本发明涉及诊断技术领域，尤其涉及一种检测小儿脑性瘫痪的试剂盒及其应用。
背景技术：
小儿脑性瘫痪(cp)是由发展中的胎儿或婴儿大脑中发生的非进行性疾病引起的包括运动和姿势发展在内的一组永久性疾病，每千名活产婴儿中约有2-3名受到影响。cp的运动障碍常伴有感觉、认知、沟通、行为的障碍以及癫痫和继发性肌肉骨骼问题。窒息、早产、宫内感染、围产期中风和具有cp的兄弟姐妹被认为是cp的危险因素。
线粒体在人脑和肌肉中含量很高，它们是细胞器，主要通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(atp)，这是电子传输链(etc)中的一系列化学反应。另外，线粒体在细胞活动如细胞凋亡和钙调节中起着重要作用，它们是主要的细胞内来源和对线粒体有毒的活性氧(ros)的直接靶点。线粒体dna(mtdna)是一类小的、环状且多拷贝的基因组。它包含编码etc酶复合物的部分蛋白质和线粒体内蛋白质合成的部分成分的基因。每个线粒体通常携带约2至10个mtdna拷贝，每个细胞最多可存在1000个线粒体。线粒体功能障碍会影响细胞功能，并与许多人类疾病有关，例如癌症，心血管疾病，糖尿病。近年来，mtdna拷贝数被认为是线粒体功能障碍的潜在生物标志物，据报道，它存在多种疾病，包括癌症风险，心力衰竭和衰老等等。迄今为止，尚未报道关于cp中mtdna拷贝数的变化及其与cp临床特征的关系的研究。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种检测小儿脑性瘫痪的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者线粒体dna的试剂。
在一种实施方式中，所述试剂盒是定量检测受试者线粒体dna的试剂。
在一种实施方式中，所述试剂盒是检测受试者线粒体dna的数字pcr试剂盒。
在一种实施方式这种，所述试剂盒包括检测线粒体基因组试剂和人核基因组的试剂。
在一种实施方式中，所述检测线粒体基因组试剂是检测线粒体基因组中的nadh脱氢酶1基因的试剂，和所述检测人核基因组的试剂是检测人类β-珠蛋白基因的试剂。
在一种实施方式中，检测nadh脱氢酶1基因的试剂包括上游引物5'-attcgatgttgaagcctgagact-3'，下游引物5'-tgacccttggccataatatgatt-3'，和探针：5'-ttcggactccccttcggcaagg-3'。
在一种实施方式中，检测检测人类β-珠蛋白基因的试剂包括上游引物5'-aaaggtgcccttgaggttgtc-3，下游引物：5'-tgaaggctcatggcaagaaa-3'，和探针：5'-ccaggccatcataaaggcaccga-3'。
在一种实施方式中，提供上述试剂盒在检测小儿脑性瘫痪中的应用。
在一种实施方式中，提供上述试剂盒在确定痉挛性小儿脑性瘫痪患者的临床特征严重程度中的应用。
在本发明中发现在各个年龄段，cp组的mtdna拷贝数均低于健康对照组，cp患者中痉挛性偏瘫患者的mtdna拷贝数最高，痉挛性四肢瘫痪患者最低，这两个亚组之间的差异有统计学意义，但痉挛性偏瘫和痉挛性截瘫之间无统计学差异，痉挛性四肢瘫痪和痉挛性截瘫之间均无差异。
基于上述发现，本发明提供了一种检测小儿脑性瘫痪的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者线粒体dna的试剂，特别是一种基于ddpcr技术的检测mtdna拷贝数的试剂盒，本发明试剂盒可以研究mtdna拷贝数在cp儿童中的作用，为探索分子机制和临床研究提供新的线索。
定量实时pcr(qpcr)被广泛用于测量mtdna的含量，该方法通常需要依靠外部标准物质来量化mtdna的相对水平，外部标准物质在每个实验室中可能有所不同。由于mtdna和核dna(ndna)的结构和数量上的差异，从dna提取到定量，mtdna的检测受到多种因素的影响，这表明需要绝对优化的方法来绝对定量mtdna的含量。本发明中使用高通量液滴数字pcr(ddpcr)系统对mtdna进行绝对定量，ddpcr显示出比qpcr更高的精度，并且在无需标准曲线的情况下改善了日常重现性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是基于ddpcr的mtdna拷贝数检测示意图；和
图2是cp组和健康对照组中的mtdna拷贝数随年龄范围的变化图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
一、材料和方法
该研究共纳入182名儿童(104名患有cp的儿童和78名典型的发育中的儿童)，所有患有cp的儿童均来自中国康复研究中心北京博爱医院。从所有病例中收集临床数据，包括性别，胎龄，妊娠和出生细节，出生体重，头围，apgar评分和新生儿事件。所有患者均根据临床标准进行诊断，并根据欧洲cp监测(scpe)提出的指南分为痉挛性(进一步分为偏瘫，截瘫和四肢瘫痪)，共济失调，运动障碍亚型。通过总运动功能分类系统(gmfcs)评估了总运动损伤，并记录了并发症。排除标准包括患有肌张力低下，共济失调，肌病，神经管缺损，遗传综合征，染色体异常和线粒体dna耗竭综合征的儿童。丰台市和西城区妇幼保健院招收了没有精神障碍和神经系统疾病史的健康对照儿童。该研究得到中国康复研究中心北京博爱医院伦理委员会的批准，并征得了所有受试者父母的知情同意。
使用前将所有受试者的外周全血样品收集在edta试管中，并保持在-20℃下。使用tianamp血液dna试剂盒(tiangen，北京，中国)从200μl的每个血液样本中分离出包含细胞核dna(ndna)和线粒体dna(mtdna)的dna样本。dna提取和纯化的步骤按照试剂盒的说明进行。使用nanodrop2000分光光度计(thermoscientific，威尔明顿，美国，美国)测定dna的数量和纯度，所有dna样品的od260/od280值为1.7-2.0。所有dna样品均保存在-70℃下直至使用。
二、引物和探针
用荧光fam(5'-fam/3'-tamra)标记ddpcr系统中使用的探针。mtdna与ndna的比值是衡量mtdna含量的合适方法，因此将mtdna的拷贝数量化为nd1基因(位于线粒体基因组中的nadh脱氢酶1基因)拷贝数与hbb(人类β-珠蛋白基因，位于核基因组中)的单拷贝数之比。使用的特异性引物和探针如下：
nd1:上游引物5'-attcgatgttgaagcctgagact-3'，
下游引物5'-tgacccttggccataatatgatt-3',
探针：5'-fam-ttcggactccccttcggcaagg-tamra-3'；
hbb:上游引物5'-aaaggtgcccttgaggttgtc-3，
下游引物：5'-tgaaggctcatggcaagaaa-3'，
探针：5'-fam-ccaggccatcataaaggcaccga-tamra-3'。
三、ddpcr的步骤
根据制造商的说明，我们通过td-1tmdropletdigitaltmpcr系统(北京新羿生物，产品注册号：20170025；20190065；20192220517)进行了ddpcr。用7.5μlddpcrsupermix(4x)，引物(最终浓度每个400nm)，探针(最终浓度每个200nm)，dna模板(nd1扩增0.1ng和hbb扩增10ng)和去离子水制备30μlddpcr混合物。使用标准方案进行热循环(95℃持续10分钟，然后进行40个循环：95℃持续15s，55℃持续30s和72℃持续30s，1个12℃持续5分钟的循环，于4℃结束)。热循环后，将芯片装载在芯片阅读仪上进行荧光检测。通过以下公式计算每个细胞的mtdna拷贝数：2×100×nd1/hbb，具体参见图1。
四、统计和分析
所有统计分析均使用spss20.0(ibm，ny)完成。cp组和健康对照组之间临床特征分布的差异通过分类变量(性别)的卡方检验和连续变量(年龄，显示为平均值±sd)的学生t检验进行评估。为了比较cp组中的多个亚组，使用单向anova(方差分析)，然后进行lsd(最小显着差异)检验。p<0.05(两尾)被认为具有统计学意义。
五、结果
1.基于ddpcr分析的工作流程
如图1所示，定量dna拷贝数的测定主要包括六个步骤：反应混合物的制备，液滴的产生，pcr扩增，荧光检测，数据分析和比值计算。mtdna和ndna在独立的pcr系统中以相同的pcr程序进行扩增。考虑到单个细胞中mtdna拷贝数和ndna拷贝数之间的数量级不同，用于扩增ndna的dna模板的数量增加到用于扩增mtdna的dna模板的数量的一百倍，从而确保两个扩增系统都在相似的检测范围内。数据分析后，每个细胞的mtdna拷贝数定义为mtdna拷贝数与ndna单拷贝数之比。在制备反应混合物之前，从全血样品中提取dna。纯化的dna用作扩增线粒体或核dna的模板。最终计算出的比值表示每个细胞的mtdna拷贝数。
2.cp患者和健康对照之间的mtdna拷贝数的不同
共有104名cp儿童和78名典型发育儿童参加了研究。如表1所示，cp患者和健康对照者的平均年龄分别为2.83±0.816和2.99±0.645岁(均为2至4岁，p＝0.567)。cp组和健康对照组之间在性别上无显著差异(p＝0.054)。与健康对照组相比，我们观察到cp组的mtdna拷贝数明显减少(216.76±71.39对359.66±72.78，p<0.001)。按性别分组，健康对照组中男性和女性的mtdna拷贝数显著高于cp组(男性，378.25±67.08vs210.14±76.63，p<0.001)，(女性，336.77±74.03vs230.00±60.46，p<0.001)(表2)。此外，cp组的mtdna拷贝数在年龄范围内低于健康对照组：2.1-3岁(217.42±83.87vs337.00±71.57，p<0.001)，3.1-4岁(223.25±62.54vs350.62)±57.31岁，p<0.001)和4.1-5岁(254.40±122.44vs424.80±95.64，p<0.001)。在健康对照组中发现mtdna拷贝数呈增长趋势，随着年龄的增长从2岁到4岁不等(2.1-3vs4.1-5岁，p＝0.039；3.1-4vs4.1-5岁，p＝0.017)。但是，cp组在这些年龄段之间的mtdna拷贝数没有差异(图2)。如图2所示，在各个年龄段，cp组的mtdna拷贝数均低于健康对照组。在健康对照组而不是脑瘫患儿中，mtdna拷贝数随年龄增加而变化的趋势越来越大。与相同年龄范围内的健康对照组相比，*p<0.001。在健康对照中#p<0.05。
表1.cp患者和健康对照的临床特征
cp,小儿脑性瘫痪；gmfcs,总运动功能分类系统；scpe,欧洲cp监测.
表2.依照性别的cp组和健康对照中mtdna拷贝数的不同(平均数±sd).
cp,小儿脑性瘫痪。
3.cp的mtdna拷贝数和临床特征之间的相关性
根据scpe分类，cp被分为以下临床亚型：痉挛(n＝79)，共济失调(n＝4)，运动障碍(n＝10)和未分类(n＝11)。由于后三种亚型的病例较少，我们在研究中将它们归类为非痉挛性cp(n＝25)(表3)。如表3所示，痉挛性cp和非痉挛性cp的mtdna拷贝数没有显著差异(126.84±74.78对118.54±69.68，p＝0.531)。痉挛性cp患者又分为偏瘫(22/79，21.1％)，截瘫(42/79，40.4％)和四肢瘫痪(15/79，14.4％)，我们发现cp患者中痉挛性偏瘫患者的mtdna拷贝数最高(152.27±49.78)，痉挛性四肢瘫痪患者最低(90.64±21.55)，这两个亚组之间的差异有统计学意义(p＝0.001)，但痉挛性偏瘫和痉挛性截瘫之间无统计学差异(152.27±49.78vs129.18±66.61，p＝0.274)，痉挛性四肢瘫痪和痉挛性截瘫之间均无差异(90.64±21.55vs129.18±66.61，p＝0.086)。
gmfcs用于描述cp组的总运动功能障碍，分为五个级别，其中i级表示最小，v级表示最严重的活动受限。大多数cp患者被诊断为i-iii级(74/104，71.1％)(表3)，最常见的并发症是沟通困难(47/104，45.2％)，认知障碍(33/104，31.7％)和皮层视觉障碍(22/104，21.2％)(表1)。根据活动受限的严重程度，将cp患者分为轻度受限组(i，ⅱ，iii级)和重度受限组(ⅳ，ⅴ级)，两组之间的mtdna拷贝数差异无统计学意义(140.64±51.61和122.51±75.89，p＝0.492)。有和没有智力障碍的cp患者之间的mtdna拷贝数也没有显著差异(112.28±54.74vs141.23±61.35，p＝0.114)(表3)。
表3cp组中的mtdna拷贝数和临床特征之间的相关性
#非痉挛性cp包括运动障碍,共济失调和未分类亚型；*p<0.05.
cp,小儿脑性瘫痪；gmfcs,总运动功能分类系统.
小儿脑性瘫痪是由于控制姿势和运动的脑部受伤或发育障碍而发生的，临床特征是行为异常，认知和沟通障碍。线粒体是主要产生能量的细胞器，在大脑和肌肉中含量丰富。在这项研究中，我们通过能够绝对定量mtdna拷贝数的方法观察到cp患者与健康对照之间的mtdna拷贝数存在显著差异。
目前，基于qpcr的方法已广泛用于通过计算线粒体基因与核基因之间的比值来定量mtdna含量。这些方法通常在两个单独的实验中量化线粒体和核基因的相对水平，并且需要在每个实验室中可能不同的外部标准，这使得很难标准化用于临床的方法。如今，ddpcr已发展成为一种功能强大的方法，有望实现高度精确的绝对核酸定量。高度敏感的ddpcr能够检测出mtdna拷贝数太接近的样品之间的差异，这些样品往往无法通过其他mtdna定量方法区分，例如，测量单个细胞的mtdna拷贝数。因此，在本研究中，ddpcr被用于定量mtdna拷贝数。考虑到个体和疾病之间线粒体基因组复制的差异，计算线粒体和核dna之间的比值以最大程度地减少这种影响。
在这项研究中，我们发现，无论性别或年龄，患有cp的儿童的mtdna拷贝数均显著低于健康儿童。线粒体的功能和含量与人体的代谢和发育密切相关，但是随着年龄的增长，线粒体dna拷贝数变化的研究仍存在争议。在这项研究中，健康对照组的mtdna拷贝数随着2至4岁年龄的增加而增加。我们推测，在正常的生长和发育过程中，mtdna拷贝数的增加与代谢和能量合成的需求增加有关。然而，在cp儿童中，按年龄没有发现mtdna拷贝数的显著差异，这表明cp儿童的生长和发育可能受到部分影响，尽管其潜在机制仍不清楚。
痉挛型cp和非痉挛型cp之间的mtdna拷贝数没有显著差异，这表明在各种临床类型的cp中，mtdna拷贝数可能并不表明线粒体损伤的差异。痉挛性cp患儿可进一步分为偏瘫，截瘫和四肢瘫痪，痉挛性偏瘫的mtdna拷贝数明显高于痉挛性四肢瘫痪，与痉挛性cp患者的临床特征严重程度相符。结果表明，mtdna拷贝数的改变反映了痉挛性cp的临床严重性，但需要进一步调查以发现哪些有机物损害(如大脑或肌肉)可以通过患有cp的儿童的mtdna拷贝数来反映。
基于ddpcr的绝对定量，无论性别或年龄范围，与健康对照组相比，cp患者的mtdna拷贝数均下降。此外，线粒体dna拷贝数的改变与cp临床特征的严重性一致。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
1.一种检测小儿脑性瘫痪的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测受试者线粒体dna的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是定量检测受试者线粒体dna的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测受试者线粒体dna的数字pcr试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测人线粒体基因组试剂和人核基因组的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测线粒体基因组试剂是检测线粒体基因组中的nadh脱氢酶1基因的试剂，和所述检测人核基因组的试剂是检测人类β-珠蛋白基因的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，检测nadh脱氢酶1基因的试剂包括上游引物5'-attcgatgttgaagcctgagact-3'，下游引物5'-tgacccttggccataatatgatt-3'，和探针：5'-ttcggactccccttcggcaagg-3'。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，检测检测β-珠蛋白基因的试剂包括上游引物5'-aaaggtgcccttgaggttgtc-3，下游引物：5'-tgaaggctcatggcaagaaa-3'，和探针：5'-ccaggccatcataaaggcaccga-3'。
8.权利要求1-7中任一所述的试剂盒在检测小儿脑性瘫痪中的应用。
9.权利要求1-7中任一所述的试剂盒在确定痉挛性小儿脑性瘫痪患者的临床特征严重程度中的应用。
技术总结