本发明属于端粒酶检测技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统、应用所述检测系统的端粒酶检测方法、肿瘤诊断试剂盒及一种体外筛选抗肿瘤活性成分的方法。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
准确检测患病细胞中的生物标志物对于准确诊断和发病机理研究至关重要。然而，实际情况是，大多数生物标志物并非仅在异常细胞中表达。例如，端粒酶是一种核糖核蛋白，催化端粒酶重复序列(taaggg)n加到端粒末端，在多种恶性肿瘤细胞中过表达。它使肿瘤细胞能够避免端粒长度依赖性细胞凋亡并维持连续分裂，被认为是有前景的肿瘤生物标志物。实际上，除肿瘤细胞外，端粒酶活性还可以在其他非癌性细胞中检测到，例如种系细胞、循环干细胞和高度分裂的皮肤细胞。这些细胞中产生的信号可能会导致假阳性结果，降低评估结果的可信度。
为了降低上述检测过程中的假阳性结果，本领域常用的一种方法为引入其他类型的细胞内生物标记物(例如基因片段)以提高信号保真度，实现更准确的判断。然而，另一类型的生物标志物作为排他性指示剂也可能有其自身的局限性，并且势必将检测的步骤复杂化。
技术实现要素：
本发明设计了一种从目标细胞中获取高保真信号的替代策略。关键设计是仅将识别元件传递给肿瘤细胞，而不是非癌细胞。对于肿瘤细胞，肿瘤微环境最独特的特征可能是酸性细胞外间质。肿瘤组织细胞的细胞外ph值约为6.4，而正常组织细胞的细胞外ph值约为7.4。相反，肿瘤细胞和正常细胞的细胞内ph值没有显示太大差异，并且两者都在7.4左右。基于该研究结果，本发明设计并优化了靶向肿瘤细胞的识别元件，将所述识别元件搭载于端粒酶检测系统，可以有效的解决上述假阳性检测问题。为了实现上述技术问题的选择，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统，所述检测系统为dna四面体，所述dna四面体其中一对顶点具有dna三链体，另一对顶点具有dna双链体；
所述dna三链体由发夹dna链及端粒酶引物链组成；所述dna双链体中荧光剂标记的长链(ld)及淬灭剂标记的短链(sd)部分杂交。
本发明所述端粒酶检测系统的工作原理如下：在dna四面体纳米结构的顶点上设计两种类型的拉伸结构域，制备了dna四面体对接组件(dtda)。当遇到肿瘤细胞时，由于细胞外酸性ph值，dna三链体为了保持其结构完整性会携带dna四面体运送至肿瘤组织。dna四面体载体可以很容易地通过依赖小窝蛋白的途径被细胞吸收，而无需转染剂，并且具有机械刚性，可以保持细胞内的长期稳定性，从而使dtda内化到肿瘤细胞中。然后周围的ph从弱酸性变为弱碱性，胞嘧啶去质子化，导致端粒酶引物链(hts)从dna三链体上解离。分离的hts就像在细胞质中漫游的释放物一样，通过端粒酶添加端粒重复序列而进一步延长。通过末端介导的链置换，延长的hts可以置换sd并在延伸的顶点上与ld杂交，在分离后再次对接。荧光团不再被淬灭剂淬灭，并且可以观察到肿瘤细胞内部的荧光点亮。当遇到非癌细胞时，由于碱性细胞外ph值，hts与dtda分离。作为线性单链聚阴离子大分子，hts无法直接穿透细胞膜进入细胞，从而终止细胞内对接事件。
本发明第二方面，提供一种端粒酶检测方法，所述检测方法采用第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统实现。
本发明所述端粒酶检测方法包括应用于体内或体外组织、细胞中的端粒酶检测，检测目的包括肿瘤的诊断、特别是早期诊断、病程检测及预后判断等，体外检测目的包括应用于抗肿瘤药物的筛选，疾病研究模型的制备等方面。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明首先提供了一种将检测试剂靶向肿瘤细胞的设计思路，基于该设计，本发明联想到采用dna四面体作为载体，为检测系统提供了一定的机械刚性，经验证，上述检测系统实现了对肿瘤细胞环境的良好识别效果，检测灵敏度可达到39个细胞级别，相比现有荧光检测方法更加灵敏。
2、另外，本发明通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了上述检测系统据具有良好的产率，因此，该检测系统的制备方法也较为简便，易于实现工业上的扩大化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述dna四面体对接组件(dtda)用于在肿瘤细胞中成像端粒酶活性的原理图。
图2为实施例1中所述天然聚丙烯酰胺电泳凝胶表征dna三链体(hts hd)的最佳tat含量；
泳道1：hts(40％tat)泳道2：hd(40％tat)；泳道3：hts(40％tat) hd(40％tat)；泳道4：hts(50％tat)；泳道5：hd(50％tat)；泳道6：hts(50％tat) hd(50％tat)；泳道7：hts(60％tat)；泳道8：hd(60％tat)；泳道9：hts(60％tat) hd(60％tat)泳道10：hts(70％tat)；泳道11：hd(70％tat)；泳道12：hts(70％tat) hd(70％tat)；泳道13：hts(80％tat)；泳道14：hd(80％tat)；泳道14：hts(80％tat) hd(80％tat)。
图3为实施例1中所述天然聚丙烯酰胺电泳凝胶表征了ld的最佳立足点长度；
泳道1：ld-4；泳道2：ld-5；泳道3：ld-6；泳道4：sd；泳道5：hts；泳道6：hts-1r；泳道7：ld-4 sd；泳道8：ld-4 sd hts(裂解缓冲液)；泳道9：ld-4 sd hts(hela细胞提取物)；泳道10：hts-1r ld-4；泳道11：hts-1r ld-4 sd；泳道12：ld-5 sd；泳道13：ld-5 sd hts(chaps)；泳道14：ld-5 sd hts(hela细胞提取物)；泳道15：hts-1r ld-5；泳道16：hts-1r ld-5 sd；泳道17：ld-6 sd；泳道18：ld-6 sd hts(chaps)；泳道19：ld-6 sd hts(hela细胞提取物)；泳道20：hts-1r ld-6；泳道21：hts-1r ld-6 sd。
图4为实施例1中所述天然聚丙烯酰胺电泳凝表征dtda组装过程；
泳道1：sd；泳道2：hts(70％tat)；泳道3：d1；泳道4：d1 d2；泳道5：d1 d2 d3；泳道6：d1 d2 d3 d4；泳道7：d1 d2 d3 d4 sd；泳道8：d1 d2 d3 d4 sd hts(70％tat)。
图5为实施例1中所述dtda与细胞端粒酶提取物的荧光光谱图；
其中，图5a为dtda与hela细胞端粒酶提取物或裂解缓冲液反应的荧光光谱；
图5b为dtda与hela细胞端粒酶提取物，hl-7702细胞端粒酶提取物和裂解缓冲液反应的荧光光谱；
图5c为hts构成的dtda与hela细胞端粒酶提取物和裂解缓冲液，hts'构成的dtda与hela细胞端粒酶提取物反应的荧光光谱；
图5d为d3/d4构成的dtda与hela细胞端粒酶提取物和裂解缓冲液，d3'/d4'构成的dtda与hela细胞端粒酶提取物反应的荧光光谱。
图6为实施例1中所述dtda与hela细胞端粒酶提取物或裂解液反应的荧光差异随时间的变化曲线。
图7为实施例1中所述端粒酶检测系统响应hela细胞提取物的光谱图；
其中，图7a为dtda响应hela细胞提取物浓度的荧光光谱；
图7b为slmn在667nm处的响应hela细胞提取物浓度的荧光强度变化和线性检测范围。
图8dtda检测不同类型细胞提取物的荧光强度。
图9dtda孵育的hela细胞的细胞活力。
图10dtda与hela细胞孵育不同时间后的共聚焦荧光图像，比例尺：25μm。
图11dtda与不同种系细胞孵育后的共聚焦荧光图像(a)，dtda与hacat细胞在不同ph培养基中孵育后的共聚焦图像(b)，比例尺：25μm。
图12dtda检测用egcg处理后hela细胞中端粒酶活性的共聚焦荧光图像，比例尺：25μm。
图13流式细胞仪分析不同类型细胞中端粒酶活性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，端粒酶是一种前景良好的肿瘤诊断标志物，然而，现有研究证明，端粒酶不仅出现在肿瘤组织中，某些非癌细胞中也存在端粒酶表达，直接针对端粒酶含量进行检测可能会造成检测结果的假阳性。为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种靶向肿瘤细胞的端粒酶检测系统。
本发明第一方面，提供一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统，所述检测系统为dna四面体，所述dna四面体其中一对顶点具有dna三链体，另一对顶点具有dna双链体；
所述dna三链体由发夹dna链及端粒酶引物链组成；所述dna双链体中荧光剂标记的长链(ld)及淬灭剂标记的短链(sd)部分杂交。
上述方案中，所述dna三链体作为所述检测系统的靶向元件，担负着将所述检测系统靶向肿瘤细胞的作用，这种靶向作用主要基于hoogsteen相互作用实现，所述dna三链体在酸性环境下较为稳定，因此，所述dna三链体将携带所述检测系统进入肿瘤细胞内部，为了实现所述三链体能够对ph6.4～7.4范围的识别作用，本发明针对所述三链体中tat碱基对的含量进行了考察(所述“tat碱基对”表示三链体中第三条链以t碱基与发夹结构中的a＝t碱基对中的a配对)，经验证，所述dna三链体中，tat碱基对的含量占所述三链体中三碱基对含量的60％～80％，可以实现所述三链体的形成，为了实现本发明上述设计效果，所述tat碱基对的含量占所述三链体中碱基对含量的70％。
进一步的，所述发夹dna链为dna四面体组成核苷酸链在顶点处的自身回折；所述端粒酶引物链包括两部分，其5’端为发夹dna链的互补链，3’端为端粒酶的引物序列。
更进一步，所述端粒酶的引物序列为aatccgtcgagcagagtt，当所述端粒酶引物链与dna四面体分离后，可在肿瘤细胞中端粒酶的作用下进行扩展和延伸。与此同时，所述端粒酶引物链中的互补链部分，其序列并不限定具体序列，只需要三链体中所述tat碱基对的含量符合上述含量标准即可。
优选的，所述dna双链体中，所述长链为dna四面体核苷酸链延伸出dna四面体的部分，所述延伸部分包括与短链的互补端及暴露的立足点，所述立足点长度为4～6个碱基，更为优选的方案中，所述立足点长度为5个碱基。
本发明一种效果较好的实施方式中，提供所述端粒酶检测系统的一种具体实施方式，所述检测系统中，各个核苷酸链序列如下表1所示：
表1
其中，所述d1至d4代表dna四面体组成的寡核苷酸，sd代表淬灭剂标记的短链，hts表示端粒酶引物链。其中，d1和d2链中单下划线部分表示dna四面体顶点处发夹结构的序列，hts链中单下划线部分与上述发夹结构中划线部分结合形成dna三链体，hts链中斜体部分为端粒酶引物序列，当hts与dna四面体脱离后在细胞中端粒酶的作用下开始扩增。d3及d4链中，双下划线至波浪线部分为dna双链体中的长链(ld)，其中双下划线部分与sd链中的双下划线部分互补，波浪线部分为长链中暴露的立足点。
优选的，本发明还提供所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统的制备方法，将四面体dna，sd链和hts链的单链寡核苷酸加入缓冲液中混合，将混合体系加热后迅速冷却。
进一步的，所述加热的温度为90～100℃，加热时间为2～4min；效果较好的方案中，将混合体系加热并在95℃下保持3分钟，反应结束后将混合体系加入冰水浴中迅速冷却至温度降至4℃。
进一步的，所述缓冲液为tm缓冲液，其中tris浓度为15～25mm，mgcl2浓度为45～55mm。
上述具体实施方式中，所述dna四面体中d1，d2，d3，d4，sd链和hts链以1：1：1：1：2：2的摩尔比进行混合。
进一步的，所述制备方法中，还包括验证步骤，将退火后的组件通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过泳道中条带的迁移速率判断是否合成所述端粒酶检测系统。
本发明第二方面，提供一种端粒酶检测方法，所述检测方法采用第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统实现。
具体的，一种体外检测的方法中，包括如下步骤：将待测组织与第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统共同孵育2～5h，之后通过原位成像检测待测组织中的荧光强度。
本发明第三方面，提供一种肿瘤诊断试剂盒，所述肿瘤诊断试剂盒中包括第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统。
本发明第四方面，提供一种体外筛选抗肿瘤活性成分的方法，所述方法包括采用第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统对肿瘤模型中的端粒酶含量进行检测。
优选的，所述检测方法可能包括以下步骤：获取待筛选化合物处理后的肿瘤模型，与第一方面所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统共孵育后对其荧光强度进行检测。上述方案中所述肿瘤模型包括肿瘤细胞模型、肿瘤组织模型。目前，针对肿瘤组织的检测中，通过手术等方式摘除的肿瘤组织有携带癌旁组织、甚至正常生理组织的可能性，可能造成检测结果的偏差。本发明提供的靶向检测系统能够实现肿瘤组织的识别及检测，提高检测的准确性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1.实验部分
1.1试剂和原料
dna序列(表1)由生工生物工程股份有限公司(中国，上海)合成和纯化。哌嗪-n-n'-二(2-乙磺酸钠)，焦碳酸二乙酯(depc)处理过的水，40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19：1)溶液，过硫酸铵(aps)，n，n，n'，n'-四甲基乙二胺(temed)，tris碱，牛血清白蛋白，乙二胺四乙酸四钠(edta)，乙二酸-乙二醇醚二胺四乙酸(egta)，硼酸和脱氧核苷酸三磷酸(dntps)购自生工生物工程股份有限公司(中国，上海)。3-[(3-氯酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸(chaps)裂解缓冲液购自密理博(millipore)(美国，马萨诸塞州贝德福德)。sybr金核酸凝胶染料购自赛默飞世尔科技有限公司。二甲基亚砜(dmso)，表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(mtt)购自sigma-aldrich(密苏里州，美国)。胎牛血清(fbs)，mem细胞培养基，胰蛋白酶，青链霉素混合液和磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液购自biologicalindustries(以色列)。所有其他试剂均为分析纯，按原样使用。在整个实验过程中，使用了从up水净化系统获得的超纯水(18.25mω·cm)。
紫外可见吸收光谱记录在tu-1901光谱仪(persee，中国)上。在ls55荧光/磷光分光光度计(perkinelmer，英国)上记录荧光发射光谱。mtt实验中的吸光度测量是在多模式酶标仪(tecan，瑞士)上进行的。将染色的聚丙烯酰胺凝胶在geldoctmxr 成像系统(bio-radlaboratoriesinc.，美国)上成像。共焦荧光图像用油浸物镜(63x)记录在sp8共焦激光扫描显微镜(徕卡，德国)上。流式细胞分析是在novocyte3130流式细胞仪(安捷伦科技公司，美国)中进行的。
表1.本实施例所述dna四面体使用的寡核苷酸序列
d1至d4代表dna四面体组成的寡核苷酸。d1和d2中发夹的茎区域标记为单下划线部分。d3/d4和较短链(sd)之间的互补碱基用双下划线标记，d3和d4中的立足点用波浪线标记。端粒酶底物链的dna(hts)和发夹dna(hd)的碱基以不同的tat含量组装成dna三链体。端粒酶底物(ts)域以斜体表示。hts'是hts的突变体，具有多个碱基被更改。d3'和d4'分别是d3和d4的突变体，其立足点被改变。ld-4，ld-5和ld-6分别具有4个，5个和6个碱基的立足点碱基长度，并用波浪线表示。
1.2实验步骤
1.2.1dtda的制备
将四面体dna，sd链和hts链的单链寡核苷酸(d1，d2，d3，d4)以1：1：1：1：2：2的摩尔比在tm缓冲液(20mmtris，50mmmgcl2，ph6.4)中混合。将反应溶液加热并在95℃下保持3分钟，然后在冰水浴中迅速冷却至4℃。制备的dtda储存在4℃下，终浓度为1μm。
1.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
为了获得合适的tat含量以响应ph6.4和ph7.4的dna三链体转变，将具有不同tat含量的发夹dna和hts在ph6.4或ph7.4下孵育，并通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征样品。通过混合7.5ml的40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(19：1)，5ml的5×trisacetate-edta(tae)缓冲液，12.5ml的去离子水，180μl的0.1g/mlaps和18μltemed的溶液来制备12％的聚丙烯酰胺凝胶。在1xtae缓冲液(40mmtris，1mmedta，ph6.4)或1xtae缓冲液(40mmtris，1mmedta，ph7.4)中于500v电泳1.5h。
为了验证dtda的形成，退火后的组件用8％聚丙烯酰胺凝胶表征。在1×tae缓冲液(40mmtris，1mmedta，ph6.4)和1×tae缓冲液(40mmtris，1mmedta，ph7.4)中于100v电泳4h。
为了优化ld中的粘性末端长度，在端粒酶提取物不存在或存在的情况下，分别将具有4、5和6个碱基的ld-sd双链体与ts在ph7.4的条件下一起孵育。同时，将合成的端粒产物(ts-1r)用作验证链置换反应的参考。在1×tae缓冲液(40mmtris，1mmedta，ph7.4)中，用12％聚丙烯酰胺凝胶在500v下进行电泳2h。
将10μldna样品与2μl6×上样缓冲液混合，然后将5μl混合物上样到凝胶孔中。然后将凝胶用1xsybrgold染色40分钟，并用荧光成像系统照相。
1.2.3细胞培养
宫颈癌细胞(hela)、正常肝脏(hl-7702)细胞、乳腺癌(mcf-7)细胞和人类永生化角质形成细胞(hacat)细胞在补充有10％胎牛血清和100u/ml青霉素-链霉素的mem培养基中生长。将细胞在培养箱中保持37℃且含有5％co2的潮湿气氛的条件中培养。
1.2.4细胞提取物中端粒酶活性的检测
通过chaps方法提取端粒酶。要检测端粒酶活性，需检测2.5μl的1μmdtda，5μl的细胞提取物(500细胞/μl)，5μl的10mmdntp，5μl的1mg/mlbsa，10μl5×trap缓冲液和22.5μl经depc处理的水，并在37℃下孵育，然后进行荧光测量。对于不存在端粒酶的对照实验，使用5μlchaps裂解缓冲液代替细胞提取物。为了确认端粒酶延长dtda的作用，我们使用端粒酶底物结构域中碱基突变的hts’进行了测试。为了确认hts和ld之间的对接对于dtda的作用，使用了在粘性末端域中碱基突变的d3’和d4’进行测试。为了进行灵敏度研究，将不同数量的hela细胞的端粒酶提取物与dtda在37℃下反应3h，并测量荧光光谱。为了进行特异性研究，测试了来自2500个细胞的不同类型的细胞提取物，包括hela、mcf-7、hacat和hl-7702细胞。为了测量cy5的荧光，将激发波长设置为640nm，并记录从660至700nm的发射波长。
1.2.5细胞活力测定
hela细胞以每孔4000个细胞的密度接种在96孔细胞培养板中，在100μl培养基中保持温度为37℃，5％co2培养。24小时后，在新鲜培养基(调节至ph6.4)中，用0至250nm范围内的不同浓度的dtda处理细胞24小时。弃去培养基后，将每个孔用pbs缓冲液洗涤，然后加入100μl5mg/mlmtt。孵育4小时后，弃去mtt溶液，然后注入100μldmso溶解蓝紫色结晶甲臜。用酶标仪测定490nm处的吸光度，并计算细胞活力。
1.2.6端粒酶活性的原位成像
将hela细胞(或mcf-7，hl-7702，hacat细胞)接种到共聚焦培养皿中培养24小时。除去培养基后，将hela和mcf-7细胞用pbs缓冲液洗涤，然后与100μl含100nmdtda的新鲜培养基(将新鲜培养基的ph调节至6.4)孵育3h，以进行共聚焦成像，而hl-7702和hacat细胞与含有100nmdtda的100μl新鲜培养基(ph7.4)孵育。为了验证dtda对不同ph的响应，测试了用100μl含有100nmdtda的新鲜培养基(ph6.4)孵育的hacat细胞。为了研究细胞内端粒酶活性的变化，在添加dtda之前，细胞与不同浓度的egcg预孵育24小时。
1.2.7流式细胞术实验
为了检测细胞内端粒酶，将数量为106的hela细胞接种到24孔细胞培养板中，并在实验前孵育24小时。除去培养基后，将hela和mcf-7细胞与含有100nmdtda的300μl新鲜培养基(ph6.4)孵育，而hl-7702和hacat细胞与含有100nmdtda的300μl新鲜培养基(ph7.4)孵育。在5％co2气氛中于37℃孵育3小时后，弃去培养基。用500μlpbs洗涤细胞，然后在用胰蛋白酶消化1分钟后以1000rpm离心3分钟。最后，将细胞重悬于100μlpbs中以进行流式细胞术分析。
2.结果与讨论
为了使dna三链体对细胞外和细胞内ph变化灵敏响应，优化了三链体中影响酸度相关变构的tat比例含量。ph固定为6.4或7.4，并测试了一系列tat碱基对含量为40％至80％的hd和hts。如图2所示，在ph6.4时，tat含量为40％或50％时，不能形成dna三链体，这是因为质子化胞嘧啶的百分比不足，而tat三联体相对稳定至ph10。当tat含量增加到60％时，迁移速度最慢的亮带出现，表明dna三链体的形成。但是，由于对应于hts和hd的条带仍然存在，因此说明此时，三链体的产量不是绝对的。当tat含量达到70％或更高时，hts和hd完全形成三链体，因为质子化胞嘧啶的百分比足以形成c-g·c 碱基对，可与tat三联体协同产生稳定的结构。在ph7.4时，tat含量在40％到70％范围内不会形成三链dna，但是当tat含量达到80％时仍可以得到三链dna。当tat含量为70％时，hts和hd在ph6.4下稳定地形成三链体，而在ph7.4下解离，这适用于细胞外和细胞内环境之间的三链体转变，因此选择含量70％tat的hd和hts为最优。
为了使端粒酶催化延长的hts能够与ld-sd部分杂交的双链体进行有效的链置换，优化了ld的序列设计。由于链的置换处于动态平衡，并且引入粘性末端可以促进反应的进行。选择包含4、5和6个碱基的粘性末端的ld链进行研究，如图3所示，对于包含4个碱基的粘性末端，在没有端粒酶的情况下(泳道8)，hts不能与ld-sd双链体反应，而在端粒酶的作用下(泳道9)可以与ld-sd双链体反应。然而，新产生的条带较细且被置换的sd的带(泳道9)可忽略，说明链置换效率是有限的。通过使用具有一个端粒重复序列(hts-1r)的合成产物进行比较(泳道10和泳道11)，可以确定新产生的条带是由端粒酶延伸产物和ld组成的双链体。对于包含5个碱基的粘性末端，hts几乎不与ld-sd双链体反应(泳道13)。相反，当hts被端粒酶催化延伸时，它与ld-sd双链体发生有效的链置换，这由端粒产物/ld双链体的较宽条带和出现的清晰可见的sd条带(泳道14)证明。由于染料对高分子量dna的染色能力通常较高，因此双链体和ld之间的条带亮度不同并不能简单地表明它们的数量差异。对于包含6个碱基的粘性末端，尽管端粒酶延长的hts与ld-sd双链体有效地置换了链(泳道19)，但未延长的hts也与双链体反应很大，这会导致相对较高的背景(泳道18)。根据其条带强度计算，在不存在端粒酶和存在端粒酶的情况下，含5个碱基粘性末端的ld-sd链，sd置换量的比例最大。选择它作为最佳的粘性末端长度，以保证促进使用端粒酶链置换与抑制不使用端粒酶的反应之间的平衡。
如图4所示，通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)证明了dtda组装过程。随着各组分链的引入，该结构逐渐形成，并具有良好的产率。根据观察到的对应于hts的条带和dna组装体的迁移位置(与不存在hts的情况相比)，仅在ph6.4而不是ph7.4的条件下才能获得包含hts的完整dtda。
通过荧光光谱，本实施例利用细胞提取物对dtda的可行性进行了体外验证。荧光基团cy5和淬灭基团bhq2分别标记在ld的内部和sd的末端。如图5a所示，由于cy5与bhq2接近，组装的dtda在裂解缓冲液中显示出低荧光，该裂解缓冲液可用于裂解端粒酶提取物的细胞。相反，当与来自宫颈癌(hela)细胞的端粒酶提取物孵育时，dtda产生显着增强的荧光。如图5b所示，当与正常肝细胞(hl-7702)的细胞提取物孵育时，dtda不会显示出增强的荧光，排除了降解诱导的荧光增加的可能性，这表明dtda可以保持稳定，抵抗核酸酶降解。如图5c所示，hts中的端粒酶底物结构域突变为端粒酶无法识别的随机序列结构域(hts'，表1)，则未观察到荧光增加，这证明了在设计的系统中端粒酶延长导致信号产生。同样，如图5d所示，将ld中的粘性末端更改为与hts不互补，则荧光也不会显示增强，这验证了在设计的系统中hts和ld之间对接的作用。
本实施例还测定了dtda在端粒酶作用下荧光强度随时间变化的曲线，如图6所示，在存在和不存在端粒酶提取物的情况下，荧光差异会随着时间的推移逐渐增加，直到180分钟达到饱和。该过程涉及将hts与dtda分离，通过端粒酶催化延长hts，随后与ld对接使其返回dtda。
dadt可以灵敏地响应来自不同数量细胞的端粒酶提取物。如图7a所示随着hela细胞数量的增加(对应于端粒酶活性的提高)，dadt产生了逐渐增加的荧光。这是因为在存在更高的端粒酶活性的情况下，更多的解离hts被延伸，然后返回dadt以产生更高的荧光。如图7b所示，667nm处的荧光强度显示从0到20000的细胞数量迅速增加，并逐渐达到饱和直到40000。在0到3000范围内，荧光强度与细胞数量之间具有良好的线性关系。线性方程为f＝0.02444n(cells) 6.35338，r2＝0.997，其中f是在667nm处记录的荧光强度，n是hela细胞数。通过3σ方法计算出的检出限为39个细胞，比以前报道的某些荧光方法更敏感。
dadt可以特异性响应不同细胞提取物中的端粒酶活性。如图8所示，端粒酶活性在hl-7702细胞和加热的hela细胞提取物中相对较低，但在癌性hela细胞和乳腺癌(mcf-7)细胞提取物中过表达。值得注意的是，在不属于肿瘤细胞的人角质形成细胞(hacat)细胞中，可以检测到高端粒酶活性，这与先前的报道一致。它表明端粒酶活性不仅在肿瘤细胞中可以检测到，而且在非肿瘤细胞中也可以检测到。
在进行细胞成像之前，考察dtda对细胞的毒性。将hela细胞与浓度范围在0至250nm的dtda孵育24小时，然后进行mtt实验。如图9所示，细胞可保持90％以上的活力，表明dtda具有良好的生物相容性。这是因为dtda仅由可被细胞代谢的dna寡核苷酸组成。
dadt的设计是为了实现对肿瘤细胞而不是非癌细胞中端粒酶活性的原位分析，这有利于可靠的癌症诊断和端粒酶致癌研究。选择hela和mcf-7细胞接种在ph值调节至6.4的培养基中，作为具有酸性细胞外ph的肿瘤细胞的模型。选择hl-7702和hacat细胞接种在ph调节至7.4的培养基中，作为具有碱性细胞外ph的非癌细胞的模型。如图10所示，将dtda与hela细胞一起孵育时，观察到逐渐增强的细胞内荧光，直至180分钟不再变化。这是因为完整的dtda在酸性细胞外ph下被内化到细胞中，然后hts在碱性细胞内ph下在细胞内解离，在端粒酶催化下延长，然后与ld互补以产生荧光。荧光主要在细胞质中观察到，这与以前的报道是一致的。dtda的尺寸相对较大，会抑制其通过相对较小的核孔复合物进入核中，从而导致缺乏核信号。
当与不同类型的细胞孵育时，如图11a所示，dtda仅在hela和mcf-7的癌细胞中输出荧光，而在非癌细胞hl-7702和hacat中则不输出荧光。值得注意的是，尽管端粒酶活性在hacat中过表达，但dtda可以明确排除其对癌细胞的错误指示，因为hts在内化进入细胞之前已经被解离，不会发生细胞内对接事件，并且dtda作为一种刚性结构可以保持细胞内部的淬灭状态，因此很稳定。在对照实验中，如图11b所示，将hacat的细胞外ph从7.4更改为6.4，则可以观察到细胞内荧光，这证实了所设计的原理。
此外，作为成像肿瘤细胞端粒酶活性的工具，dtda可以灵敏地响应细胞内端粒酶活性的变化。将细胞与端粒酶抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)预温育24小时，如图12所示，dtda随细胞内egcg浓度的增加而输出逐渐减少的荧光。
为了测试dtda在大量细胞中的性能，需要进一步进行流式细胞仪分析。dtda与106个接种在ph7.4培养基中的hl-7702/hacat细胞孵育，或与106个接种在ph6.4培养基中的hela/mcf-7细胞孵育。然后将细胞洗涤并用胰蛋白酶消化，并将悬浮的细胞(约8×104)用于分析。如图13所示，对于hl-7702和hacat细胞，尽管hacat细胞中端粒酶过表达，但仅检测到微弱的荧光。这表明由于其相应的细胞外ph，dtda对大量非癌细胞没有反应。相比之下，hela和mcf-7细胞中检测到高荧光，因为它们相应的细胞外ph值使dtda在随后的细胞内对接事件中保持了的结构完整性。定量数据揭示了hela和mcf-7细胞相对于非癌性hl-7702和hacat细胞荧光增强的数量级，表明dtda对肿瘤细胞中端粒酶的特异性靶向及其对癌症的良好区分能力。应该注意的是，考虑到某些非癌性病理学检测到的细胞外低ph值，仅酸性细胞外ph不能充分指示肿瘤细胞。因此，细胞外完整性和细胞内端粒酶作用的对接都是dtda的重要功能。
本实施例证明了一种精确地在肿瘤细胞中成像端粒酶活性的新策略。设计的组件分离对接型dna四面体探针(dtda)仅在细胞外酸性ph下可以保持其结构完整性，而在细胞外碱性ph下可以分离含有端粒酶底物的链。一旦进入肿瘤细胞，由于细胞内碱性ph，含有端粒酶底物的链就从组装体中分离出来，并进一步被端粒酶催化，产生带有端粒重复序列的延伸产物，最终通过与dna四面体顶点延伸链的对接而回到dtda。dtda对于原位端粒酶检测显示出良好的生物相容性和较高的灵敏度，更重要的是，它可以在肿瘤细胞而不是非癌细胞中成像端粒酶活性，这为基于端粒酶的癌症诊断和致癌性研究提供了可靠的方法，并为研究靶向细胞中生物标志物的设计策略提供了新的见解。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>山东大学
<120>一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统、端粒酶检测方法及试剂盒
<130>2010
<160>22
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>85
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gaaagaaaagtttttcttttctttctttttacattcctaagtctgaaacattacagcttg60
ctacacgagaagagccgccatagta85
<210>2
<211>85
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gaaagaaaagtttttcttttctttcttttttatcaccaggcagttgacagtgtagcaagc60
tgtaatagatgcgagggtccaatac85
<210>3
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttcttttt60
ctaaccctaactcgctcg78
<210>4
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcatttttt60
ctaaccctaactcgctcg78
<210>5
<211>14
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
agagttagggttag14
<210>6
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
cttcccttccaatccgtcgagcagagtt28
<210>7
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
gaagggaaggtttttccttcccttc25
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
ctttccttccaatccgtcgagcagagtt28
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
gaaaggaaggtttttccttcctttc25
<210>10
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
ctttctttccaatccgtcgagcagagtt28
<210>11
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
gaaagaaaggtttttcctttctttc25
<210>12
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
ctttcttttcaatccgtcgagcagagtt28
<210>13
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>13
gaaagaaaagtttttcttttctttc25
<210>14
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>14
ctttctttttaatccgtcgagcagagtt28
<210>15
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>15
gaaagaaaaattttttttttctttc25
<210>16
<211>36
<212>dna
<213>人工序列
<400>16
ctttctttttaatccgtcgagcagagttagggttag36
<210>17
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>17
ctttcttttcattcggacgaccacagat28
<210>18
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>18
tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttcttttt60
ctaaccctaactcatgat78
<210>19
<211>78
<212>dna
<213>人工序列
<400>19
ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcatttttt60
ctaaccctaactcatgat78
<210>20
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>20
ctaaccctaactctgctc18
<210>21
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>21
ctaaccctaactctgctcg19
<210>22
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>22
ctaaccctaactctgctcga20
1.一种靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述检测系统为dna四面体，所述dna四面体其中一对顶点具有dna三链体，另一对顶点具有dna双链体；
所述dna三链体由发夹dna链及端粒酶引物链组成；所述dna双链体中荧光剂标记的长链及淬灭剂标记的短链部分杂交。
2.如权利要求1所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述dna三链体中，所述三链体中tat碱基对含量占所述三链体中三碱基对含量的70％；
或，所述发夹dna链为dna四面体组成核苷酸链在顶点处的自身回折；所述端粒酶引物链包括两部分，其5’端为发夹dna链的互补链，3’端为端粒酶的引物序列；所述端粒酶的引物序列为aatccgtcgagcagagtt。
3.如权利要求1所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述dna双链体中，所述长链为dna四面体核苷酸链延伸出dna四面体的部分，所述延伸部分包括与短链的互补端及暴露的立足点，所述立足点长度为4～6个碱基，优选的，所述立足点长度为5个碱基。
4.如权利要求1所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统的制备方法，将四面体dna，sd链和hts链的单链寡核苷酸加入缓冲液中混合，将混合体系加热后迅速冷却。
5.如权利要求4所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述加热的温度为90～100℃，加热时间为2～4min；优选的，将混合体系加热并在95℃下保持3分钟，反应结束后将混合体系加入冰水浴中迅速冷却至温度降至4℃；
或，所述缓冲液为tm缓冲液，其中tris浓度为15～25mm，mgcl2浓度为45～55mm；
或，所述dna四面体中d1，d2，d3，d4，sd链和hts链以1：1：1：1：2：2的摩尔比进行混合。
6.如权利要求4所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统，其特征在于，所述制备方法中，还包括验证步骤，将退火后的组件通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过泳道中条带的迁移速率判断是否合成所述端粒酶检测系统。
7.一种端粒酶检测方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求1-6任一项所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统实现。
8.如权利要求7所述端粒酶检测方法，其特征在于，所述端粒酶的体外检测方法中，包括如下步骤：将待测组织与权利要求1-6任一项所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统共同孵育2～5h，之后通过原位成像检测待测组织中的荧光强度。
9.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂盒中包括权利要求1-6任一项所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统。
10.一种体外筛选抗肿瘤活性成分的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-6任一项所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统对肿瘤模型中的端粒酶含量进行检测；
优选的，所述检测方法可能包括以下步骤：获取待筛选化合物处理后的肿瘤模型，与权利要求1-6任一项所述靶向肿瘤的端粒酶检测系统共孵育后对其荧光强度进行检测。
技术总结