本发明涉及医疗诊断领域，具体涉及肠道菌群在疾病诊断尤其是结核菌感染性疾病诊断中的用途。
背景技术：
结核(tuberculosis，tb)是一种古老的传染病，是全球十大死亡病因，也是单一传染病致死的主要原因。这种疾病通常影响肺部(肺结核)，但也可以影响其他部位(肺外结核)。2019年全球范围内估计大约有1000万人感染了结核病，大约有120万未合并hiv的患者因为结核病死亡，大约有20.8万的合并hiv的患者死于结核病(globaltuberculosisreport2020.geneva:worldhealthorganization；2020.licence:ccby-nc-sa3.0igo)。肺外结核病也是结核病的一个重要组成部分，而结核性脑膜炎(tuberculousmeningitis，tbm)作为结核中致死率及致残率最高的类型，对于人类控制结核病至关重要(marais,s.；pepper,m.j.；schutz,c.；wilkinson,r.j.；meintjes,g.presentationandoutcomeoftuberculousmeningitisinahighhivprevalencesetting.plosone2011；sudha,k.；rao,a.v.；rao,s.n.；rao,a.oxidativestressandantioxidantsintubercularmeningitis.indianj.clin.biochem.2002,17,34–41；ray,g.；aneja,s.；jain,m.；batra,s.evaluationoffreeradicalstatusincsfinchildhoodmeningitis.ann.trop.paediatr.2000,20,115–120)。结核性脑膜炎临床症状多样，且确诊需要脑脊液涂片、培养或xpert阳性(suzaanmarais,guythwaites,johanfschoeman.etal.tuberculousmeningitis:auniformcasedefinitionforuseinclinicalresearch.lancetinfectdis2010；10:803–12)，且大多数结核性脑膜炎均继发于肺结核之后，当出现神经系统症状后才引起医生的关注，因此诊断还具有一定的滞后性，在临床上诊断困难且一经诊断治疗时间长后遗症多，严重影响患者的生活质量。但结核性脑膜炎的发病率亦不低。成人结核性脑膜炎占全身性结核病的2.9％-5.9％。巴西一项关于肺外结核病研究，纳入了57217例的肺外结核患者，结核性脑膜炎大约有6％的发生，据此估计每年发生10万以上的新病例(gomes,t.etal.epidemiologyofextrapulmonarytuberculosisinbrazil:ahierarchicalmodel.bmcinfect.dis.14,9(2014))。结核性脑膜炎在儿童中的发生率更高，根据德国的监测数据，在所有儿科结核病患者中，5岁以下儿童中有3.9％发生了结核性脑膜炎，5至9岁儿童中发生结核性脑膜炎的有2.2％，10至14岁儿童中发生结核性脑膜炎的有1.3％(ducomblet,tolksdorfk,karagiannisi,hauerb,brodhunb,haasw,etal.theburdenofextrapulmonaryandmeningitistuberculosis:aninvestigationofnationalsurveillancedata,germany,2002to2009.eurosurveill2013)。调查发现希腊某一家医院中，20年大约有43名儿童被诊断为tbm(buonsensod,serrantid,valentinip.managementofcentralnervoussystemtuberculosisinchildren:lightandshade.eurrevmedpharmacolsci2010；14:845-53)。我国关于结核性脑膜炎的流行病学调查发现，在2002年至2010年期间诊断为结核病并接受抗结核治疗的1212名儿童中，几乎一半患有肺外结核，大约39％患有tbm(wuxr,yinqq,jiaoax,xubp,sunl,jiaoww,etal.pediatrictuberculosisatbeijingchildren'shospital:2002-2010.pediatrics2012；130:e1433-40)。基于其高发病率、致死率且诊断具有滞后性的特点，研究结核性脑膜炎发病机制及找到新的可以辅助诊断结核性脑膜炎的辅助评价指标具有重要现实意义。
随着研究的深入，人们越来越认识到生活在我们肠道内的微生物对人体的重要影响。科学家们也意识到肠道菌群在调节炎症、遗传代谢性疾病、内分泌等方面发挥的重要作用。且现在越来越多的科学家也提出了肠道脑轴的存在，进一步研究发现肠道微生物组通过改变丁酸和丙酸生成物而损害肺结核患者的免疫功能。且脂多糖(lipopolysaccharide,lps)是大肠杆菌细胞壁的主要成分，也被称为内毒素，是巨噬细胞和其他有cd14受体的细胞中几种炎症或感染性反应的触发器。事实上,细菌的内毒素(lps)结合toll样受体(tlr)可以刺激单核细胞和巨噬细胞分泌一氧化氮(no)和炎性物质(细胞因子),如肿瘤坏死因子-α，白介素1-β,白介素-6。nemec学者研究发现给小鼠灌胃大肠杆菌后，可刺激早期的全身免疫反应，其表现为血浆tnf-α和器官no水平的升高。muhammadaslam、nafeesahmad等学者研究表明：炎性细胞因子tnf-a增强脑毛细血管通透性，tnf-a可降低小鼠脑源性内皮细胞中cldn-5启动子活性和mrna表达。而cldn-5作为组成血脑屏障的重要紧密链接蛋白对维持血脑屏通透性具有重要意义。学者也研究发现肠道菌群紊乱影响血脑屏障通透性(branistev,al-asmakhm,kowalc,etal.thegutmicrobiotainfluencesblood-brainbarrierpermeabilityinmice[j].scitranslmed,2014,6(263):263ra158)。
在已有研究基础上，我们创造性的开展了结核性脑膜炎与肠道菌群之间的关系研究，从而完成了本发明。
技术实现要素：
一方面，本发明提供一种结核性脑膜炎易感人群的筛选方法，通过评估人群肠道菌群的丰度状况来判断人群中结核性脑膜炎的易感人员。进一步通过检测受试者粪便样本，通过检测大肠-志贺菌属的相对丰度水平进行对结核性脑膜炎感染易感性诊断的筛查。
进一步，本发明提供一种预测肺结核发展为结核性脑膜炎的风险评估的方法，该方法通过评估肺结核患者的肠道菌群的丰度来评估其发展为结核性脑膜炎的风险。
第二方面，本发明提供一种筛查人群中结核性脑膜炎易感人员的检测试剂盒，该试剂盒包括检测人群肠道菌群丰度的试剂，根据肠道菌群的丰度情况来确定结核性脑膜炎的易感人员。
进一步，本发明提供一种预测肺结核具有发展为结核性脑膜炎风险的检测试剂盒，该试剂盒包括检测肺结核患者肠道菌群丰度的试剂，根据肠道菌群的丰度情况来确定该肺结核患者发展为结核性脑膜炎的风险程度。
第三方面，本发明提供一种肠道菌群丰度的检测试剂在在制备筛查人群中结核性脑膜炎易感人员的检测试剂盒中的用途，通过检测人肠道菌群的丰度来筛查核性脑膜炎的易感人群。
进一步，本发明提供一种肠道菌群丰度的检测试剂在制备预测肺结核具有发展为结核性脑膜炎风险的检测试剂盒中的用途，通过检测肺结核患者的肠道菌群的丰度来确定该肺结核患者发展为结核性脑膜炎的风险程度。
本发明通过肠道特定菌群的丰度检测，可以辅助筛查或预测患者患有结核性脑膜炎的风险程度，该方法简便易行、患者的顺应性高，能够缩短结核性脑膜炎的诊断时间，提高诊断的准确度。进一步为结核性脑膜炎患者的治疗提供了机遇，显著降低了结核性脑膜炎患者后遗症的发生率。
附图说明
图1:三组人群肠道菌群多样性分析(a)ace多样性；(b)good’scoverage多样性；(c)shannon多样性。
图2:为组间属水平肠道菌群堆叠图
图3:为组间属水平差异菌属柱状图及统计分析
图4:物种roc曲线示例图
具体实施方式
用于本发明的肠道菌群的检测方法可以是现有技术的已知方法，例如通过16s测序方法对粪便中提取的菌群dna进行分析的方法。
α多样性是指特定生境或者生态系统内的多样性情况，它可以指示生境被物种隔离的程度，通常利用物种丰富度(种类情况)与物种均匀度(分布情况)两个重要参数来计算。chao1，ace，shannon，observed_species，simpson和good’scoverage六大类常用的α多样性指数来展示。其中chao1、ace指数主要关心样本的物种丰富度信息；good’scoverage反映样本的低丰度otu覆盖情况；observed_species表示能检测到的otu种类情况；simpson、shannon主要综合体现物种的丰富度和均匀度。
通过对肠道菌群的的ace多样性分析发现：健康对照组、结核性脑膜炎组、结核组物种丰富度进行比较，发现对照组与结核性脑膜炎组有显著差异，对照组与结核组有差异，结核组与结核性脑膜炎组之间无差异，即结核及结核性脑膜炎中物种丰富度较健康对照组明显下降，且差异具有统计学意义。good’scoverage多样性反映样本的低丰度otu覆盖情况，三组不同人群中低丰度out覆盖无差别。
shannon多样性主要综合体现物种的丰富度和均匀度，健康对照组较结核性脑膜炎组及结核组、结核组较结核性脑膜炎组有更丰富的物种多样性且物种分布更为均匀。
从不同人群属水平分析肠道菌群的组成，发现三组间存在明显差别，大肠-志贺菌属(能否上位)在结核性脑膜炎组丰度明显升高。
由此可见，大肠-志贺菌属丰度水平的明显升高是结核性脑膜炎患者的显著特征，根据大肠-志贺菌属丰度水平可以筛查人群中结核性脑膜炎的易感人群，进一步对肺结核患者有可能发展为脑膜炎患者的可能性也具有可靠的评估作用。
进一步通过以下实施例来解释和说明本发明。
实施例1：不同组别人群粪便样本收集
1、肺结核确定诊断标准：
痰涂片阳性结核病：符合下列项目之一：
(1)2份标本痰涂片抗酸杆菌阳性。
(2)1份痰标本抗酸染色阳性及有肺结核胸部影像学阳性
(3)1份痰标本涂片抗酸杆菌阳性及分枝杆菌培养阳性并菌种鉴定为结核分枝杆菌复合群。
仅分枝杆菌分离培养阳性肺结核诊断：有肺结核胸部影像学表现，且至少2份痰标本涂片阴性并且分枝杆菌培养阳性，并菌种鉴定为为结核分枝杆菌复合群。
分子生物学检查阳性肺结核诊断：有肺结核影像学表现及结核分枝杆菌核酸检测阳性。
2、结核性脑膜炎诊断标准：hiv阴性，年龄大于13岁。明确或可疑结核性脑膜炎
a)临床标准：脑膜炎症状包括包括发热、头痛、呕吐超过2周。
b)支持标准：ⅰ)脑脊液细胞数≥20/ul，主要已淋巴细胞为主，蛋白含量＞2g/l。ⅱ)ct扫描显示渗出物、梗死灶、脑积水和各种结核瘤组合ⅲ)中枢外结核的证据ⅳ)抗结核治疗的反应
c)排除标准:疟疾、脓毒性、真菌和癌变性脑膜炎。
确定诊断结核性脑膜炎：符合a和c加上脑脊液涂片或培养结核分枝杆菌pcr阳性或elisaigm阳性或抗酸杆菌阳性。提示结核性脑膜炎：符合a和c且符合b中的3条证据或3条证据以上(6)。
3、健康人群判断标准：既往无特殊肺部疾病史、常规体检血常规、肝肾功、电解质、心肌酶、心电图、胸部x线、超声等检查无异常。
4、排除标准
1)、经过系统诊治抗结核治疗。
2)、近期6个月大量使用抗生素治疗治疗超过1周。
3)、既往有胃肠道疾病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎等。
4)、存在免疫系统抑制的人群。
收集结核患者、结核性脑膜炎患者、健康对照组晨起无污染粪便5g左右收集于无菌粪便收集管中，用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段里部，外部容易污染，且接触空气后，部分细菌dna开始降解，粪便采集者在采集粪便过程中要洗手，采集过程中避免二次污染，收集后迅速密闭收集器。低温保存的条件下尽快送回实验室，储存于-80℃冰箱保存备用。
实施例2：粪便组dna提取(采用试剂盒法提取粪便组dna，步骤如下)
1、将0.25g粪便加入干燥的柱状管中。对于脂类、多糖和蛋白质含量特别高的粪便样品，少量的起始物质可以提高dna的吸收率和纯度。
2、向干燥的柱状管中加入750ul的powerbead溶液。
3、加入60ul的溶液c1，简单翻转几次或涡旋。
4、将试管在65℃加热10分钟。
5、使用涡旋适配保持器将柱状管水平涡旋，以最大速度涡旋10分钟。
6、13000g离心1分钟。
7、将离心后的上清液移入一个新的2ml收集管中。预计在400-500ul之间。
8、加入250ul溶液c2并且最大速度涡旋混匀。2-8℃孵育5分钟。
9、13000g离心1分钟。
10、避免收集到沉淀，将600ul上清移入一个新的2ml收集管中。
11、加入200ul溶液c3短暂涡旋。
12、13000g离心1分钟。
13、避免收集到沉淀，将600ul上清移入一个新的2ml收集管中。避免超过750ul。
14、将1200ul的溶液c4加入上清中，涡旋5秒。
15、每次加入650ul的上清液到mb收集柱子上，13000g离心1分钟。弃去滤液，直到所有的上清液通过收集柱过滤。
16、加入500ul溶液c5，13000g离心1分钟。
17、弃去滤液，再次离心13000g，1分钟。
18、小心将mb柱子移入一个新的2ml收集管中。
19、加入100ul溶液c6到白色滤膜的中心。
20、13000g离心1分钟，弃去过滤篮子。dna保存于滤液中。
实施例3：粪便组dna通过16s测序分析肠道菌群组成(b)所用引物序列
1、实验方法：
(1)从样本中提取基因组dna后，用带有barcode的特异引物扩增rdna的保守区(引物序列信息如表1)
表1：引物序列
(2)然后pcr扩增产物切胶回收，用quantifluortm荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，illuminape250上机测序。
2、实验结果
(1)三组人群一般情况分析：
对其一般情况进行分析发现(表2)：健康对照组、结核性脑膜炎组、肺结核组在年龄、性别、身体质量指数总体无差异，
表2.hc组、tbm组、tb组人群人口学特征
(2)三组人群菌群α多样性分析
ace多样性主要关心各组样本的物种丰富度之间比较，选取ace多样性指标在三组间的情况分析，健康对照组的均数为886.3，结核性脑膜炎组均数为600.4，结核组的均数为643.8，可见三组物种丰富度之间存在差异，且组间俩俩比较物种丰富度，对照组与结核性脑膜炎组有显著差异，p＝0.0035，对照组与结核组有差异p＝0.0052，结核组与结核性脑膜炎组之间无差异p＝0.887。由此可见结核及结核性脑膜炎中物种丰富度较健康对照组明显下降，且差异具有统计学意义。(图1-a)
good’scoverage多样性反映样本的低丰度otu覆盖情况，健康对照组中位数为0.998704，结核性脑膜炎组中位数为0.998699，结核组中位数为0.998632，三组比较p＝0.6641，组间两两比较p值均大于0.05。三组不同人群中低丰度out覆盖无差别。(图1-b)
shannon多样性主要综合体现物种的丰富度和均匀度。健康对照组的均数为5.519，结核性脑膜炎组均数为2.728，结核组均数为4.168，三组比较p＜0.0001。三组在物种的丰富度和均匀度存在差别。组间两两多重比较，对照组与结核性脑膜炎组存在差别p＜0.0001，对照组与结核组存在差别，p＝0.0062。结核组与结核性脑膜炎组存在差别，p＝0.0035。可见健康对照组较结核性脑膜炎组及结核组、结核组较结核性脑膜炎组有更丰富的物种多样性且物种分布更为均匀。(图1-c)
(3)不同人群属水平组成分析
然后我们分析了三组人群属水平肠道菌群组成。如图2属水平肠道菌群相对丰度堆叠图，我们统计了属分类水平上的各样品的物种组成情况，堆叠图直观展示不同的样品在各个属水平上的物种丰度的变化情况，我们挑选在所有样本中丰度均值top10的物种详细展示，其余物种统一归类到other类别，无法注释到该水平的tags则被归类到unclassified类别。可见属水平肠道菌群组成在三组存在明显差别，大肠-志贺菌属在结核性脑膜炎组丰度明显升高。
组间两两比较属水平肠道菌群组成如图3。分析健康对照组与结核性脑膜炎组间属水平物种相对丰度的差异，我们发现有38个菌属在两组间存在差异。其中36个菌属在健康对照组中更为富集，我们选取在健康对照组组中相对丰度前10位的分析，发现具有统计学意义的主要有4个属，他们分别为blautia、bifidobacterium、fusicatenibacter、anaerostipes，其p值分别为0.000957028、0.006314、0.01092169、0.048461。2个菌属在结核性脑膜炎中更富集相较于健康对照组，其中一个菌属在两组中相对丰度均较低，不做统计，相对丰度较高的为大肠-志贺菌属escherichia-shigella，其p值为0.003088121。可以看出结核性脑膜炎组中blautia、bifidobacterium、fusicatenibacter、anaerostipes丰度下降，大肠志贺氏属相对富集。
分析结核性脑膜炎组与结核组在属水平之间相对丰度差异，我们发现两组间有4个属水平存在差异。其中有3个属在结核中更为富集，分别是bacteroides、blautia、cag-56，其p值分别为0.003269736、0.017492571、0.031275541。相较于结核组有统计学差异，结核性脑膜炎组有1个菌属富集为大肠-志贺菌属escherichia-shigella，其p值为0.013218208。
可以看出结核性脑膜炎组大肠-志贺菌属较健康对照、结核组均升高，且差异有统计学意义。
(4)roc曲线(受试者工作特征,receiveroperatingcharacteristic)分析可用于评估物种作为biomarker的正确性，即是否能够把样本按预期分成2个分组的能力，该方法综合考虑了物种区分能力的灵敏度和准确度。使用r语言proc包，默认根据t检验、秩和检验获得的两组间的显著差异物种并集对物种逐一进行roc曲线分析，我们发现选用大肠-志贺菌属作为生物学标志物评价具有很高的特异性及灵敏度。如图4用大肠-志贺菌属丰度的变化作为区分健康人群和结核性脑膜炎组人群时，其曲线下面积为0.901，而auc在0.9之上预测具有较高的准确性。而其最佳的临界值为为肠道大肠-志贺丰度达到15.05％时,他的诊断特异性为1，敏感性为0.778。可见具有很高的预测及诊断价值。
1.一种筛查人群中结核性脑膜炎易感人员的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括检测人群肠道菌群丰度的试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，所述肠道菌群丰度是指大肠-志贺菌属的丰度。
3.一种预测肺结核具有发展为结核性脑膜炎风险的检测试剂盒，该试剂盒包括检测肺结核患者肠道菌群丰度的试剂。
4.如权利要求2所述的试剂盒，所述肠道菌群丰度是指大肠-志贺菌属的丰度。
5.一种肠道菌群丰度的检测试剂在在制备筛查人群中结核性脑膜炎易感人员的检测试剂盒中的用途，通过检测人肠道菌群的丰度来筛查核性脑膜炎的易感人群。
6.一种肠道菌群丰度的检测试剂在制备预测肺结核具有发展为结核性脑膜炎风险的检测试剂盒中的用途，通过检测肺结核患者的肠道菌群的丰度来确定该肺结核患者发展为结核性脑膜炎的风险程度。
技术总结