本发明涉及抗氧化多肽提取技术领域，尤其是一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法。
背景技术：
我国是水产大国，水产品拥有广泛的国际市场，被农业部列为重点产业化开发项目。每年我国水产品总产量可达万吨，因此推动了水产品深加工技术的迅速发展。特别是鱼类的加工，加工过程产生大量的下脚料，如鱼鳞，加工过程所产生的鱼鳞一般会废弃扔掉，然而，鱼鳞是具有优异的功效的，首先，鱼鳞，占鱼体重2％一3％，鳞片的主要特性：从外表上看是透明的，像花瓣，且边缘呈微小的卷曲，白色光泽，略带有鱼腥昧，质地坚且柔软，含水量范围16.4％一17.8％，平均为17.5％。而且，营养学家研究发现，鱼鳞是特殊的保健食品。它含有较多的卵鳞脂，把脂肪球分解成乳状液与水交溶，有增强人脑记忆力，缓延细胞衰老的作用。同时，鱼鳞是鱼真皮层的胶原质生成的骨质，学名为鱼鳞硬蛋白。综上所述，鱼鳞本身含有较高的营养价值，直接废弃扔掉，使其不能够得到有效利用，为此，我们提出一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，该方法的使用，能够有效在鱼鳞中提取抗氧化多肽，不仅提高鱼鳞加工的经济价值，而且，还使其鱼鳞得到有效利用，另一方面也降低了采用其它植物来提取抗氧化多肽的需求量。
本发明的技术方案为：
一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：
s1：鱼鳞选取和处理，选取新鲜的鱼鳞，反复在水中清洗，除去鱼鳞附带的杂质，清洗完毕后将其浸泡在60-80℃的温水中60-100min，去除部分腥味，再用清水反复冲洗并沥干，之后将其浸泡在浓度为60-90％的盐溶液中，浸泡时间3-6h，去除剩余的腥味，再用清水反复冲洗并沥干，备用；
s2：破碎，将s1中备用的鱼鳞置于破碎机中进行破碎，破碎后清水过滤，过滤后沥干备用；
s3：搅拌，将s2中已破碎的鱼鳞置于搅拌机中，边搅拌边加水，温度控制在30-40℃，时间1-2天；
s4：第一次离心，将s3中已搅拌的鱼鳞置于高速离心机中，离心机的转数为5000～12000r/min，离心30-60min，并收集上清液；
s5：盐析，将s4中的上清液加入nacl，使nacl浓度为4～5mol/l，搅拌12～24h后，静置12～24h，以转数5000～10000r/min离心20～40min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1l缓冲溶液中含有nacl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入hcl调节ph值至7.2～7.6，且鱼鳞与缓冲溶液的质量体积比为1:20～50g/ml，向上述缓冲溶液加入nacl，使nacl的浓度为1.7～2.4mol/l，静置12h，以转数5000～10000r/min，离心30～60min，得沉淀；
s6：干燥，将上述沉淀经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得鱼鳞蛋白质；
s7：预处理，将s6中制得的鱼鳞蛋白质配制成底物浓度为3-6％的水溶液，溶解后将溶液迅速升温至80-85℃，恒温10-15min；
s8：酶解，经预处理后，加磷酸缓冲液调ph至7.0-8.5，加入复合蛋白酶，酶解温度为45-60℃，酶用量为底物浓度的6-9％，酶解60-120min；
s9：灭酶处理，将酶解液迅速升温至90℃，保持20min，进行灭酶处理；
s10：第二次离心，灭酶处理后，迅速冷却至室温，再以3000-4000r/min离心15-20min，取上清液；
s11：洗脱，按照100克：100-120ml的比例在湿大孔吸附树脂da201-c中加入胰蛋白酶解液，25℃在恒温摇床保持180-240min，转速为150-200r/min，用25％、50％、75％、100％的乙醇溶液依次洗脱120-150min；
s12：真空干燥浓缩，收集s11中制得的洗脱液，进行真空干燥浓缩。
进一步的，所述s1中鱼鳞与盐溶液之间的比例为1：40-60。
进一步的，所述s2中破碎机的功率为2000-3000w，转速为100～300r/min，过滤时采用多层超滤膜进行。
进一步的，所述s3中搅拌机的转速为30-60r/min。
进一步的，所述s6中冻干机的温度为-10-0℃，时间为100-180h。
本发明的有益效果为：本发明提出的一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，该方法的使用，能够有效在鱼鳞中提取抗氧化多肽，不仅提高鱼鳞加工的经济价值，而且，还使其鱼鳞得到有效利用，另一方面也降低了采用其它植物来提取抗氧化多肽的需求量。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明：
实施例1
一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，包括如下步骤：
s1：鱼鳞选取和处理，选取新鲜的鱼鳞，反复在水中清洗，除去鱼鳞附带的杂质，清洗完毕后将其浸泡在60℃的温水中60min，去除部分腥味，再用清水反复冲洗并沥干，之后将其浸泡在浓度为60％的盐溶液中，浸泡时间3h，去除剩余的腥味，再用清水反复冲洗并沥干，备用；
s2：破碎，将s1中备用的鱼鳞置于破碎机中进行破碎，破碎后清水过滤，过滤后沥干备用；
s3：搅拌，将s2中已破碎的鱼鳞置于搅拌机中，边搅拌边加水，温度控制在30℃，时间1天；
s4：第一次离心，将s3中已搅拌的鱼鳞置于高速离心机中，离心机的转数为5000r/min，离心30min，并收集上清液；
s5：盐析，将s4中的上清液加入nacl，使nacl浓度为4mol/l，搅拌12h后，静置12h，以转数5000r/min离心20min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1l缓冲溶液中含有nacl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入hcl调节ph值至7.2，且鱼鳞与缓冲溶液的质量体积比为1:20g/ml，向上述缓冲溶液加入nacl，使nacl的浓度为1.7mol/l，静置12h，以转数5000r/min，离心30min，得沉淀；
s6：干燥，将上述沉淀经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得鱼鳞蛋白质；
s7：预处理，将s6中制得的鱼鳞蛋白质配制成底物浓度为3％的水溶液，溶解后将溶液迅速升温至80℃，恒温10min；
s8：酶解，经预处理后，加磷酸缓冲液调ph至7.0，加入复合蛋白酶，酶解温度为45℃，酶用量为底物浓度的6％，酶解60min；
s9：灭酶处理，将酶解液迅速升温至90℃，保持20min，进行灭酶处理；
s10：第二次离心，灭酶处理后，迅速冷却至室温，再以3000r/min离心15min，取上清液；
s11：洗脱，按照100克：100ml的比例在湿大孔吸附树脂da201-c中加入胰蛋白酶解液，25℃在恒温摇床保持180min，转速为150r/min，用25％、50％、75％、100％的乙醇溶液依次洗脱120min；
s12：真空干燥浓缩，收集s11中制得的洗脱液，进行真空干燥浓缩。
所述s1中鱼鳞与盐溶液之间的比例为1：40。
所述s2中破碎机的功率为2000w，转速为100r/min，过滤时采用多层超滤膜进行。
所述s3中搅拌机的转速为30r/min。
所述s6中冻干机的温度为-10℃，时间为100h。
实施例2
一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，包括如下步骤：
s1：鱼鳞选取和处理，选取新鲜的鱼鳞，反复在水中清洗，除去鱼鳞附带的杂质，清洗完毕后将其浸泡在80℃的温水中100min，去除部分腥味，再用清水反复冲洗并沥干，之后将其浸泡在浓度为90％的盐溶液中，浸泡时间6h，去除剩余的腥味，再用清水反复冲洗并沥干，备用；
s2：破碎，将s1中备用的鱼鳞置于破碎机中进行破碎，破碎后清水过滤，过滤后沥干备用；
s3：搅拌，将s2中已破碎的鱼鳞置于搅拌机中，边搅拌边加水，温度控制在40℃，时间2天；
s4：第一次离心，将s3中已搅拌的鱼鳞置于高速离心机中，离心机的转数为12000r/min，离心60min，并收集上清液；
s5：盐析，将s4中的上清液加入nacl，使nacl浓度为5mol/l，搅拌24h后，静置24h，以转数10000r/min离心40min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1l缓冲溶液中含有nacl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入hcl调节ph值至7.6，且鱼鳞与缓冲溶液的质量体积比为1:50g/ml，向上述缓冲溶液加入nacl，使nacl的浓度为2.4mol/l，静置12h，以转数10000r/min，离心60min，得沉淀；
s6：干燥，将上述沉淀经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得鱼鳞蛋白质；
s7：预处理，将s6中制得的鱼鳞蛋白质配制成底物浓度为6％的水溶液，溶解后将溶液迅速升温至85℃，恒温15min；
s8：酶解，经预处理后，加磷酸缓冲液调ph至8.5，加入复合蛋白酶，酶解温度为60℃，酶用量为底物浓度的9％，酶解120min；
s9：灭酶处理，将酶解液迅速升温至90℃，保持20min，进行灭酶处理；
s10：第二次离心，灭酶处理后，迅速冷却至室温，再以4000r/min离心20min，取上清液；
s11：洗脱，按照100克：120ml的比例在湿大孔吸附树脂da201-c中加入胰蛋白酶解液，25℃在恒温摇床保持240min，转速为200r/min，用25％、50％、75％、100％的乙醇溶液依次洗脱150min；
s12：真空干燥浓缩，收集s11中制得的洗脱液，进行真空干燥浓缩。
所述s1中鱼鳞与盐溶液之间的比例为1：60。
所述s2中破碎机的功率为3000w，转速为300r/min，过滤时采用多层超滤膜进行。
所述s3中搅拌机的转速为60r/min。
所述s6中冻干机的温度为0℃，时间为180h。
实施例3
一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，包括如下步骤：
s1：鱼鳞选取和处理，选取新鲜的鱼鳞，反复在水中清洗，除去鱼鳞附带的杂质，清洗完毕后将其浸泡在70℃的温水中80min，去除部分腥味，再用清水反复冲洗并沥干，之后将其浸泡在浓度为75％的盐溶液中，浸泡时间4.5h，去除剩余的腥味，再用清水反复冲洗并沥干，备用；
s2：破碎，将s1中备用的鱼鳞置于破碎机中进行破碎，破碎后清水过滤，过滤后沥干备用；
s3：搅拌，将s2中已破碎的鱼鳞置于搅拌机中，边搅拌边加水，温度控制在35℃，时间1.5天；
s4：第一次离心，将s3中已搅拌的鱼鳞置于高速离心机中，离心机的转数为8500r/min，离心45min，并收集上清液；
s5：盐析，将s4中的上清液加入nacl，使nacl浓度为4.5mol/l，搅拌18h后，静置18h，以转数7500r/min离心30min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1l缓冲溶液中含有nacl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入hcl调节ph值至7.4，且鱼鳞与缓冲溶液的质量体积比为1:35g/ml，向上述缓冲溶液加入nacl，使nacl的浓度为2.0mol/l，静置12h，以转数7500r/min，离心45min，得沉淀；
s6：干燥，将上述沉淀经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得鱼鳞蛋白质；
s7：预处理，将s6中制得的鱼鳞蛋白质配制成底物浓度为4.5％的水溶液，溶解后将溶液迅速升温至82.5℃，恒温12.5min；
s8：酶解，经预处理后，加磷酸缓冲液调ph至7.75，加入复合蛋白酶，酶解温度为52.5℃，酶用量为底物浓度的7.5％，酶解90min；
s9：灭酶处理，将酶解液迅速升温至90℃，保持20min，进行灭酶处理；
s10：第二次离心，灭酶处理后，迅速冷却至室温，再以3500r/min离心17.5min，取上清液；
s11：洗脱，按照100克：110ml的比例在湿大孔吸附树脂da201-c中加入胰蛋白酶解液，25℃在恒温摇床保持210min，转速为175r/min，用25％、50％、75％、100％的乙醇溶液依次洗脱135min；
s12：真空干燥浓缩，收集s11中制得的洗脱液，进行真空干燥浓缩。
所述s1中鱼鳞与盐溶液之间的比例为1：50。
所述s2中破碎机的功率为2500w，转速为200r/min，过滤时采用多层超滤膜进行。
所述s3中搅拌机的转速为45r/min。
所述s6中冻干机的温度为-5℃，时间为140h。
上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
1.一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：
s1：鱼鳞选取和处理，选取新鲜的鱼鳞，反复在水中清洗，除去鱼鳞附带的杂质，清洗完毕后将其浸泡在60-80℃的温水中60-100min，去除部分腥味，再用清水反复冲洗并沥干，之后将其浸泡在浓度为60-90％的盐溶液中，浸泡时间3-6h，去除剩余的腥味，再用清水反复冲洗并沥干，备用；
s2：破碎，将s1中备用的鱼鳞置于破碎机中进行破碎，破碎后清水过滤，过滤后沥干备用；
s3：搅拌，将s2中已破碎的鱼鳞置于搅拌机中，边搅拌边加水，温度控制在30-40℃，时间1-2天；
s4：第一次离心，将s3中已搅拌的鱼鳞置于高速离心机中，离心机的转数为5000～12000r/min，离心30-60min，并收集上清液；
s5：盐析，将s4中的上清液加入nacl，使nacl浓度为4～5mol/l，搅拌12～24h后，静置12～24h，以转数5000～10000r/min离心20～40min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1l缓冲溶液中含有nacl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入hcl调节ph值至7.2～7.6，且鱼鳞与缓冲溶液的质量体积比为1:20～50g/ml，向上述缓冲溶液加入nacl，使nacl的浓度为1.7～2.4mol/l，静置12h，以转数5000～10000r/min，离心30～60min，得沉淀；
s6：干燥，将上述沉淀经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得鱼鳞蛋白质；
s7：预处理，将s6中制得的鱼鳞蛋白质配制成底物浓度为3-6％的水溶液，溶解后将溶液迅速升温至80-85℃，恒温10-15min；
s8：酶解，经预处理后，加磷酸缓冲液调ph至7.0-8.5，加入复合蛋白酶，酶解温度为45-60℃，酶用量为底物浓度的6-9％，酶解60-120min；
s9：灭酶处理，将酶解液迅速升温至90℃，保持20min，进行灭酶处理；
s10：第二次离心，灭酶处理后，迅速冷却至室温，再以3000-4000r/min离心15-20min，取上清液；
s11：洗脱，按照100克：100-120ml的比例在湿大孔吸附树脂da201-c中加入胰蛋白酶解液，25℃在恒温摇床保持180-240min，转速为150-200r/min，用25％、50％、75％、100％的乙醇溶液依次洗脱120-150min；
s12：真空干燥浓缩，收集s11中制得的洗脱液，进行真空干燥浓缩。
2.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述s1中鱼鳞与盐溶液之间的比例为1：40-60。
3.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述s2中破碎机的功率为2000-3000w，转速为100～300r/min，过滤时采用多层超滤膜进行。
4.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述s3中搅拌机的转速为30-60r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶从鱼鳞中提取抗氧化多肽的方法，其特征在于：所述s6中冻干机的温度为-10-0℃，时间为100-180h。
技术总结