚焦观察。
4.co-ip检测蛋白关联
将细胞裂解并收集蛋白，同时，分别进行磁珠洗涤、磁珠结合抗体，然后将结合了抗体的磁珠与蛋白结合，最后洗涤磁珠并进行wb检测。
5.mrna检测
采用rt-qpcr方法，参照rna提取、逆转录及tbgreenmastermix(takara)试剂盒进行实时定量pcr检测。
6.wb蛋白表达检测
wb检测细胞内蛋白表达。
7.pcrarray
购买qiagen公司的pcrarray检测板，可批量检测多种基因的表达变化。
8.asxl2ec-/-和ezh2ec-/-小鼠繁殖
将asxl2f/f或ezh2f/f小鼠与精子tie-cre小鼠进行杂交，鉴定获得cre阳性的asxl2f/-或ezh2f/-杂合子小鼠，进一步杂交即可获得纯合的asxl2ec-/-和ezh2ec-/-小鼠，依此继续繁殖，直到获得足够用于实验研究的小鼠。
9.chip-qpcr
chip-qpcr：①甲醛交联处理：pbs漂洗细胞，加入甲醛(终浓度1％)交联细胞，室温下孵育10分钟；加入甘氨酸(终浓度0.125m)终止交联反应；离心细胞(2000rpm,5min)收集细胞，用冰pbs漂洗1次；②提取核蛋白和dna混合物：用胞浆裂解液重悬细胞，2000rpm离心5min收集核提取物；核裂解液重悬提取物；③超声波打断染色质：优化超声条件后将染色体打断(200-1000bp为佳)，4℃，10000rpm离心10min收集上清，检测上清液蛋白浓度；④通过磁珠-抗体沉淀蛋白质-dna交联复合体：以同型igg抗体为对照；⑤解除交联，纯化dna：在65℃水浴解除交联过夜；磁珠法收集、纯化、浓缩dna；⑥根据靶基因设计引物，rt-qpcr扩增。
10.测序(chip-seq和rna-seq)
收集样品后交由公司进行检测。
11.细胞转染质粒
转染采用lipofectaminetm3000转染试剂进行转染；sirna转染采用lipofectaminernaimax进行转染。
12.微管pull-down
购买的taxol用brb80缓冲液(80mmnaoh/ph6.8，2mmmgso4，1mmgtp，1mmegta)稀释至2mg/ml，将大肠杆菌中纯化并稀释的cep162(0.5mm)与含有taxol的brb80液混合，室温孵育30min，20000g离心10min，wb分别检测上层细胞与下层颗粒中cep162表达。
13.rho-gtp结合分析
使用表达prk5-flag-rho、myc-sa-rhogef的质粒按0.5mg在精子中共转染，48h后，将精子与结合gst-rbd(activerho-bindingdomainofrhotekin，与rho-gtp特异结合的诱饵)的磁珠孵育，wb法检测sa-rhogef、septin2表达。
14.gdp/gtp交换活率
在加入重组gst-sa-arhgef-dh/ph(20pmol)的条件下，测量重组arhgef18(10pmol)的体外gdp/gtp交换活性。
15.atpase活性分析
使用纯化的重组蛋白测定cep162蛋白的atp水解活性，在缓冲液c(20mmhepes/ph7.2，25mmkci，2mmmgac，10mm(nh4)2so4，0.1mmedta)中进行32mg/ml纯化蛋白和20mmatp的时间过程分析。所有反应混合物在30℃下孵育10分钟，用磷酸哌啶探针标记无机磷酸盐(pi)，通过荧光共振法检测溶液中的游离磷酸盐。在30℃不同浓度的atp孵育1min后，对atp水解进行了评估。
16.启动子活性检测
将启动子质粒、过表达质粒和内参质粒一起转染细胞，进行相应处理后裂解、收集细胞，参照promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明说检测启动子的荧光值，与内参质粒荧光值作为参照，计算相对荧光素酶单位(normalizedrelativeluciferaseunits，nrlu)作为判断指标。
17.dcas9-原位捕获-蛋白质组学和rna/dna-seq检测
①筛选阳性细胞：将pef1a-fb-dcas9和pef1a-bira-v5质粒(市售)转染精子，用嘌呤霉素和g418进行筛选，应用wb检测挑选fb-dcas9和bira阳性表达细胞；②病毒包装：设计合成靶向cep162、arhgef18的单链rna(singleguidernas,sgrna)，并将其克隆构建在慢病毒u6表达载体上，测序验证后提取质粒，与病毒包装质粒pd8.9和vsv-g一起转染hek293t细胞进行病毒包装；③病毒感染：收集慢病毒液并感染fb-dcas9和bira阳性表达细胞；④交联-纯化获得混合物：参照chip方法进行交联、裂解、超声获得提取染色质混合物，加入dynabeads孵育后纯化。提取获得dna、rna和蛋白质；⑤进行dna/rna测序，以及itraq，分析鉴定获得转录调控复合物组分。
实施例2：低氧引发精子尾部畸形、活力减少与穿透卵母细胞率下降研究
小鼠在海拔5800米(氧浓度约10％)低氧下暴露10周，液化附睾尾并收集精子；将精子转移到装有bww培养液的离心管中，于co2培养箱孵育1h，然后将超排的小鼠卵母细胞与精子按3.5×106/卵母细胞共培养。图1中：a.精子分析系统(classspermanalyzer/csa,microptics.l.,barcelona,spain)分析精子活力变化，红色箭头表示直线前向(a级)运动精子，蓝色箭头表示螺旋前向(b级)运动精子，绿色箭头表示原地运动(c级)精子，黄色表示不运动(d级)精子，以上数据是三个实验的平均值±标准差，*p<0.05vs21％o2浓度对照组，柱状图表示精子头部与尾部畸形率(％)，以上数据是三个实验的平均值±标准差，*p<0.05表明组间比较有显著差异；b.醋酸洋红染色观察进入卵母细胞的精原核，计算精子穿透卵母细胞率(％)，以上数据是三个实验的平均值±标准差，*p<0.05vs21％o2浓度对照组；c.衣红染色观察精子头部和尾部畸形(×400)，以箭头分别表示正常精子、头部畸形精子和尾部畸形精子；d.巴氏染色观察精子鞭毛形态(×400)，图中展示常氧与低氧组各三个视野的精子鞭毛形态变化，以箭头表示尾部正常与尾部畸形的精子；e.透射电镜观察精子鞭毛及精子鞭毛中段、主段与末段(以箭头表示)；f.透射电镜观察精子中心体(以箭头表示)。
如图1a、1c与1d所示，与21％氧浓度暴露10周组小鼠附睾尾精子比较，海拔5800米(氧浓度约10％)低氧暴露10周组小鼠附睾尾精子总畸形率与尾部畸形率均显著增加(p<0.05)。精子活力与精子穿透卵母细胞率均显著下降(p<0.05)。鞭毛易发生管径不规则等类似于ast的表型，中心体结构异常，无9×2 2结构，如图1e与1f所示。
实施例3：低氧下大鼠睾丸圆形精细胞与附睾尾精子中差异富集基因表达(degs)研究
图2中：a、b、c分别为圆形精细胞、精子簇a和精子簇b的degs表达的箱型图，红色方框表示圆形精细胞与精子中asxl2基因表达，蓝色方框表示精子簇a中arhgef18与cep162基因表达以及精子簇b中cep162基因表达；d为差异表达基因的列表，cv代表变异系数，蓝色箭头表示常氧和低氧暴露下生精细胞百分率差异显著的阶段，*表示确定的deg阶段，注：红线上方为常氧组小鼠睾丸生精细胞中高表达degs，红线下方为低氧组小鼠睾丸生精细胞中高表达degs。e为wb法检测圆形精细胞中asxl2、ezh2和h3k27me3蛋白表达；f为wb法检测精子中asxl2、ezh2和h3k27me3的蛋白表达。
如图2a、2b所示，由于对小鼠基因组的注释不够全面，许多degs以loc前缀表示。在圆形精细胞与精子成熟的分化时段，有几个基因是同时富集的，例如asxl2和cep162，如图2a-2d，常氧下asxl2的基因表达在圆形精细胞阶段突然增加，然后在精子阶段逐渐降低，低氧下圆形精细胞中asxl2的表达逐渐降低，常氧和低氧组之间的asxl2mrna水平差异较大，尤其是在圆形精细胞与精子簇a，如图2d所示。与之相似的是，常氧下cep162基因表达在精子簇a中突然下降，然后在精子簇b中维持在低水平，低氧下精子簇a与簇b中cep162的表达均显著高于常氧组，如图2d所示。此外，低氧显著上调了精子簇a的arhgef18mrna水平，如图2b所示。另外，分别与21％氧浓度暴露10周组小鼠圆形精细胞与精子相比，10％氧浓度暴露10周组小鼠圆形精细胞与精子中asxl2、ezh2和h3k27me3表达减少，如图2e和2f所示。
实施例4：低氧诱发精子鞭毛末段过渡区组装的研究
10％氧浓度暴露小鼠10周，液化并收集附睾尾精子。图3中：a.if观察精子中cep162定位(488nm通道表示cep162染色)；b.if检测精子中cep290定位(555nm通道表示cep290染色)；c.if观察精子中arhgef18定位(488nm通道表示arhgef18染色)；d.if观察精子中septin2定位(555nm通道表示septin2染色)；e.wb法检测精子中cep162和arhgef18蛋白表达；f.co-ip检测精子中cep162与cep290关联；g.co-ip检测精子中septin2与arhgef18关联。
与21％氧浓度暴露10周组小鼠附睾尾精子相比，10％氧浓度暴露10周组小鼠附睾尾精子cep162、arhgef18、septin2与cep290分布从鞭毛中段与主段扩散至末段，如图3a-3d所示。与21％氧浓度暴露10周组小鼠精子相较，10％氧浓度暴露10周组大鼠精子cep162与arhgef18蛋白表达增加，如图3e所示。此外，低氧下精子中cep162与cep290相互关联，如图3f所示，arhgef18与septin2相互关联，如图3g所示。
实施例5：低氧下精子中asxl2与ezh2分别与cep162启动子结合研究
chip-qpcr分析asxl2与ezh2分别在cep162启动子富集。图4中：a.将asxl2与igg的chip数据进行归一化处理；b.将ezh2与igg的chip数据进行归一化处理，注：cep162启动子中的一个保守区域；c.区域为启动子上游-200～ 1，柱状表示三个独立样本的数据平均值±标准差，*p<0.05vs21％o2浓度对照组。
如图4所示，与21％氧浓度暴露10周组小鼠附睾尾精子相较，10％氧浓度暴露10周组小鼠附睾尾精子中asxl2与ezh2分别与cep162启动子的结合显著减少(p<0.05)。
实施例6：常氧与低氧下精子中asxl2与ezh2互相结合的研究
图5中：10％氧浓度暴露小鼠10周，液化并收集附睾尾精子。co-ip法检测精子中asxl2与ezh2相互结合情况。结果显示，无论常氧还是低氧暴露下，附睾尾精子中asxl2与ezh2均互相关联。
综上，本发明预测了asxl2基因差异表达同时存在于圆形精细胞与精子，低氧抑制精子asxl2基因转录；低氧下asxl2与cep162启动子结合减少；此外，常氧与低氧下asxl2与ezh2均相互结合。本发明还预测了常氧下asxl2通过招募ezh2至核小体，继而催化cep162和arhgef18等过渡区组装分子的基因相关的核小体组蛋白h3发生h3k27me3修饰，进一步抑制cep162与arhgef18基因转录与鞭毛末段过渡区组装和低氧ast；但是低氧抑制asxl2基因表达，其作用机制与常氧相反，最终导致低氧ast。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.asxl2基因调控精子形成基因表达在制备防治精子尾部畸形药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述asxl2基因招募prc2复合物后与prc2复合物中的催化亚基ezh2结合形成asxl2-ezh2复合体，asxl2-ezh2复合体抑制过渡区组装分子的表达以减少精子尾部畸形的发生。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述过渡区组装分子包括cep162基因和arhgef18蛋白。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述asxl2-ezh2复合体通过对靶基因cep162相关组蛋白进行h3k27me3修饰直接参与过渡区组装分子的表达调控。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述asxl2基因结合到cep162基因启动子上游-200bp至1bp的点位上。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述精子为人类、羊驼、大鼠与小鼠精子中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述精子为精原干细胞、精母细胞、圆形精细胞、成熟精子中的任意组合。
技术总结