本发明属于大肠杆菌定量检测
技术领域：
，具体涉及基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法。
背景技术：
：大肠杆菌o157(escherichiacolio157)是与食源性爆发相关的最常见的病原菌之一。植物生长的土壤是病原菌潜在的污染来源，粪便中存活的肠道病原菌在它们进入土壤环境后可进一步污染作物和河道，从而增加胃肠道疾病的潜在传播风险。大肠杆菌o157能够在施用粪肥的土壤中长期生存。据报道，大肠杆菌o157:h7在21℃条件下可在土壤中存活200天以上，最高可存活长达600天。即使是在含水量较低的土壤中，肠出血型大肠杆菌也能存活数月之久。一些大肠杆菌可以在河岸土壤以及河流底泥中生长，大肠杆菌o157:h7甚至可以吸收利用土壤中的可溶性物质。病原菌污染作物的潜力，与其在环境中的存活能力有直接的关系，如果病原菌能够存活至作物收获期，则可能通过被污染的作物传播到消费者体内。因此，应对粪便中残留病原菌在土壤中的存活时间和浓度、及其向地表和地下水资源迁移的风险给予充分的关注。近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，大肠杆菌o157:h7的检测方法也越来越多，但是这些方法大部分并不适用于微生物多样性非常高的土壤样品和粪便样品，而且检测时间也较长，定量检测难度较大。因此建立适用于土壤和粪便样品的，快速且灵敏的大肠杆菌o157:h7的定量检测方法十分重要，对畜禽粪肥在农业生态系统的合理施用，农业系统大肠杆菌o157:h7污染的预防及控制均具有重要的意义。技术实现要素：为了克服现有技术中大肠杆菌o157:h7的检测效果不佳的缺陷，本发明提供基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，根据大肠杆菌o157:h7的β-葡萄糖醛酸酶基因组(β-glucuronidasegene)序列设计，特异性强，扩增大肠杆菌o157:h7的准确度高，稳定性好，可有效解决土壤和粪便中大肠杆菌o157:h7定量检测的问题。作为本发明的一方面，本发明提供一种用于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其包括以下步骤，(1)提取样本的微生物基因组dna；(2)将所述基因组dna放入pcr反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、sybrgreenreactionmix、rox和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行pcr扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌o157:h7实时定量pcr的ct值，根据标准对照液的ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌o157:h7，其中所述正向引物的序列如seqidno.1所示，所述反向引物的序列如seqidno.2所示。优选的，所述正向引物和所述反向引物的用量比为1:1。优选的，所述进行pcr扩增，其反应条件为，预变性：95℃3min；变性：95℃20秒；退火：53-63℃30秒；延伸：72℃30秒，采集荧光信号；重复变性至延伸的步骤，总共40个循环。优选的，所述熔解曲线测定，其为在所述延伸步骤后进行，测定条件为65℃升温至95℃，每隔0.5℃收集荧光信号。优选的，最低检测dna浓度为1.5×10-4ng/μl。优选的，土壤中最低检测拷贝数为2.03copies/μldna，0.33copies/ngdna，920copies/g土壤。优选的，步骤(2)中，获得标准对照液中的大肠杆菌o157:h7实时定量pcr的ct值后，以拷贝数的对数为横坐标、ct值为纵坐标，拟合标准曲线，将未知样品的ct值带入标准曲线公式，即可获得待测样品的大肠杆菌o157:h7定量数据。本发明的有益效果：本发明的目的之一采用如下技术方案实现：采用实时荧光定量pcr技术定量检测土壤和畜禽粪便中大肠杆菌o157:h7的引物组，引物序列是：uida-f：5’-gcgaaaactgtggaattggg-3’，seqidno.1；uida-r：5’-accagacgttgcccacataatt-3’，seqidno.2。本发明的目的之二在于提供一种快速检测土壤和畜禽粪便中大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr试剂盒，包括上述特异性引物组，并优化了反应体系，可以特异的从土壤或畜禽粪便样本中检出大肠杆菌o157:h7，与大肠杆菌o157:h7以外的其他细菌无交叉反应；准确度高，重复性好，可用于快速、准确地定量检测肠道菌群中的大肠杆菌o157:h7。本发明的目的之三在于提供一种上述试剂盒在土壤或畜禽粪便科研检测大肠杆菌o157:h7中的应用，进一步优化了pcr扩增条件，荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数线性关系好，定量检测准确度高；且操作简单，自动化程度高，交叉污染少，结果判读明确、直观。本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与土壤和粪便中的其他细菌无交叉反应，能够在1.5小时之内对土壤和畜禽粪便中大肠杆菌o157:h7进行定量检测，具有快速、省事、操作方便等优势，采用实时荧光定量pcr技术，可准确检测出土壤和畜禽粪便中大肠杆菌o157:h7含量，对农业系统大肠杆菌o157:h7污染风险的判定及防控策略的制定有重要意义。附图说明图1为pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为荧光定量pcr标准曲线；图3为荧光定量pcr熔解曲线；图4为土壤样品沙门氏菌荧光定量pcr曲线；图5为土壤样品荧光定量pcr熔解曲线。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。一种快速检测大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr引物组，包括正向引物和反向引物；其中，正向引物uida-f的核苷酸序列为：5’-gcgaaaactgtggaattggg-3’，seqidno.1；反向引物uida-r的核苷酸序列为：5’-accagacgttgcccacataatt-3’，seqidno.2。上述快速检测大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr引物组可应用于制备检测大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr试剂或试剂盒。一种快速检测大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr试剂盒，包括上述的引物组；其中，正向引物和反向引物的用量比为1:1。上述试剂盒还包括sybrgreenreactionmix、rox、无菌水和标准对照液。快速检测大肠杆菌o157:h7的荧光定量pcr试剂盒在土壤或粪便中检测中的应用，包括以下步骤：1)：提取样本的基因组dna；2)：将所述基因组dna放入pcr反应管中，并向管中加入引物组、sybrgreenreactionmix、rox和无菌水，进行pcr扩增和熔解曲线测定。进一步地，所述pcr扩增的反应条件为：95℃3min；95℃20s，63℃30s，72℃30s，40个循环。所述熔解曲线测定的条件为：65℃升温至95℃；每隔0.5℃收集荧光信号。结果判读：在阈值以上有扩增曲线的样本即为阳性样本，根据阳性样本的ct值和标准曲线，即可计算出样本中大肠杆菌o157:h7的丰度，结果判读简单、直观。实施例1：引物特异性分析使用设计的引物，对12株常见的肠道菌进行pcr扩增，以检测本发明中引物对的特异性。将待测菌株在37℃培养至对数期。使用细菌基因组dna提取试剂盒(北京天根，货号dp302)提取待测菌株的dna。然后进行pcr扩增，使用凝胶成像系统观察电泳结果，扩增片段长度应该是132bp，即132bp处出现特异性扩增条带者为阳性，否则为阴性。扩增结果如图1所示，12株细菌的种类和名称如下：1：大肠杆菌标准菌株escherichiacolidh5α(购买自生物公司)、2：阴沟肠杆菌enterobactercloacae(cmcc45301)、3：山夫顿堡沙门氏菌salmonellasenftenberg(cicc21502)4：肠沙门氏菌肠亚种salmonellaentericasubsp.enterica(cicc24119)5：福氏志贺氏菌shigellaflexneri(cicc10865)6：肠出血性大肠埃希氏菌escherichiacolieheco157:h7(cicc21530)、7：肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清型salmonellaentericasubsp.entericaserotypeenteritidis(cicc10982)、8：弗氏柠檬酸杆菌citrobacterfreundii(cicc10296)、9：粪肠球菌enterococcusfaecalis(cicc10396)、10：宋内氏志贺氏菌shigellasonnei(cicc23875)、11：痢疾志贺氏菌shigelladysenteriae(cicc23829)、12：产气肠杆菌enterobacteraerogenes(cicc10293)、ck：空白对照以上标准菌株采购于中国医学细菌保藏管理中心(cmcc)与中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。由图1可以看出，凝胶电泳图显示pcr产物为单一条带，条带长度为132bp，清晰明了，无其他杂条带出现。仅有肠出血性大肠埃希氏菌escherichiacolieheco157:h7(cicc21530)即大肠杆菌o157:h7得到了特异性扩增条带，长度为132bp，而其它菌株均为阴性，说明本发明引物具有特异性，反应体系与待测菌以外的其他细菌无交叉反应。实施例2：标准质粒的构建和标准曲线绘制方法1、阳性标准质粒的构建首先，按常规方法培养大肠杆菌o157:h7菌株(cicc21530)，并提取大肠杆菌o157:h7基因组dna为模板。然后，用正向引物和反向引物扩增阳性对照纯菌的uida基因，扩增体系如下表1：表1最佳扩增条件：94℃熔解30s，63℃退火20s,72℃延伸20s，35个循环之后72℃延伸10min。扩增时对扩增条件进行调整，退火温度由53-57℃调整至63℃，同样的样品进行检测后，获得的条带的亮度增加，暗带减少，效果更好。将pcr产物纯化，并用cycle-purekit(omegabio-tek)纯化。纯化之后用2％的琼脂糖凝胶电泳检测产物是否为单一条带，将纯化好的pcr产物连接到peasy-t3(transgenbiotech,beijing)载体上，转化感受态细胞(详细克隆步骤参见试剂盒说明书)，通过蓝白斑筛选随机挑取6～8个转化子用m13通用引物验证阳性，并将阳性转化子保存于含有0.1g/l氨苄青霉素的lb培养液中(将培养液与灭菌的80％甘油混合后在-20℃冷冻保存)。最后，经测序鉴定后得到阳性转化子，上述阳性转化子携带含有目标的基因质粒。2、实时荧光定量pcr反应及标准曲线绘制扩大培养上述阳性转化子，并提取转化子的质粒dna，用核酸浓度测定仪测定重组质粒dna的浓度，根据下列公式计算得重组质粒拷贝数；拷贝数(copy/μl)＝(l×c)/(n×m×109)其中l：阿伏加德罗常数(avogadro’sconstant)，为6.02×1023/mol，c：测得的质粒浓度(单位：ng/μl)，n：质粒的长度，即目标基因与克隆载体的长度之和，即3168bp。m：dna碱基对的平均分子量，即660g/mol。将提取的质粒进行10倍的梯度稀释，用来制作荧光定量标准曲线，扩增体系如下表2所示：表2扩增条件为：95℃3min；95℃20s，63℃30s，72℃30s，40个循环。熔解曲线测定条件为：65℃升温至95℃；每隔0.5℃收集荧光信号。结果如图2所示，横坐标代表质粒拷贝数的对数(x)，纵坐标为ct值(y)；在此基础上得到的相应的回归方程为y＝-3.0587x 35.9，回归方程与标准曲线的相关系数r2为0.9941，且在扩增过程当中无引物二聚体和非特异性扩增产物出现(图3)，所建立pcr方法的引物特异性好。实施例3：土壤大肠杆菌o157:h7定量的特异性实验用常规方法培养大肠杆菌o157:h7纯菌，收集菌体细胞，并进行10倍的梯度稀释，然后添加到土壤样品中，土壤采集自江苏常熟的农田土壤，提取土壤微生物dna，采用建立的实时荧光定量pcr方法对提取的土壤微生物dna中的大肠杆菌o157:h7进行定量，同时对添加的纯菌稀释液进行测定，结果如图4和图5所示，土壤样品中检出的大肠杆菌o157:h7数量略高于实际添加的纯菌数量，但是不同浓度梯度线性一致，且熔解曲线单一，表明该方法具有良好的特异性，土壤中的微生物没有对本方法造成干扰。最低检测dna浓度：1.5×10-4ng/μl，土壤中最低检测拷贝数为2.03copies/μldna，0.33copies/ngdna，920copies/g土壤。实施例4：大肠杆菌o157:h7定量的重复性实验以108-102copies/μl7个浓度的重组质粒样品以及添加不同浓度大肠杆菌o157:h7的土壤dna样品作为模板，以最佳反应条件进行实时荧光定量pcr的重复性实验，结果见表3。由表3可知，重组质粒样品dna的荧光定量ct值变异系数均小于1％，对于土壤样品，除极低浓度的样品之外，其他样品检测结果变异系数均小于1％，表明建立的实时荧光定量pcr方法具有良好的重复性。综上所述，本发明涉及采用实时荧光定量pcr技术定量检测土壤和粪便样品中大肠杆菌o157:h7的引物组、试剂盒和方法，可有效解决土壤或畜禽粪便中大肠杆菌o157:h7定量检测的问题，其解决的技术方案是，采用实时荧光定量pcr技术定量检测土壤中大肠杆菌o157:h7的引物，引物序列是：正向引物:5’-gcgaaaactgtggaattggg-3’；反向引物：5’-accagacgttgcccacataatt-3’。所述引物组以uida基因作为检测靶基因，所述试剂盒含有所述引物组，可快速判断样品大肠杆菌o157:h7含量。荧光定量pcr是在pcr反应过程中连续监测荧光型号的强弱来实时测定特异性产物的量，并据此推断样品的初始含菌量，不仅具有常规pcr技术的扩增高效率的特点，还具有高度特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，同时避免了后续电泳等步骤，减少了污染和人为操作带来的误差。并且在该实验过程中，证明了该方法具有高度的特异性，同时还有良好的重复性。本发明稳定性良好、重复性高、特异性强，针对较大的样本量可做到同时检测，采用实时荧光定量pcr技术，可准确检测出土壤中大肠杆菌o157:h7含量，对农田土壤或畜禽粪便携带的大肠杆菌o157:h7污染防控策略的制定有重要意义。表3荧光定量pcr重复性实验质粒(copy/μl)均值(ct)标准差变异系数5.42×1089.540.070.74％5.42×10712.770.060.44％5.42×10614.390.040.25％5.42×10518.090.080.47％5.42×10421.320.000.00％5.42×10324.410.050.20％5.42×10228.020.160.56％土壤样品(copy/μl)均值(ct)标准差变异系数1430000013.990.040.25％148000017.060.040.21％10400020.560.000.00％710024.160.060.23％37528.070.050.18％37.530.990.140.46％2.6936.372.526.92％应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。序列表<110>江苏开放大学（江苏城市职业学院）<120>基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法<141>2021-01-26<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>3<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>3gcgaaaactgtggaattggg20<210>2<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>2accagacgttgcccacataatt22当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)提取样本的微生物基因组dna；
(2)将所述基因组dna放入pcr反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、sybrgreenreactionmix、rox和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行pcr扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌o157:h7实时定量pcr的ct值，根据标准对照液的ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌o157:h7，其中所述正向引物的序列如seqidno.1所示，所述反向引物的序列如seqidno.2所示。
2.如权利要求1所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：所述正向引物和所述反向引物的用量比为1:1。
3.如权利要求1所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：所述进行pcr扩增，其反应条件为，
预变性：95℃3min；
变性：95℃20秒；
退火：53-63℃30秒；
延伸：72℃30秒，采集荧光信号；
重复变性至延伸的步骤，总共40个循环。
4.如权利要求3所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：所述熔解曲线测定，其为在所述延伸步骤后进行，测定条件为65℃升温至95℃，每隔0.5℃收集荧光信号。
5.如权利要求1所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：最低检测dna浓度为1.5×10-4ng/μl。
6.如权利要求1所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：土壤中最低检测拷贝数为2.03copies/μldna，0.33copies/ngdna，920copies/g土壤。
7.如权利要求1所述的基于荧光定量pcr技术定量检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于：步骤(2)中，获得标准对照液中的大肠杆菌o157:h7实时定量pcr的ct值后，以拷贝数的对数为横坐标、ct值为纵坐标，拟合标准曲线，将未知样品的ct值带入标准曲线公式，即可获得待测样品的大肠杆菌o157:h7定量数据。
技术总结本发明提供基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，该方法包括：(1)提取样本的微生物基因组DNA；(2)将所述基因组DNA放入PCR反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行PCR扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌O157:H7实时定量PCR的Ct值，根据标准对照液的Ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌O157:H7。本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与土壤和粪便中的其他细菌无交叉反应，能够在1.5小时之内对土壤和畜禽粪便中大肠杆菌O157:H7进行定量检测。
技术研发人员：彭双;王一明;宋丹;周贝贝;魏翠兰
受保护的技术使用者：江苏开放大学(江苏城市职业学院)
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021.08.03
