本发明涉及一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，属于环境检测技术领域。
背景技术：
湖泊富营养化是一个亟待解决的国际性问题。近年来，众多研究发现沉积物中磷的二次释放是导致和加速水体富营养化的一个重要原因，而原位钝化技术则被认为是一种控制湖泊内源磷污染的有效方法，该方法通过向湖泊中投加固磷剂，使其与沉积物接触，进而达到降低沉积物中磷活性、原位控制湖泊内源磷污染的目的。目前常用的固磷剂主要有铁盐、铝盐、钙盐、硝酸盐、铝改性沸石、镧改性膨润土以及给水厂铁铝泥等等。固磷剂在广泛应用前需要通过有效可靠的方法来评价其实际应用的安全性。传统的理化分析方法往往通过物质中有害成分的浓度值来反映污染与危害程度，并不能全面反映物质中各种有害成分的综合影响，相比之下，生物毒性实验是检测物质毒性最直接有效的办法。藻类作为水环境中的初级生产者，是水环境质量的重要指示物种之一，多数种类的藻都对毒性物质比较敏感，且易于在实验室培养，目前已建立了一套比较成熟的藻类生物毒性测试系统。其中藻的生长抑制实验通过监测细胞密度和叶绿素含量指标，可以直观地反映待测物质对藻类的毒性效应。
对于非溶解性固磷剂（如铝改性沸石、镧改性膨润土和给水厂铁铝泥等）而言，在开展藻类生长抑制实验前需要以培养基为浸提剂制备浸提液，然后以培养基为对照组、浸提液为实验组进行实验。由于固磷剂具有强的磷吸附能力，导致在浸提液制备过程中会吸附浸提剂中的磷，从而使得浸提液中磷缺乏。磷是限制藻生长的关键营养元素，作者在实验室进行的oecd培养基的磷控制实验结果表明，在磷酸盐是限制藻生长的唯一因素的条件下，从48h至120h，磷浓度和藻细胞密度以及叶绿素a含量均呈现出较好的线性关系，r2分别为0.968-0.992和0.964-0.999。因此，在低磷酸盐浓度条件下小球藻能够生长，但是生长量显著低于高磷酸盐浓度条件。可见，以此浸提液开展的藻类抑制实验可能受到磷缺乏的干扰，结果并不能真实的反映固磷剂的毒性。
因此，开发一种消除磷干扰的固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，可以准确、全面地评价固磷剂，尤其非溶解性固磷剂应用于水环境修复的安全性，具有广阔的推广应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，解决非溶解性固磷剂在进行藻类毒性检测时易受到磷干扰的问题。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，包括如下步骤：
制备浸提液：以藻类培养基为浸提剂，将浸提剂与铁铝泥按照一定比例混合后过滤得固磷剂浸提液；
设置处理组：设置缺磷培养基、固磷剂浸提液、添加磷后固磷剂浸提液为处理组，每个处理组设有若干平行样；
测定磷酸盐含量：采用磷钼蓝分光光度法对处理组进行磷酸盐含量测定；
藻类生长抑制实验：以普通小球藻为对象，设置藻类培养基为对照组，处理组为实验组进行藻类生长抑制实验。
进一步的，所述将浸提剂与铁铝泥按照1:5~1:500的比例混合。
进一步的，所述浸提剂与铁铝泥混合后在20±2°c和60rpm条件下振荡24h以上，过滤后的滤液用于实验或者避光保存冷藏。
进一步的，所述缺磷培养基为不添加磷酸盐的缺磷藻类培养基；所述添加磷后固磷剂浸提液是向固磷剂浸提液中加入藻类培养基中使用的磷酸盐。
进一步的，所述添加磷后固磷剂浸提液与藻类培养基中的磷酸盐浓度相等，所述缺磷培养基中与固磷剂浸提液中的磷酸盐浓度相等。
进一步的，所述藻类生长抑制实验过程中，还包括定时检测藻液中的藻细胞浓度和叶绿素a含量。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明提供的提供一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，可规避非溶解性固磷剂在进行藻类毒性检测时易受到磷干扰的不足；且适用于所有类型的非溶解性固磷剂，具有广阔的推广应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中小球藻暴露于对照组和不同处理组的细胞密度柱形图；
图2是本发明实施例中小球藻暴露于对照组和不同处理组的叶绿素a含量柱形图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明对非溶解性固磷剂浸提液进行藻类生长抑制实验过程中消除磷干扰具体技术方案如下：
浸提液的制备：以经济合作与发展组织推荐的oecd培养基为浸提剂，具体包括有：nh4cl15mgl-1、mgcl2·6h2o12mgl-1、cacl2·2h2o18mgl-1、mgso4·7h2o15mgl-1、kh2po41.6mgl-1、fecl3·6h2o80μgl-1、na2edta·2h2o100μgl-1、h3bo3185μgl-1、mncl2·4h2o415μgl-1、zncl23.0μgl-1、cocl2·6h2o1.5μgl-1、cucl2·2h2o0.010μgl-1、na2moo4·2h2o7.0μgl-1、nahco350mgl-1，将给水厂铁铝泥按照1:10的比例与浸提剂混合，在20±2℃和60rpm条件下振荡24h，过0.22μm滤膜，滤液避光保存在4℃冰箱中，24h内用于实验。
磷酸盐（po4-p）含量的测定：采用中华人民共和国国家环境保护标准《hj593-2010水质单质磷的测定磷钼蓝分光光度法》测定，本实施例中给水厂铁铝泥浸提液未检测到磷，说明浸提剂中的磷全部被铁铝泥所吸附。
处理组的设置：处理组①配制缺磷oecd培养基，不添加kh2po4；处理组②铁铝泥浸提液；处理组③向铁铝泥浸提液中加入kh2po4（oecd培养基中所使用的磷酸盐）至终浓度为1.60mgl-1，此kh2po4浓度与oecd培养基中浓度相等。
藻类生长抑制实验：以普通小球藻为对象，以oecd培养基为对照组，处理组①②③为实验组进行藻类生长抑制实验，每组设置3个平行样。对照组和所有处理组置于智能人工气候培养箱中培养，温度为25±1°c，光暗时间比为14h：10h，光照强度为100±5μem-2•s-1，为避免小球藻沉降和保证充分光照，每天早中晚振荡三次，每24h取藻液测定藻细胞浓度，提取叶绿素并测定。
小球藻暴露于对照组和不同处理组的细胞密度见图1所示，图中，误差棒代表平均数±标准偏差（n=3）。*代表相同暴露时间内不同处理组与对照组具有显著性差异（p<0.05）
由图1可知：处理组①小球藻的细胞密度在24h时显著（p<0.05）高于对照组，在48和72h时与对照组相近，而在96h暴露之后则显著（p<0.05）低于对照组。处理组②小球藻的细胞密度在24-72h时均显著（p<0.05）高于对照组，而在96-120h时则显著（p<0.05）低于对照组。处理组③在整个实验周期中均显著（p<0.05）促进小球藻的生长，藻细胞密度分别达到对照组和处理组②的2.45–2.93和1.51–3.34倍。整个实验周期内，处理组②的小球藻细胞密度高于处理组①
小球藻暴露于对照组和不同处理组的叶绿素a含量见图2所示，误差棒代表平均数±标准偏差（n=3）。*代表相同暴露时间内不同处理组与对照组具有显著性差异（p<0.05）。
由图2可知：对照组中的小球藻的叶绿素a含量随着时间而增长，然而，处理组①和处理组②小球藻的叶绿素a含量随着时间增长几乎没有变化。在24h时，与对照组相比，处理组①、处理组②和处理组③小球藻的叶绿素a含量具有很小的差异。经过更长时间的暴露之后（48-120h），处理组①和处理组②小球藻的叶绿素a含量显著（p<0.05）低于对照组，最小值分别是对照组的21%和17%；处理组③在48-72h显著（p<0.05）增加了小球藻的叶绿素a含量，最大值达到对照组的1.58倍，随后在120h与对照组无显著性差异。因此，整个实验周期内，处理组②的小球藻叶绿素a含量与处理组①无显著差异。
从传统的藻类生长抑制实验结果来看，铁铝泥浸提液中藻细胞密度和叶绿素a含量这两项指标都低于空白对照组，对小球藻表现出生长抑制作用，似乎是有毒性的，而缺磷培养基中藻细胞密度和叶绿素a含量都显著低于空白对照，说明即使是安全的藻类培养基若出现磷缺乏也会引起小球藻生长抑制。铁铝泥浸提液中的藻细胞密度高于缺磷培养基，说明在相同的磷缺乏条件下，铁铝泥对小球藻的生长抑制作用弱于缺磷培养基；添加磷后的铁铝泥浸提液中藻细胞密度和叶绿素a含量显著高于空白对照组，表现出对小球藻生长的促进作用。
综上所述，在制备铁铝泥浸提液过程中，铁铝泥将浸提剂中的磷全部吸附，导致浸提液中无磷，而浸提液对小球藻所表现出的生长抑制作用正是由于磷缺乏引起的。可见，传统的藻类抑制实验方法可能会由于“缺磷”的干扰而得到“铁铝泥对小球藻有毒”的错误结论，而本发明则消除了这种干扰，添加磷后的铁铝泥浸提液促进小球藻生长，浸提液中磷缺乏是铁铝泥引起小球藻生长抑制作用的主要原因，揭示了铁铝泥对小球藻真实的影响：即铁铝泥不仅对小球藻无毒，甚至还表现出环境友好性，促进了小球藻的生长。
本发明以藻类培养基为对照组，以缺磷培养基、固磷剂浸提液、添加磷后固磷剂浸提液为处理组开展藻类抑制实验，定时检测溶液中的藻细胞密度和叶绿素a含量。可以规避非溶解性固磷剂在进行藻类毒性检测时易受到磷干扰的不足；适用于所有类型的非溶解性固磷剂，具有广阔的推广应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
1.一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备浸提液：以藻类培养基为浸提剂，将浸提剂与铁铝泥按照一定比例混合后过滤得固磷剂浸提液；
设置处理组：设置缺磷培养基、固磷剂浸提液、添加磷后固磷剂浸提液为处理组，每个处理组设有若干平行样；
测定磷酸盐含量：采用磷钼蓝分光光度法对处理组进行磷酸盐含量测定；
藻类生长抑制实验：以普通小球藻为对象，设置藻类培养基为对照组，处理组为实验组进行藻类生长抑制实验。
2.根据权利要求1所述的一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，所述将浸提剂与铁铝泥按照1:5~1:500的比例混合。
3.根据权利要求1所述的一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，所述浸提剂与铁铝泥混合后在20±2°c和60rpm条件下振荡24h以上，过滤后的滤液用于实验或者避光保存冷藏。
4.根据权利要求1所述的一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，所述缺磷培养基为不添加磷酸盐的缺磷藻类培养基；所述添加磷后固磷剂浸提液是向固磷剂浸提液中加入藻类培养基中使用的磷酸盐。
5.根据权利要求4所述的一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，所述添加磷后固磷剂浸提液与藻类培养基中的磷酸盐浓度相等，所述缺磷培养基中与固磷剂浸提液中的磷酸盐浓度相等。
6.根据权利要求1所述的一种固磷剂浸提液藻类毒性检测方法，其特征在于，所述藻类生长抑制实验过程中，还包括定时检测藻液中的藻细胞浓度和叶绿素a含量。
技术总结