本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高小核菌多糖产量的营养盐及其应用。
背景技术：
：微生物胞外多糖因具有独特的物化性质、流变学特征和生物安全性等优势而在化工、医药、食品、化妆品、生态保护等多个领域应用广泛。小核菌多糖，又称硬葡聚糖，是由小核菌属的一些丝状真菌合成分泌的微生物胞外多糖，其中以齐整小核菌发酵生产小核菌多糖最为典型。小核菌多糖在ph值、盐度和温度变化范围较大的环境中具有显著的流变性和稳定性，是一种中性非离子多聚糖，在石油、油漆、陶瓷、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。然而真菌发酵生产小核菌多糖的产量和产率不高，从而导致其价格一直居高不下，这严重影响了其在工业中的应用和发展。因此，如何提高小核菌多糖的产量是当前的研究热点。目前现有技术中提高小核菌多糖的手段主要有以下三个方面：高产菌株筛选诱变、发酵培养基的选择与发酵条件优化。例如，中国非专利文献“发酵法生产小核菌多糖”公开了一种高产菌株sclerotiumrolfsiino.1，在16升自控罐发酵试验中，多糖产量达14.14g/l；中国专利文献cn108441429a公开了一种小核菌sclerotiumrolfsiiwsh-g01，在葡萄糖碳源浓度为75g/l的条件下发酵56h达到硬葡聚糖产量20g/l的效果，前述两种方案的多糖产量仍有待提升。又如，中国非专利文献“齐整小核菌发酵产硬葡聚糖的补料控制策略”确定了控制搅拌转速400r/min，发酵40h时开始，恒速流加补料葡萄糖总浓度400g/l，流速6g/(l·h)，补料维持时间32h的补料策略，虽然这种方法对多糖产量有所提升，然而需要在发酵过程中持续补料32h，操作复杂，碳源需求量高。综上所述，提供一种能够提高小核菌多糖产量且操作简便、节约碳源用量的方案成为本领域亟待解决的技术问题。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中小核菌多糖产量低、发酵操作复杂、碳源需求量高的缺陷，从而提供一种提高小核菌多糖产量的营养盐及其应用。第一方面，本发明提供一种提高小核菌多糖产量的营养盐，包括：6-磷酸果糖二钠、丙酮酸、乙酸、乙醛和谷氨酸。进一步的，所述的提高小核菌多糖产量的营养盐，按重量份数计，包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.2份、丙酮酸0.01～0.1份、乙酸0.01～0.1份、乙醛0.01～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份。进一步的，所述的提高小核菌多糖产量的营养盐，按重量份数计，包括：6-磷酸果糖二钠0.06～0.15份、丙酮酸0.01～0.1份、乙酸0.05～0.1份、乙醛0.02～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份。进一步的，所述的提高小核菌多糖产量的营养盐，包括组分a和组分b，其中，按重量份数计，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.1份、丙酮酸0.01～0.1份和乙酸0.01～0.1份；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05～0.1份、乙醛0.01～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份。进一步的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.05份、丙酮酸0.01～0.1份和乙酸0.05～0.1份；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05～0.1份、乙醛0.02～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份。进一步的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01份、丙酮酸0.01份、乙酸0.05份；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05份、乙醛0.02份、谷氨酸0.01份。进一步的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.05份、丙酮酸0.1份和乙酸0.1份；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.1份、乙醛0.1份和谷氨酸0.1份。第二方面，本发明提供所述的提高小核菌多糖产量的营养盐在生产小核菌多糖中的应用。进一步的，所述生产小核菌多糖的方法包括：将齐整小核菌接种到发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程中向所述发酵培养基中加入所述营养盐。进一步的，所述营养盐包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.2g/l、丙酮酸0.01～0.1g/l、乙酸0.01～0.1g/l、乙醛0.01～0.1g/l和谷氨酸0.01～0.1g/l，进一步的，所述营养盐包括组分a和组分b，以所述发酵培养基的体积计，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.1g/l、丙酮酸0.01～0.1g/l和乙酸0.01～0.1g/l；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05～0.1g/l、乙醛0.01～0.1g/l和谷氨酸0.01～0.1g/l，进一步的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01g/l、丙酮酸0.01g/l、乙酸0.05g/l；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05g/l、乙醛0.02g/l、谷氨酸0.01g/l，进一步的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.05g/l、丙酮酸0.1g/l和乙酸0.1g/l；所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.1g/l、乙醛0.1g/l和谷氨酸0.1g/l。进一步的，在发酵0～12h时向所述发酵培养基中加入所述组分a；在发酵12～24h时向所述发酵培养基中加入所述组分b，进一步的，在发酵12h时向所述发酵培养基中加入所述组分a；在发酵24h时向所述发酵培养基中加入所述组分b。进一步的，在发酵开始至发酵48h之前控制所述发酵培养基ph值为4±0.2；在发酵48h至发酵结束控制所述发酵培养基ph值为3±0.2。进一步的，发酵温度28℃，摇床转速220rpm，发酵时间72h。进一步的，以发酵培养基的体积计，所述发酵培养基包括：蔗糖或葡萄糖75～100g/l、酵母提取物0.5～1.5g/l、硝酸钠2.25～3g/l、磷酸氢二钾1～2g/l、七水硫酸镁0.4～0.5g/l、氯化钾0.4～0.5g/l、硫酸亚铁0～0.05g/l和柠檬酸0.7～1.5g/l，进一步的，所述发酵培养基包括：蔗糖100g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠2.25g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸亚铁0.05g/l和柠檬酸0.7g/l；或者葡萄糖75g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠2.25g/l、磷酸氢二钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和柠檬酸1.5g/l；或者葡萄糖95g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠3g/l、磷酸氢二钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和柠檬酸1.5g/l。本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的提高小核菌多糖产量的营养盐包括6-磷酸果糖二钠、丙酮酸、乙酸、乙醛和谷氨酸，通过向发酵培养基中引入营养盐，使小核菌多糖产量得到了大幅提升。2.基于发酵全过程的阶段性特点，进一步将营养盐分为组分a和组分b，通过不同发酵阶段针对性地进行营养盐补充，更符合小核菌多糖的合成规律，有利于进一步提升小核菌多糖产量。3.本发明还提供了提高小核菌多糖产量的营养盐在生产小核菌多糖中的应用，在发酵不同时段添加营养盐并配合调控不同时段的ph值，有利于促进小核菌多糖的合成，产量可达34.1g/l，进而达到提高小核菌多糖产量、提高底物利用率和减少环境污染的目的。4.本发明提供了一种全新的提高小核菌多糖产量的方案，开辟了通过添加中间代谢产物提高小核菌多糖产量的新途径，相较于现有技术既能够达到较为理想的多糖产量，又克服了发酵操作复杂、碳源需求量高的缺陷，有利于推动小核菌多糖在工业上的应用与发展。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。实施例中所使用的的原料来源：实施例中所使用的齐整小核菌菌种为齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)atcc15205，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。实施例中所使用的pda液体培养基，采用如下方法制备得到：200g土豆，去皮，切块，加蒸馏水煮沸30min，过滤得滤液，加入20g葡萄糖，补水至1000ml。实施例所用其他原料及规格、来源如表1所示。表1原料规格及来源实施例1提高小核菌多糖的营养盐及其在生产小核菌多糖中的应用：将成熟的齐整小核菌菌液接种于pda液体培养基(100ml/250ml)中，接种量为5％，28℃，220rpm，培养72h，获得含大量菌丝的种子液；将获得的种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，其中，在发酵开始时向发酵培养基中加入营养盐的组分a，在发酵12h时向发酵培养基中加入营养盐的组分b，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。在本实施例中，发酵培养基的组成为：蔗糖100g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠(nano3)2.25g/l、磷酸氢二钾(k2hpo4)2g/l、七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l、氯化钾(kcl)0.5g/l、硫酸亚铁(feso4)0.05g/l、柠檬酸0.7g/l。在本实施例中，营养盐由组分a和组分b组成，组分a：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.01g、丙酮酸0.01g、乙酸0.05g；组分b：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.05g、乙醛0.02g、谷氨酸0.01g。对比例1-1将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例1的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，也不进行调节ph的操作。对比例1-2将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例1的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。实施例2提高小核菌多糖的营养盐及其在生产小核菌多糖中的应用：获得种子液的方法同实施例1；将获得的种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，其中，在发酵12h时向发酵培养基中加入营养盐的组分a，在发酵24h时向发酵培养基中加入营养盐的组分b，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。在本实施例中，发酵培养基的组成为：葡萄糖75g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠(nano3)2.25g/l、磷酸氢二钾(k2hpo4)1g/l、七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l、氯化钾(kcl)0.5g/l、柠檬酸1.5g/l。在本实施例中，营养盐由组分a和组分b组成，组分a：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.025g、丙酮酸0.05g、乙酸0.05g；组分b：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.05g、乙醛0.025g、谷氨酸0.05g。对比例2-1将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例2的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，也不进行调节ph的操作。对比例2-2将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例2的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。实施例3提高小核菌多糖的营养盐及其在生产小核菌多糖中的应用：获得种子液的方法同实施例1；将获得的种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，其中，在发酵12h时向发酵培养基中加入营养盐的组分a，在发酵24h时向发酵培养基中加入营养盐的组分b，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。在本实施例中，发酵培养基的组成为：葡萄糖95g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠(nano3)3g/l、磷酸氢二钾(k2hpo4)1g/l、七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g/l、氯化钾(kcl)0.5g/l、柠檬酸1.5g/l。在本实施例中，营养盐由组分a和组分b组成，组分a：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.05g、丙酮酸0.1g、乙酸0.1g；组分b：每1l发酵培养基中加入6-磷酸果糖二钠0.1g、乙醛0.1g、谷氨酸0.1g。对比例3-1将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例3的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，也不进行调节ph的操作。对比例3-2将实施例1获得的种子液按照5％的接种量接种于实施例3的发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，培养过程中不向发酵培养基中加入营养盐，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。实施例4提高小核菌多糖的营养盐及其在生产小核菌多糖中的应用：获得种子液的方法同实施例1；将获得的种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，其中，在发酵12h时向发酵培养基中加入营养盐的组分a，在发酵24h时向发酵培养基中加入营养盐的组分b，在发酵开始至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。在本实施例中，发酵培养基的组成和营养盐的组成同实施例3。实施例5提高小核菌多糖的营养盐及其在生产小核菌多糖中的应用：获得种子液的方法同实施例1；将获得的种子液按照5％的接种量接种于发酵培养基中，28℃，220rpm，培养72h，其中，在发酵12h时向发酵培养基中同时加入营养盐的组分a和组分b，在发酵开始至发酵48h之前控制发酵培养基ph值为4±0.2，在发酵48h时至发酵结束控制发酵培养基ph值为3±0.2。在本实施例中，发酵培养基的组成和营养盐的组成同实施例3。实验例对实施例和对比例中发酵72h时的发酵液进行取样，提取小核菌多糖并测定其含量。小核菌多糖的提取方法：发酵72h后将发酵液过滤，得到发酵滤液，加入四倍体积无水乙醇，4℃过夜醇沉，5000rmp离心20min，得其沉淀，将沉淀加水复溶，得到待测样品。小核菌多糖的含量测定方法：苯酚硫酸法，测定体系为1.00ml待测样品，加入1.0ml5％苯酚溶液，然后置冰浴中快速加入5.0ml浓硫酸，室温静置30min，490nm测吸光度，按照标准曲线计算小核菌多糖的浓度，其中，标准曲线：y＝9.0153x-0.0129r2＝0.9963y-吸光度x-小核菌多糖浓度根据测得的小核菌多糖浓度和待测样品体积计算小核菌多糖重量，并按照下述公式计算小核菌多糖产量：小核菌多糖产量＝(小核菌多糖重量/发酵液体积)×100％。最终获得各实施例和对比例的小核菌多糖产量如表2所示。表2小核菌多糖产量小核菌多糖产量(g/l)实施例132.2对比例1-121.7对比例1-229.4实施例225.4对比例2-118.7对比例2-222.3实施例334.1对比例3-121.5对比例3-229.6实施例423.4实施例531.2由表2可见，实施例1相较于发酵过程中不添加营养盐、不调节ph值的方案(对比例1-1)，产量提高48.4％，相较于发酵过程不添加营养盐，相应调节ph值的方案(对比例1-2)，产量提高9.5％；实施例2相较于发酵过程中不添加营养盐、不调节ph值的方案(对比例2-1)，产量提高35.8％，相较于发酵过程不添加营养盐，相应调节ph值的方案(对比例2-2)，产量提高13.9％；实施例3相较于发酵过程中不添加营养盐、不调节ph值的方案(对比例3-1)，产量提高58.6％，相较于发酵过程不添加营养盐，相应调节ph值的方案(对比例3-2)，产量提高15.2％；实施例3相较于不分阶段调控ph值的方案(实施例4)，产量提高45.7％；实施例3相较于同时加入组分a和组分b的方案(实施例5)，产量提高9.3％。由此证明，采用本发明提供的营养盐能给有效提高小核菌多糖的产量，配合ph值的分阶段调控，能进一步提高产量。此外，相较于营养盐的一次加入，组分a和组分b的分阶段加入对产量也具有一定提升。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页1 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技术特征：1.一种提高小核菌多糖产量的营养盐，其特征在于，包括：6-磷酸果糖二钠、丙酮酸、乙酸、乙醛和谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的提高小核菌多糖产量的营养盐，其特征在于，按重量份数计，包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.2份、丙酮酸0.01～0.1份、乙酸0.01～0.1份、乙醛0.01～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份。
3.根据权利要求2所述的提高小核菌多糖产量的营养盐，其特征在于，包括组分a和组分b，其中，按重量份数计，
所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.1份、丙酮酸0.01～0.1份和乙酸0.01～0.1份；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05～0.1份、乙醛0.01～0.1份和谷氨酸0.01～0.1份，
优选的，所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01份、丙酮酸0.01份、乙酸0.05份；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05份、乙醛0.02份、谷氨酸0.01份，或者
所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.05份、丙酮酸0.1份和乙酸0.1份；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.1份、乙醛0.1份和谷氨酸0.1份。
4.权利要求1～3任一项所述的提高小核菌多糖产量的营养盐在生产小核菌多糖中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生产小核菌多糖的方法包括：将齐整小核菌接种到发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程中向所述发酵培养基中加入所述营养盐。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以所述发酵培养基的体积计，所述营养盐包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.2g/l、丙酮酸0.01～0.1g/l、乙酸0.01～0.1g/l、乙醛0.01～0.1g/l和谷氨酸0.01～0.1g/l，
优选的，所述营养盐包括组分a和组分b，以所述发酵培养基的体积计，
所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01～0.1g/l、丙酮酸0.01～0.1g/l和乙酸0.01～0.1g/l；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05～0.1g/l、乙醛0.01～0.1g/l和谷氨酸0.01～0.1g/l，或者
所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.01g/l、丙酮酸0.01g/l、乙酸0.05g/l；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.05g/l、乙醛0.02g/l、谷氨酸0.01g/l，或者
所述组分a包括：6-磷酸果糖二钠0.05g/l、丙酮酸0.1g/l和乙酸0.1g/l；
所述组分b包括：6-磷酸果糖二钠0.1g/l、乙醛0.1g/l和谷氨酸0.1g/l。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，
在发酵0～12h时向所述发酵培养基中加入所述组分a；
在发酵12～24h时向所述发酵培养基中加入所述组分b，
优选的，在发酵12h时向所述发酵培养基中加入所述组分a；
在发酵24h时向所述发酵培养基中加入所述组分b。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
在发酵开始至发酵48h之前控制所述发酵培养基ph值为4±0.2；
在发酵48h至发酵结束控制所述发酵培养基ph值为3±0.2。
9.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，发酵温度28℃，摇床转速220rpm，发酵时间72h。
10.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，以发酵培养基的体积计，所述发酵培养基包括：蔗糖或葡萄糖75～100g/l、酵母提取物0.5～1.5g/l、硝酸钠2.25～3g/l、磷酸氢二钾1～2g/l、七水硫酸镁0.4～0.5g/l、氯化钾0.4～0.5g/l、硫酸亚铁0～0.05g/l和柠檬酸0.7～1.5g/l，
优选的，所述发酵培养基包括：
蔗糖100g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠2.25g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸亚铁0.05g/l和柠檬酸0.7g/l；或者
葡萄糖75g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠2.25g/l、磷酸氢二钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和柠檬酸1.5g/l；或者
葡萄糖95g/l、酵母提取物1g/l、硝酸钠3g/l、磷酸氢二钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和柠檬酸1.5g/l。
技术总结本发明提供一种提高小核菌多糖产量的营养盐及其应用，属于微生物发酵领域。该提高小核菌多糖产量的营养盐，包括：6‑磷酸果糖二钠、丙酮酸、乙酸、乙醛和谷氨酸。本发明还提供了该营养盐在生产小核菌多糖中的应用。在发酵不同时段添加营养盐并配合调控不同时段的pH值，有利于促进小核菌多糖的合成，进而达到提高小核菌多糖产量、提高底物利用率和减少环境污染的目的。本发明开辟了通过添加中间代谢产物提高小核菌多糖产量的新途径，相较于现有技术既能够达到较为理想的多糖产量，又克服了发酵操作复杂、碳源需求量高的缺陷，有利于推动小核菌多糖在工业上的应用与发展。
技术研发人员：宋佳;王敏;范冰倩;郑宇;屠琳娜;夏梦雷
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2021.04.14
技术公布日：2021.08.03
