本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其是涉及一种用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点、应用及产品。
背景技术：
：先天性无虹膜症是一种罕见的、与遗传相关的先天性眼部疾病。无虹膜症是一种虹膜和黄斑中心凹完全或者部分发育不全的眼科疾病。先天性无虹膜的致病机理尚不明确，目前大约2/3的患者有明显的家族病史，多表现为常染色体显性遗传，其余1/3患者呈散发。先天性无虹膜并非完全没有虹膜，一般在前房角镜下可见残存的虹膜根部，组织学上看虹膜仅保留一个小的蒂，通常缺乏肌肉组织，并伴有前房角和睫状体也有改变。它会引发多种眼部病变，如眼球震颤、白内障、青光眼、和角膜浑浊，其中青光眼的发生率约在6％～75％。青光眼是由于睫状突、虹膜突先天发育异常，其位于虹膜基质的部分出现了位置改变，而虹膜后突与睫状体突相连支持着虹膜根部，因此容易是前房变浅，或是小梁区有异常的中胚叶胚胎组织阻塞前房角，从而导致一些青光眼发生。青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，发展迅速，危害性大，持续性的眼内压升高可导致视神经萎缩、视野缩小、视力减退，如不及时治疗，严重者可以导致失明。先天性无虹膜迄今尚无有效治疗办法，准确的基因诊断不但有助于基因突变及功能研究，也有利于开展先天性无虹膜的治疗研究。先天性无虹膜常伴其他眼部异常，且基因型与表现型的关系复杂。尽管目前认为pax6是先天性无虹膜的主要疾病基因，然而尚有许多先天性无虹膜患者不能被pax6基因及已发现的其他基因所解释。在一些家族性和散发的先天性无虹膜病例中未检测到任何pax6基因突变。abcb6、foxe3、pitx2、foxcl、foxd3、foxe3、sox2、cyplbl等相关基因突变的发现，也不足以解释部分先天性无虹膜患者的发病。因此，尚有未知的先天性无虹膜致病基因突变待发现。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本发明的第二个目的在于提供检测上述snp位点的物质在制备用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的产品中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种检测上述的snp位点的引物。本发明的第四个目的在于提供一种检测上述的snp位点的试剂。本发明的第五个目的在于提供一种检测上述的snp位点的试剂盒。本发明提供了用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，所述snp位点位于foxc1基因编码区域由起始密码子起的第301位；当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼。本发明还提供了检测上述的snp位点的物质在制备用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的产品中的应用。进一步的，检测snp位点的物质包括引物、试剂或试剂盒。本发明还提供了一种检测上述的snp位点的引物，所述引物包括foxc1-f和foxc1-r；所述foxc1-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；所述foxc1-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。进一步的，所述foxc1-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，所述foxc1-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列。进一步的，所述foxc1-f和foxc1-r的使用浓度分别独立地为8～12pmol/μl。本发明还提供了一种检测上述的snp位点的试剂，所述试剂包括上述的引物。此外，本发明还提供了一种检测上述的snp位点的试剂盒，所述试剂包括上述的引物或试剂。进一步的，所述试剂盒还包括pcrbuffer、dntpmixture、taqdna聚合酶和水中的一种或多种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，所述snp位点位于foxc1基因编码区域由起始密码子起的第301位，所述位点存在插入突变，当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼；当所述snp位点无该插入序列时表现为正常。所述snp位点插入突变导致了foxc1蛋白功能的损坏，从而引起了患者先天性无虹膜并发青光眼病的发生。本发明提供的引物、试剂和试剂盒能够快速准确的检测foxc1基因中是否存在上述snp位点突变，为检测受试者是否具有潜在患先天性无虹膜并发青光眼的危险提供依据。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的先天性无虹膜并发青光眼家系内患者及正常人foxc1测序图，其中a：正常人；b：患者。具体实施方式除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。根据本发明的第一个方面，提供了用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，所述snp位点位于foxc1基因编码区域由起始密码子起的第301位；当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼。本发明提供的用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，位于foxc1基因编码区域由起始密码子起的第301位，该位点存在插入突变，当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼；当所述snp位点无该插入序列时表现为正常。所述snp位点插入突变导致了foxc1蛋白功能的损坏，从而引起了患者先天性无虹膜并发青光眼病的发生。建立先天性无虹膜并发青光眼的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作和优生优育，有助于先天性无虹膜并发青光眼的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。需要说明的是，所述foxc1基因位于6p25.3，可转录成3983bp的mrna，所述mrna的ncbi登录序列号为：nm_001453.3，直接翻译成554个氨基酸组成的蛋白质分子。基于本发明提供的snp位点的有益效果，本发明还提供了检测上述的snp位点的物质在制备用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的产品中的应用。通过检测本发明提供的snp位点的突变情况，能够有效判断待测样本是否为先天性无虹膜并发青光眼。其中，检测上述的snp位点的物质例如可以为，但不限于引物、试剂或试剂盒。本发明中，检测对象为包括foxc1基因的dna序列，优选为人基因组dna，本发明对所述人基因组dna的来源没有特殊限定，可以来自人体各个组织的样品，优选的来源于外周血。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测上述的snp位点的引物，所述引物包括foxc1-f和foxc1-r；所述foxc1-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；所述foxc1-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。本发明提供的检测上述snp位点的引物，能够快速准确的检测foxc1基因中是否存在上述snp位点突变，具有特异性强、灵敏度高的特点，为检测受试者是否具有潜在患先天性无虹膜并发青光眼的危险提供依据。在本发明中，“同一性”指的是核苷酸序列间的相似性，包括与本发明所述的seqidno.1-2所示的核苷酸序列具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、88％、90％、92％、95％、98％、99％或者更高)同一性、并且具有相同功能的核苷酸序列。当选择seqidno.1-2所示的核苷酸序列作为本发明提供的引物时，具有更强的特异性及更高的灵敏度。“与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85％同一性的核苷酸序列”指的是用于检测snp位点引物，可以为seqidno.1和seqidno.2、或者为与seqidno.1具有至少85％同一性的核苷酸序列和seqidno.2、或者为与seqidno.2具有至少85％同一性的核苷酸序列和seqidno.1、或者为与seqidno.1具有至少85％同一性的核苷酸序列和与seqidno.2具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些优选的实施方式中，所述foxc1-f和foxc1-r的使用浓度分别独立地为8～12pmol/μl，例如可以为，但不限于8pmol/μl、9pmol/μl、10pmol/μl、11pmol/μl或12pmol/μl，优选为10pmol/μl。不同浓度的引物用量扩增的结果有所不同，引物用量较低时，会出现目标条带未被扩增的现象。而当引物用量过高时，会导致单一目标条带过于明亮且弥散。本实施方式通过对引物用量进行优化，使得应用上述用量检测snp位点的结果更加准确。此外，本发明还提供了用于检测上述snp位点的试剂和试剂盒，由于上述试剂和试剂盒均含有本发明提供的检测上述snp位点的引物，因此与其具有相同的有益效果，在此不再赘述。优选地，所述试剂盒还包括pcrbuffer、dntpmixture、taqdna聚合酶和水中的一种或多种。本发明对pcrbuffer、dntpmixture、taqdna聚合酶和水的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规的上述商品即可。本发明中，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：1)以样品基因组dna为模板，以试剂盒中foxc1-f和foxc1-r引物对，进行pcr扩增；2)根据所述pcr扩增的产物判断样品基因组中是否存在所述snp位点基因型的突变；如果所述snp位点的基因型与野生型序列相比插入了tg碱基，则为潜在先天性无虹膜并发青光眼患者，如果所述snp位点无该插入序列，则为正常。下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。实施例1从先天性无虹膜并发青光眼病人家系中筛选foxc1基因的突变位点。1、提取外周血基因组dna：在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取家系成员外周静脉血2～5ml，放入edta抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的edta抗凝血在室温融化后，取500μl离心管，加入等体积te(ph8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。加入180μlte、20μlsds(10％)，8μl蛋白酶k(10mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积5的tris-饱和酚(约300μl)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μl)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。加入等体积的tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液(酚、氯仿各150μl),混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入等体积的tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液(酚、氯仿、异戌醇各100μl)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入1/10体积3mol/l、ph5.2醋酸钠(约30μl)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使dna沉淀于管底，并上清。向dna沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μlte(ph8.0)，4℃过夜溶解dna。对提取的dna行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测dna纯度及浓度。2、外显子组测序：外显子组测序(exomesequencing)是一种新型的基因组分析技术，只需针对全基因外显子(exon)区域的dna即可，取该家系中患者中的1名的基因组dna，由北京诺禾致源有限公司应用agilent的液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域dna进行高效富集，然后在hiseq2000上进行高通量、高深度测序。将hiseq2000测序得到的数据经过数据质控后，对比对到参考基因组上的有效数据进行测序深度、覆盖度的统计。在比对结果的基础上，利用最新版的samtools识别snp、indel(insertion-deletion，插入和缺失)位点，并采用国际惯用的过滤标准对snp、indel位点进行过滤。通过筛选已知数据库(dbsnp、千人基因组、hapmap)，过滤掉常见的多态性位点，得到未知突变。将筛选到的位点结合家系成员的表型及功能预测结果(sift，polyphen2软件预测)，着重关注已报道相关区间内的非同义突变、剪切位点突变以及缺失和插入变异，逐步缩小候选基因的范围，分别以显性遗传模式及新生突变模式(指患者新发生的变异，即患者有而其父母都未有的变异)，最终确定与该家系的表型完全共分离的基因及其突变。结果筛选出foxc1基因编码区域由起始密码子起第301位，所述位点存在插入突变，当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼；当所述snp位点无该插入序列时表现为正常。应用点突变预测程序mutationtaster预测发现，该突变导致了foxc1蛋白功能“diseasecausing”级的损坏，引起氨基酸序列改变、剪切位点的改变及蛋白质截短，从而引起了患者先天性无虹膜并发青光眼的发生。3、sanger测序法验证该家系内患者foxc1基因的突变pcr扩增目的片段：反应条件与反应体系：(1)pcr反应条件：95℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1min30sec，36cycles；72℃10min。(2)反应体系：(takarataq)应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组dna模板与foxc1引物的扩增反应。所述foxc1引物序列信息如下表所示：引物名称5’—3’序号foxc1-ftgacggatgctcaaaagttcaseqidno.1foxc1-rccggcttcttgtcgtcgseqidno.2pcr产物测序：应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，该家系中2名患者foxc1基因编码区域由起始密码子起第301位发生了插入突变，其碱基由--为突变为tg(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变未有报道，且不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库，千人基因组计划，hapmap8数据库及炎黄数据库，表明该突变非常罕见，该突变导致了foxc1蛋白第101位氨基酸后缺失移码，102位后变为终止密码子。应用突变预测程序mutationtaster(http://www.mutationtaster.org/index.html)预测发现，该突变是“diseasecausing”级的损坏，从而引起了该家系中先天性无虹膜并发青光眼的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组dna样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。通过上述分析，证明foxc1基因的该snp的突变可以同来检测患者是否具有潜在患先天性无虹膜伴青光眼的危险。通过将检测者的foxc1基因的相关片段与正常的对应片段比较，确定特检测者的患病风险。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>青岛大学<120>用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点、应用及产品<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1tgacggatgctcaaaagttca21<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2ccggcttcttgtcgtcg17当前第1页1 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技术特征：1.用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的snp位点，其特征在于，所述snp位点位于foxc1基因编码区域由起始密码子起的第301位；
当所述snp位点插入tg碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼。
2.检测权利要求1所述的snp位点的物质在制备用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测snp位点的物质包括引物、试剂或试剂盒。
4.一种检测权利要求1所述的snp位点的引物，其特征在于，所述引物包括foxc1-f和foxc1-r；
所述foxc1-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述foxc1-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于，所述foxc1-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，所述foxc1-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的引物，其特征在于，所述foxc1-f和foxc1-r的使用浓度分别独立地为8～12pmol/μl，优选为10pmol/μl。
7.一种检测权利要求1所述的snp位点的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求4-6任一项所述的引物。
8.一种检测权利要求1所述的snp位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括权利要求4-6任一项所述的引物或权利要求7所述的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcrbuffer、dntpmixture、taqdna聚合酶和水中的一种或多种。
技术总结本发明提供了一种用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的SNP位点、应用及产品，涉及基因检测技术领域，本发明提供了一种用于检测先天性无虹膜并发青光眼病的SNP位点，所述SNP位点位于FOXC1基因编码区域由起始密码子起的第301位，所述位点存在插入突变，当所述SNP位点插入TG碱基时，表现为先天性无虹膜并发青光眼；当所述SNP位点无该插入序列时表现为正常。所述SNP位点插入突变导致了FOXC1蛋白功能的损坏，从而引起了患者先天性无虹膜并发青光眼病的发生。
技术研发人员：郝晓丹;王大博;董斌;续凯歌;姚羿志;朱思敏;吴静;李菲
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：2020.11.24
技术公布日：2021.08.03
