本发明涉及分子生物学和核酸检测
技术领域：
。具体的说，本发明涉及对食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法。
背景技术：
：椰毒假单胞菌酵米面亚种(pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans)简称椰酵假单胞菌,是1977年在我国东北酵米面中毒食物中发现的一种新的食物中毒菌,在2003年被划为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)的一个病原型,中毒后平均死亡率可达41.8%。该菌产生的米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物。椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒流行区域广,涉及食品种类多,主要包括谷类发酵制品,变质银耳及薯类制品等。目前对椰毒假单胞菌酵米面亚种的检验主要是采用传统的检测方法,如gb/t4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》,整个检验过程包括细菌增菌、分离纯化、生化鉴定、血清分型等,该过程检测周期长易受环境及人为因素的影响且灵敏度不高。在遇到突发疫情时,用传统的检测方法很难满足需求。通过多年研究,椰毒假单胞菌酵米面亚种的保守序列16srrna、23srrna以及16s~23srrna间区序列已经比较明确,研究者相继建立了基于序列的pcr、产物测序分析等椰毒假单胞菌酵米面亚种分子分析技术,但这些技术大多需依赖后续的电泳过程,操作过程相对繁琐。目前,在细菌和病毒检测领域pcr技术和实时荧光pcr技术已得到广泛应用。但是普通pcr法需要电泳后查看结果。而基于taqman探针实时荧光pcr检测具有灵敏度高、检测迅速、操作简单、定量准确的优势,在致病菌检测中得到广泛的应用。综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的实时荧光检测方法。因此，本领域迫切需要开发高特异性、高灵敏度的食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的实时荧光pcr定性定量检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确、简便的食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法。本发明的技术方案为：一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针；所述的扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对包括：seqidno.1：16s-r:5’-gaatcctaccgtggtgaccgtcctccttgcg-3’1460-1430；seqidno.2：16s-f:5’-agcatgccgcggtgaatacgttcccgggtctt-3’1341-1372。所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针是taqman探针。进一步的，所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针具有选自以下的核苷酸序列：seqidno.3：16s-p:acaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccac(famdt)(dspacer)(bhq1dt)gaagtggctagtc(phosphate)1377-1425。进一步的，在探针中间距5’端37bp的位置处采用dspacer修饰，dspacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰。进一步的，所述荧光基因采用fam，所述淬灭基团采用bhq1。进一步的，本发明方法包括以下步骤：s1.提取待测样品的dna；s2.根据如权利要求1所述的序列组成合成特异性引物，与根据权利要求2的序列组成合成特异性探针；s3.在反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光信号。本发明中，扩增方法采用重组酶介导等温核酸扩增技术对目标核酸序列进行扩增，并通过荧光探针法进行实时检测。进一步的，步骤s1中，样本处理方法为：待检样本核酸提取采用全自动核酸提取仪，具体提取方法按照现有技术进行。进一步的，本发明步骤s3中，反应体系以50ul计为：组分用量abuffer40.9μl上游引物（10μm）2.0μl下游引物（10μm）2.0μl探针（10μm）0.6μldna样本2.0μlbbuffer2.5μl进一步的，本发明步骤s3中，包括以下操作步骤：向装有反应干粉的检测单元管中加入40.9μlabuffer、2.0μl上游引物（10μm）、2.0μl下游引物（10μm）、0.6μl探针（10μm），最后加入2.0μl待测dna样本，再向检测单元管盖上加入2.5μl的buffer,盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10sec,混匀后将检测单元管放入荧光定量pcr仪中，开始检测。进一步的，本发明步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热37-41℃，35-48s,1-3个循环，不采集荧光信号；扩增37-41℃，25-35s,35-45个循环，采集荧光信号。进一步的，本发明步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热39℃，40s,1个循环，不采集荧光信号；扩增39℃，30s,40个循环，采集荧光信号。进一步的，提供一种在检测食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌应用的快速检测方法。本发明建立的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法,具有特异性强,灵敏度高,检测快速等特点,能满足日常快速检测食品的要求,同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用，具有较好的应用前景。附图说明图1为本发明灵敏度检测结果图；图2为本发明特异性检测结果图；图3为本发明重复性检测结果图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。实施例一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针；所述的扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对包括：seqidno.1：16s-r:5’-gaatcctaccgtggtgaccgtcctccttgcg-3’1460-1430；seqidno.2：16s-f:5’-agcatgccgcggtgaatacgttcccgggtctt-3’1341-1372。所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针是taqman探针。进一步的，所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针具有选自以下的核苷酸序列：seqidno.3：16s-p:acaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccac(famdt)(dspacer)(bhq1dt)gaagtggctagtc(phosphate)1377-1425。进一步的，在探针中间距5’端37bp的位置处采用dspacer修饰，dspacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰。进一步的，所述荧光基因采用fam，所述淬灭基团采用bhq1。进一步的，本发明方法包括以下步骤：s1.提取待测样品的dna；s2.根据如权利要求1所述的序列组成合成特异性引物，与根据权利要求2的序列组成合成特异性探针；s3.在反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光信号。本发明中，扩增方法采用重组酶介导等温核酸扩增技术对目标核酸序列进行扩增，并通过荧光探针法进行实时检测。进一步的，步骤s1中，样本处理方法为：待检样本核酸提取采用全自动核酸提取仪，具体提取方法按照现有技术进行。进一步的，本发明步骤s3中，反应体系以50ul计为：组分用量abuffer40.9μl上游引物（10μm）2.0μl下游引物（10μm）2.0μl探针（10μm）0.6μldna样本2.0μlbbuffer2.5μl进一步的，本发明步骤s3中，包括以下操作步骤：向装有反应干粉的检测单元管中加入40.9μlabuffer、2.0μl上游引物（10μm）、2.0μl下游引物（10μm）、0.6μl探针（10μm），最后加入2.0μl待测dna样本，再向检测单元管盖上加入2.5μl的buffer,盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10sec,混匀后将检测单元管放入荧光定量pcr仪中，开始检测。进一步的，本发明步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热37-41℃，35-48s,1-3个循环，不采集荧光信号；扩增37-41℃，25-35s,35-45个循环，采集荧光信号。更进一步的，本发明步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热39℃，40s,1个循环，不采集荧光信号；扩增39℃，30s,40个循环，采集荧光信号。进一步的，提供一种在检测食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌应用的快速检测方法。本发明实施例中，taqman聚合酶链反应技术利用taq酶5′→3′外切酶活性，在延伸的过程中实现对杂交探针的切断，消除探针3′端荧光基团对5′端标记报告荧光基团信号的淬灭作用。荧光信号的强弱与pcr产物的数量呈正比，检测系统通过检测荧光可推测pcr产物的数量。本发明实施例中，除了检测所针对的靶序列以及相应采用的引物(对)和探针等与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提dna、pcr扩增和荧光检测等步骤的条件可与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。当然，也可采用本申请实施例中所给出的优选条件。本发明实施例中，实时荧光检测结果表明，仅在含唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的标本表现阳性，达到了预期的效果。这表明，通过合理选择出的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针是极为有效和特异的。本发明实施例中，本发明通过设计的引物和探针，采用实时荧光pcr检测技术，检测和鉴定食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。在反应设计的标准参照物可发出明显的可检测信号及空白对照无可检测信号情况下，根据样品实施实时荧光pcr扩增是否有明显的可检测信号判断样品是否受唐菖蒲伯克霍尔德氏菌污染。实验效果测试1.灵敏度检测结果如图1所示，表明以不同浓度梯度（10ng/µl、1.0ng/µl、100pg/µl、10pg/µl、1.0pg/µl）标准菌株基因组dna为模板，进行raa检测方法的灵敏度验证实验。最低可检出1.0pg/µl的基因组dna。空白及阴性对照均无扩增曲线出现。2.特异性检测以阴性对照菌株和从食品中分离的3株目标菌株基因组为模板，验证raa检测方法的特异性。结果如图2所示，表明只有标准菌株和分离的目标菌株出现特异性的扩增曲线，空白对照和其他细菌均未出现相应的扩增。3.重复性检测以最低检测模板浓度（10pg/µl），进行3组平行实验，验证raa检测方法的重复性。结果如图3所示，表明3组平行均出现扩增曲线，而空白对照和阴性对照无扩增曲线，说明raa检测方法具有较好的稳定性。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。序列表<110>广东产品质量监督检验研究院（国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室）<120>一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>31<212>dna<213>artificialsequence<400>1gaatcctaccgtggtgaccgtcctccttgcg31<210>2<211>32<212>dna<213>artificialsequence<400>2agcatgccgcggtgaatacgttcccgggtctt32<210>3<211>50<212>dna<213>artificialsequence<400>3acaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccacgaagtggctagtc50当前第1页1 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技术特征：1.一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针；所述的扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对包括：seqidno.1和seqidno.2所示的引物；
所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针是taqman探针。
2.根据权利要求1所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针具有选自以下的核苷酸序列：如seqidno.3所示。
3.根据权利要求2所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，在探针中间距5’端37bp的位置处采用dspacer修饰，dspacer分子两侧的分别被荧光基团和淬灭基团取代，在探针的3’末端通过基团phosphate修饰。
4.根据权利要求3所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述荧光基因采用fam，所述淬灭基团采用bhq1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.提取待测样品的dna；
s2.根据如权利要求1所述的序列组成合成特异性引物，与根据权利要求2的序列组成合成特异性探针；
s3.在反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光信号。
6.根据权利要求5所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，步骤s3中，包括以下操作步骤：向装有反应干粉的检测单元管中加入40.9μlabuffer、2.0μl上游引物（10μm）、2.0μl下游引物（10μm）、0.6μl探针（10μm），最后加入2.0μl待测dna样本，再向检测单元管盖上加入2.5μl的buffer,盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10sec,混匀后将检测单元管放入荧光定量pcr仪中，开始检测。
7.根据权利要求6所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热37-41℃，35-48s,1-3个循环，不采集荧光信号；扩增37-41℃，25-35s,35-45个循环，采集荧光信号。
8.根据权利要求7所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，步骤s3中，扩增程序为：荧光通道选择fam通道，反应程序：预热39℃，40s,1个循环，不采集荧光信号；扩增39℃，30s,40个循环，采集荧光信号。
9.根据权利要求8所述的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，其特征在于，在检测食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的应用。
技术总结本发明提供一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法，包括：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针；所述的扩增唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的特异性引物对包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物；所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性探针是Taqman探针。本发明建立的食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法,具有特异性强,灵敏度高,检测快速等特点,能满足日常快速检测食品的要求,同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用，具有较好的应用前景。
技术研发人员：张娟;綦艳;佘之蕴;周臣清;严家俊;杨纯佳
受保护的技术使用者：广东产品质量监督检验研究院(国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室)
技术研发日：2021.03.31
技术公布日：2021.08.03
