本发明涉及蛋白质纯化领域，尤其是一种牛ⅰ型胶原蛋白的纯化方法。
背景技术：
：胶原是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，占总蛋白质量的25％-33％，广泛存在于动物的皮肤、肌腱和骨骼中，其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域。到目前为止，已经发现胶原类型29种，研究较多的是ⅰ-ⅴ型胶原，其中ⅰ型胶原是骨、皮肤、肌腱以及其它纤维结缔组织的优势蛋白，占生物体胶原总量的90％。ⅰ型胶原是纤维形成胶原，能活化上皮细胞，促进生皮细胞增生，也可促进胶原酶生成，使皮肤有张力和弹力，在医药领域用于修复皮肤创伤和骨结构损伤。ⅰ型胶原分子的n端和c端具有称为端肽的非螺旋结构域，该端肽决定胶原的抗原性，降低了生物相容性。现有技术中，蛋白提取纯化前期通常会进行粗提取，再通过沉淀、离心等纯化胶原蛋白，但该方法很难获得高纯度的ⅰ型胶原。专利cn1304416a公开了一种液体介质中天然胶原蛋白的制备方法，在具有双层横向切刀的混合物中搅拌，剪切胶原蛋白提取物，而后对其进行灭菌，获得无菌的胶原蛋白。但是，冗杂的机械剪切虽然减小了胶原蛋白的尺寸，但同时会导致胶原蛋白螺旋结构不完整；专利cn106946988a公开了一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法分离纯化i型胶原蛋白；刘丽莉等(牛骨ⅰ型胶原蛋白提取及结构表征，食品科学，2010，31(02):87-91)采用乙醚低温回流脱脂，0.48％盐酸脱钙，骨粒径为5mm×10mm，以1％柠檬酸和1％胃蛋白酶复合为提取介质提取牛ⅰ型胶原蛋白；刘雯恩等(优化ⅰ型胶原蛋白的纯化工艺，精细化工，2019，36(05):850-855 874)采用0.5mol/l乙酸和胃蛋白酶提取ⅰ型胶原蛋白后,结合等电点沉淀法和超滤纯化技术对ⅰ型胶原蛋白进行纯化。但均存在提取量小或纯化程度较低的问题。因此，仍需一种提取效率高、纯度高的牛i型胶原蛋白纯化方法。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种牛ⅰ型胶原蛋白的纯化方法，本发明的牛ⅰ型胶原蛋白纯度高、无免疫原性且为无菌的活性形式。本发明的一种牛ⅰ型胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：(1)将粗提取的牛ⅰ型胶原蛋白溶解，与非胶原蛋白酶的蛋白水解酶混合搅拌，监测粘度变化，酶解完成后离心，取上清液，其中，反应液粘度达到0.01-1pa·s表示酶解完成；(2)将步骤(1)的上清液ph调节至3.5-5，依次滴加终浓度为15-25％v/v、30-45％v/v、50-70％v/v和75-95％v/v的醇溶液，依次析出4个胶原蛋白沉淀，sds-page分析去端肽程度，合并后得到去端肽牛ⅰ型胶原蛋白沉淀；(3)将步骤(2)的去端肽牛ⅰ型胶原蛋白沉淀在ph2-4的酸溶液中复溶，调节至等电点，离心取沉淀，再次在ph2-4的酸溶液中复溶，在ph3-5的酸溶液中透析，过滤除菌，取滤液，得到纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白，其中，透析袋的截留分子量为8-100kda。进一步地，在步骤(1)中，非胶原蛋白酶的蛋白水解酶与牛ⅰ型胶原蛋白的质量比为0.1-10:1。进一步地，在步骤(1)中，非胶原蛋白酶的蛋白水解酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。非胶原蛋白酶的蛋白水解酶选择性地切除牛ⅰ型胶原蛋白分子的氨基和羧基末端的球状区域，从而去除胶原蛋白的抗原性，并保持胶原蛋白天然的空间螺旋区段结构和生物活性。进一步地，步骤(1)中，牛ⅰ型胶原蛋白的粗处理方法为酸提取法，用盐酸、亚硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、柠檬酸或甲酸加入到牛骨粉中，于0-25℃搅拌，得到粗提取的牛ⅰ型胶原蛋白。进一步地，在步骤(1)中，用ph1-3.5的溶液溶解粗提取的牛ⅰ型胶原蛋白。目的是为酶提供适宜的ph，提高酶活性。进一步地，在步骤(1)中，在10-37℃下溶解牛ⅰ型胶原蛋白，在此温度下，酶活性较高、溶解度高且不会变性。进一步地，在步骤(1)中，使用流变仪测试反应液的粘度从而监测酶解程度，所需样品量少(～1ml)，当粘度不再变化时，表明去端肽基本完全。进一步地，在步骤(1)中，酶解12-24h。进一步地，在步骤(2)中，每个胶原蛋白级分析出后进行离心处理，沉淀为去端肽牛ⅰ型胶原蛋白，收集上清液旋蒸浓缩并进行下一个级分的醇沉处理。进一步地，在步骤(2)中，通过sds-page分析胶原蛋白级分的去端肽程度，并检测酶是否基本去除。具体地，将每个胶原蛋白级分沉淀取少量复溶于弱酸，进行sds-page分析。优选地，在步骤(2)中，依次滴加终浓度为20-25％v/v、40-45％v/v、60-65％v/v和80-85％v/v的醇溶液。进一步地，在步骤(2)中，醇溶液选自甲醇、乙醇、丙酮和异丙醇中的一种或多种。进一步地，在步骤(2)中，醇溶液的滴加速度为50-100ml/h。逐滴滴加可以更好的分离胶原蛋白、酶和端肽，避免胶原蛋白析出时裹挟酶和端肽。进一步地，在步骤(2)中，在1-10℃下滴加醇溶液。上清液的ph调节至3.5-5，在保证胶原蛋白不变性的同时，将ph调高会降低牛ⅰ型胶原蛋白的溶解度；当温度降至10℃以下，牛ⅰ型胶原蛋白的溶解度也明显降低。温度、ph和醇配合作用，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白，从而减少醇的用量。进一步地，在ph为2-4的酸溶液中复溶后调节至蛋白质的等电点，等电点的ph为5-7，调节等电点并离心取沉淀可进一步去除酶解反应加入的大量非胶原蛋白酶，获得高纯度去端肽牛ⅰ型胶原蛋白；再次复溶后，在ph为3-5的酸溶液中透析，调高ph的目的是降低牛ⅰ型胶原蛋白的溶解度。进一步地，透析袋内外溶液体积比为0.01-0.5:1，为透析提供浓度差。本方法纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白分子量为300kda，胃蛋白酶是3kda左右，端肽在3kda以下，采用截留分子量为8-100kda的透析袋，胃蛋白酶、端肽以及调节ph的酸均能透过半透膜，而牛ⅰ型胶原蛋白分子无法通过，达到分离纯化牛ⅰ型胶原蛋白的目的。进一步地，在步骤(3)中，透析后的胶原蛋白溶液用0.45-0.22μm的滤膜过滤，优选为0.22μm的滤膜，进行绝对过滤而除菌。进一步地，在步骤(3)中，在20-37℃下过滤，优选为30℃。利用胶原蛋白三螺旋在适度加热条件下发生可逆的部分解螺旋行为，使用过滤膜过滤加热的去端肽胶原蛋白溶液，可明显提高过滤效率。进一步的，还包括对过滤后的滤液进行冻干的步骤，以获得高纯度的去端肽无菌化牛ⅰ型胶原蛋白干品。本发明要求保护上述纯化方法纯化后的牛i型胶原蛋白。本发明还要求保护上述牛i型胶原蛋白在制备食品、化妆品或生物医学材料中的应用。借由上述方案，本发明至少具有以下优点：(1)本发明通过纯化方法的合理、科学组合，从未去端肽的胶原蛋白出发制备高质量无菌胶原蛋白。通过调节ph和温度，提高了牛ⅰ型胶原蛋白提取效率和产物纯度，同时提高了牛ⅰ型胶原蛋白提取效率和产物纯度，同时减少了醇的用量，成本降低。(2)本发明首次通过粘度法监测去端肽进程。未脱端肽的胶原蛋白两端有非三螺旋结构，容易打结，粘度高，去端肽后仅有三螺旋结构的胶原蛋白尺寸更短，有一定刚度，粘度适度下降，因此胶原溶液粘度变化能有效反映酶解程度，且更易无菌化。胶原蛋白端肽水解完全时，反应液粘度不再发生变化，保证去端肽完全。同时，该方法检测方便，样品使用量少，灵敏度高。(3)本发明的纯化方法突破了传统纯化方法的限制，应用范围广，适用于不同种类的i型胶原蛋白的纯化。(4)本发明纯化过程中，去除端肽达到了消除胶原蛋白免疫原性、提高生物相容性的效果，纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白仍具有蛋白活性。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中图1为实施例1纯化的牛ⅰ型胶原蛋白；图2为实施例1中粘度变化测试图；图3为实施例2中产物、原料、中间产物的sds-page蛋白电泳图；图4为对比例中采用传统酶法纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白；图5为实施例1中等电点检测结果；图6为实施例1纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白的红外光谱图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例1(1)取经盐酸粗处理后的牛ⅰ型胶原蛋白300mg，按浓度25mg/ml在ph为2.5的乙酸溶液中25℃搅拌溶解8h，然后向胶原蛋白溶液中加入60mg胃蛋白酶(胃蛋白酶与牛ⅰ型胶原蛋白的质量比为0.2:1)，继续搅拌12h。取1ml样品通过流变测定溶液粘度(结果如图2)，粘度稳定后表明酶解反应结束，然后将反应液稀释五倍，9000rpm/min离心15min，取上清；(2)将60ml上清液的ph调至4，滴加(滴加速度为60ml/h)6.7ml99％(v/v)异丙醇水溶液(醇的终浓度为20％(v/v))，调节温度为4℃，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分1，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分1。浓缩上清液至50ml，滴加14ml异丙醇水溶液(醇的终浓度为40％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分2，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分2。浓缩上清液至25ml，滴加16ml异丙醇(醇的终浓度为60％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分3，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分3。浓缩上清液至25ml，滴加35ml异丙醇(醇的终浓度为80％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分4，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分4；(3)将去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀在ph为4的乙酸溶液中复溶，调节至等电点(ph＝6.25，结果见图5)，10000rpm/min离心15min得到胶原蛋白沉淀，在ph为3的乙酸溶液中复溶，之后在ph为3的乙酸溶液中透析三天，透析袋的截留分子量为100kda，透析袋内外溶液体积比为0.1:1，4h/次换液；(4)将透析后的胶原蛋白溶液浓度调整为0.06mg/ml，加热至30℃，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行冻干，得到240mg去端肽无菌化胶原蛋白干品。表1为在实施例1的基础上，改变ph和/或温度得到的纯化结果。由表1可见，调节ph和温度后，可以降低醇用量和提高产物纯度。表1不同纯化条件及产物纯度上清液ph344醇析温度25℃25℃4℃醇用量85ml80ml72ml产率60％-70％70-75％80％-85％实施例2(1)取经醋酸粗处理后的牛ⅰ型胶原蛋白300mg，按浓度25mg/ml在ph为3的乙酸溶液中15℃搅拌溶解8h，然后向胶原蛋白溶液中加入1500mg胰蛋白酶(胰蛋白酶与牛ⅰ型胶原蛋白的质量比为5:1)，继续搅拌20h。通过流变测定溶液粘度，粘度稳定后表明酶解反应结束，然后将反应液稀释五倍，9000rpm/min离心15min，取上清；(2)将60ml上清液的ph调至4，滴加(滴加速度为100ml/h)6.7ml100％(v/v)乙醇水溶液(醇的终浓度为25％(v/v))，调节温度为8℃，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分1，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分1。浓缩上清液至50ml，滴加14ml乙醇水溶液(醇的终浓度为45％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分2，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分2。浓缩上清液至25ml，滴加16ml乙醇(醇的终浓度为70％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分3，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分3。浓缩上清液至25ml，滴加35ml乙醇(醇的终浓度为90％(v/v))，析出去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分4，10000rpm/min，离心15min得到去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀级分4。利用sds-page分析上述胶原蛋白级分4的脱端肽程度，收集去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白级分，结果见图3。(3)将去端肽的牛ⅰ型胶原蛋白沉淀在ph为4的乙酸溶液中复溶，调节至等电点(ph＝6.25)，10000rpm/min离心15min得到胶原蛋白沉淀，在ph为3的乙酸溶液中复溶，之后在ph为3的乙酸溶液中透析三天，透析袋的截留分子量为50kda，透析袋内外溶液体积比为0.5:1，4h/次换液；(4)将透析后的胶原蛋白溶液浓度调整为0.06mg/ml，加热至30℃，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行冻干，得到235mg去端肽无菌化胶原蛋白干品。对比例(1)将适量的猪皮等组织长时间浸泡在0.1mol/l乙酸中；(2)将组织残渣与溶液分离，溶液中含有从组织中溶出的胶原蛋白；(3)将溶液进行冷冻、干燥等到胶原蛋白干品。图1为本发明实施例1纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白，图4为对比例纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白。由图1可见，本发明牛ⅰ型胶原蛋白的性状并未改变，呈纯白棉状，仍保持胶原蛋白活性。而传统的酶法提取纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白性状偏微黄，甚至有颗粒感，说明纯度不够。图2为本发明实施例1中酶解时对不同时刻样品进行粘度测试的结果。由图2可见，酶解进行0h、6h、12h、24h时的样品粘度，12h前样品粘度呈现下降趋势，而12h后粘度不再下降，说明酶解完全。图3为本发明实施例2中酶解进行时以及纯化后产物的sds-page蛋白电泳图。由图3可见，样品进行酶解后，出现了α2和酶之间的条带，说明端肽的切除是可行的；最终的纯化产物端肽和酶纯化完全，几乎仅存α1、α2、β、γ条带，说明纯化后的产物主要留存去端肽的胶原蛋白，纯度更高。图5为实施例1中胶原蛋白等电点的检测结果。由图5可见，实施例1中的胶原蛋白等电点为ph＝6.25。图6为实施例1中胶原蛋白的红外光谱，由图6可见，实施例1中的胶原蛋白经去端肽以及纯化处理过程，仍可以保持胶原蛋白的特征结构。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页1 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技术特征：1.一种牛ⅰ型胶原蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将粗提取的牛ⅰ型胶原蛋白溶解，与非胶原蛋白酶的蛋白水解酶混合搅拌，监测粘度变化，酶解完成后离心，取上清液，其中，反应液粘度达到0.01-1pa·s表示酶解完成；
(2)将步骤(1)的上清液ph调节至3.5-5，依次滴加终浓度为15-25％v/v、30-45％v/v、50-70％v/v和75-95％v/v的醇溶液，依次析出4个胶原蛋白沉淀，合并后得到去端肽牛ⅰ型胶原蛋白沉淀；
(3)将步骤(2)的去端肽牛ⅰ型胶原蛋白沉淀在ph2-4的酸溶液中复溶，调节至等电点，离心取沉淀，再次在ph2-4的酸溶液中复溶，在ph3-5的酸溶液中透析，过滤除菌，取滤液，得到纯化后的牛ⅰ型胶原蛋白，其中，透析袋的截留分子量为8-100kda。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述非胶原蛋白酶的蛋白水解酶与牛ⅰ型胶原蛋白的质量比为0.1-10:1。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述非胶原蛋白酶的蛋白水解酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，依次滴加终浓度为20-25％v/v、40-45％v/v、60-65％v/v和80-85％v/v的醇溶液。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，每个胶原蛋白级分析出后进行离心，得到所述去端肽牛ⅰ型胶原蛋白沉淀，收集上清液旋蒸浓缩并进行下一个级分的醇沉处理。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述醇溶液选自甲醇、乙醇、丙酮和异丙醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，醇溶液的滴加速度为50-100ml/h。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，在1-10℃下滴加醇溶液。
9.一种权利要求1-8任一项所述的纯化方法纯化后的牛i型胶原蛋白。
10.一种权利要求9所述的牛i型胶原蛋白在制备食品、化妆品或生物医学材料中的应用。
技术总结本发明涉及一种牛Ⅰ型胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：将经粗提取处理的牛Ⅰ型胶原蛋白溶解于酸溶液中，使用非胶原蛋白酶的蛋白水解酶进行降解，监测粘度控制酶解程度；将上清液pH调节至3.5‑5，依次滴加终浓度为15‑25％v/v、30‑45％v/v、50‑70％v/v和75‑95％v/v的醇溶液，析出4个去端肽牛Ⅰ型胶原蛋白，离心，酸溶液中复溶，调节至等电点，离心取沉淀，再次在酸溶液中复溶，并在pH为3‑5的酸溶液中透析，过滤除菌，取滤液冻干，得到纯化后的牛Ⅰ型胶原蛋白。本发明提供的牛Ⅰ型胶原蛋白纯度高、无免疫原性且为无菌的活性形式，可应用于医用及组织工程材料领域。
技术研发人员：陈敬华;许淑琴;毛宝亮
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2021.06.21
技术公布日：2021.08.03
