本发明涉及细胞库构建技术领域，具体是一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。
背景技术：
肾脏为通过将由生物体内的代谢活动产生的有害物质等废物从血液中过滤而除去以谋求维持身体的健康而起作用的重要的器官之一。目前，急慢性肾脏疾病导致的肾功能衰竭严重威胁人类健康，困扰着全国近1.5亿肾病患者。传统的药物治疗和透析治疗难以逆转肾脏结构的损伤和肾功能的持续下降。在此情况下，除了异体肾移植手术外，基于成体组织干细胞(前体细胞)移植的再生医学新技术有望为临床上治疗这类疾病带来新的思路。所以，本申请欲构建一种多能干细胞库以用于急慢性肾脏疾病的治疗，具有重大的科学和临床意义。
技术实现要素：
本发明就是为了解决现有技术中存在的问题，所提出了一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。
本发明的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，是采用了如下的技术方案。
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
s1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；
s2.对步骤s1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的sox9阳性肾前体细胞；
s3.对步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；
s4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤s3扩增培养后的肾前体细胞中；
s5.将步骤s4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。
通过采用上述技术方案，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到sox9 肾前体细胞，再将其重新编程为多能性干细胞，最终得到修复型多能肾前体干细胞库，整个细胞库的构建过程简单，构建得到的多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。
具体的，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到sox9 肾前体细胞，sox9是一种转录因子，在急性肾损伤早期sox9表达升高，在急性肾损伤28d后，sox9依旧处于较高的表达水平，并且约有40％的sox9 细胞在肾损伤后增殖并扩增。所以，sox9 细胞具有很强的增殖和分化能力，可促进受损肾小管上皮细胞的修复，从而实现肾小管结构的重建、肾脏损伤的修复。
本申请再将筛选得到的sox9 肾前体细胞诱导出干性，得到自我更新、增殖和分化能力进一步增强的sox9 肾前体干细胞，肾前体干细胞在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、增殖能力、分化能力、拟胚胎和畸形瘤形成方面都与胚胎干细胞相似。而且，肾前体细胞经体外诱导成肾前体干细胞，再移植到病人体内，其免疫原性不会改变，相当于自体移植，从而避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题。
另外，本申请将尿液作为肾前体细胞的来源，具有样本方便采集、易于大量获得、无创性等特点。
综上所述，本申请构建的修复型多能肾前体干细胞库具有很强的自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，将其应用于急慢性肾脏疾病的治疗，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用，且有效解决了供体细胞来源问题，为肾内细胞移植技术提供一条新的途径。
可选的，步骤s1中，收集尿液并在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用pbs溶液洗涤细胞，然后再次在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用pbs溶液重悬细胞，重悬细胞的pbs溶液加入量与细胞的体积比为(500-1000):1。
通过采用上述技术方案，本申请对尿液进行简单离心、洗涤、重悬等操作得到含有肾前体细胞的细胞群，操作方法简单，最大程度的将尿液中的细胞进行收集，为后续的实验操作奠定基础。
可选的，步骤s2中，采用标记了cd106抗体、cd140a抗体和cd140b抗体以及sox9抗体的磁珠对细胞进行正筛选，同时采用标记了cd9抗体的磁珠对细胞进行负筛选。
通过采用上述技术方案，本申请采用肾前体细胞表面标志物对尿液中的细胞群进行筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的纯度较高的肾前体细胞，同时本申请还采用sox9抗体对细胞群进行筛选，最终筛选得到sox9阳性的肾前体细胞，其存在自我更新和分化潜能，能够用于急慢性肾脏疾病的治疗。
可选的，步骤s3中，将步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％co2的条件下培养72-96h。
通过采用上述技术方案，本申请将筛选得到的肾前体细胞在诱导其干性之前进行常规培养，为后续将其诱导成多能干细胞奠定了基础，提高了细胞库构建的成功率。
可选的，所述培养基为含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素的dmem/f-12培养基。
通过采用上述技术方案，本申请在dmem/f-12培养基中加入胎牛血清以及抗生素，一方面，提供了细胞增殖所需的营养物质和生长因子，另一方面防止了杂菌的生长，防止发生污染而影响最终的实验结果。
可选的，步骤s4中，所述表达多能干细胞诱导因子的质粒为含有oct4和sox2基因的pep4质粒以及含有mir302-367基因的pcep4质粒。
通过采用上述技术方案，本申请将只含2种多能干细胞诱导因子基因的质粒与含有mir302-367基因的质粒共同转入肾前体细胞中，在成功的获得诱导干细胞的同时，提高了编程的效率，还极大地降低了致瘤性。
可选的，步骤s4中，采用电转染的方式将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤s3扩增培养后的肾前体细胞中；所述电转染的电压为200-300v，电击时间为200-300μs。
通过采用上述技术方案，本申请采用电穿孔法将质粒转入肾前体细胞中，电穿孔法转染的效率较高，且易于控制，可有效促进肾前体细胞向肾前体干细胞的转变。
可选的，步骤s4中，在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，采用dpbs溶液洗涤步骤s3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的edta溶液对肾前体细胞进行消化，消化1-2min，再采用10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；再在300-400g条件下离心3-4min，用dpbs溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2-5×106个/ml。
通过采用上述技术方案，本申请在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，还对肾前体细胞进行预处理操作，提高了质粒转入肾前体细胞的效率，从而提高了肾前体细胞重编程的成功率。
可选的，步骤s5中，所述诱导培养基为含有5-azadc、kenpaullone、sb-431542、pd0325901和chir99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-azadc的终浓度为1.5-2μmol/l，kenpaullone的终浓度为2.5-3μmol/l，sb-431542的终浓度为0.5-0.6μmol/l、pd0325901的终浓度为0.8-1μmol/l，chir99021的终浓度为1.5-2μmol/l。
通过采用上述技术方案，本申请向诱导培养基中加入五种小分子化合物，这五种小分子化合物可以通过不同途径提高重编程效率，可以单独或以不同组合发挥作用，同时还可以替代相关转录因子进行重编程及维持干细胞的多能性和自我更新，降低了由转录因子导致的致瘤性，提高了诱导多能干细胞的安全性。
可选的，步骤s5中，将转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8-12d；然后在300-400g条件下离心3-4min，采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15-18天，期间每天更换一次培养基。
通过采用上述技术方案，本申请将质粒转入后的细胞在诱导培养基中培养一段时间，再在普通培养基中培养一段时间，诱导培养基可以保证重编程的过程的顺利且完全地进行，普通培养基用于诱导多能干细胞的增殖培养，最终可得到具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能特性的修复型多能肾前体干细胞库，可用于急慢性肾脏疾病的治疗，促进干细胞在医学临床治疗方面的进一步发展。
本发明获得了如下有益效果。
1、本申请的修复型多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用；
2、本申请将筛选得到sox9 肾前体细胞经体外诱导成肾前体干细胞，再移植到病人体内，其免疫原性不会改变，从而避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题；
3、本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到sox9 肾前体细胞，再将其重编程为多能性干细胞，最终得到修复型多能肾前体干细胞库，整个细胞库的构建过程简单，重编程效率较高，致瘤性较低，诱导多能干细胞的安全性较高；
4、本申请将尿液作为肾前体细胞的来源，具有样本方便采集、易于大量获得、无创性等特点。
附图说明
图1是本申请制备得到的肾前体干细胞标志物表达情况图。
具体实施方式
以下参照附图和实施例对本发明进行进一步的技术说明。
本申请的kenpaullone、sb-431542购自上海芮晖化工科技有限公司；
本申请的5-azadc、pd0325901购自sigma-aldrich公司；
本申请的chir99021购自abcam中国公司；
本申请的人胚胎干细胞培养基为人胚胎干细胞培养基mtesr1，购自杭州百通生物技术有限公司；
本申请的cd9抗体、cd106抗体、cd140a抗体、cd140b抗体和sox9抗体购自abcam中国公司。
实施例1
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
s1.收集尿液并在2℃、400g条件下离心10min，去除上清后采用pbs溶液洗涤细胞，然后再次在2℃、400g条件下离心10min，去除上清后采用pbs溶液重悬细胞，重悬细胞的pbs溶液加入量与细胞的体积比为500:1；
s2.采用标记了cd106抗体、cd140a抗体和cd140b抗体以及sox9抗体的磁珠对步骤s1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了cd9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的sox9阳性肾前体细胞；
s3.将步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％co2的条件下培养72h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素的dmem/f-12培养基；
s4.采用dpbs溶液洗涤步骤s3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的edta溶液对肾前体细胞进行消化，消化1min，再采用10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；再在300g条件下离心4min，用dpbs溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2×106个/ml；
将含有oct4和sox2基因的pep4质粒以及含有mir302-367基因的pcep4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为200v，电击时间为300μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
s5.将步骤s4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养12d，然后在300g条件下离心4min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-azadc、kenpaullone、sb-431542、pd0325901和chir99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-azadc的终浓度为1.5μmol/l，kenpaullone的终浓度为3μmol/l，sb-431542的终浓度为0.5μmol/l、pd0325901的终浓度为1μmol/l，chir99021的终浓度为1.5μmol/l。
实施例2
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
s1.收集尿液并在4℃、500g条件下离心8min，去除上清后采用pbs溶液洗涤细胞，然后再次在4℃、500g条件下离心8min，去除上清后采用pbs溶液重悬细胞，重悬细胞的pbs溶液加入量与细胞的体积比为1000:1；
s2.采用标记了cd106抗体、cd140a抗体和cd140b抗体以及sox9抗体的磁珠对步骤s1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了cd9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的sox9阳性肾前体细胞；
s3.将步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％co2的条件下培养96h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素的dmem/f-12培养基；
s4.采用dpbs溶液洗涤步骤s3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的edta溶液对肾前体细胞进行消化，消化2min，再采用10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；再在400g条件下离心3min，用dpbs溶液重悬细胞，使细胞密度控制在5×106个/ml；
将含有oct4和sox2基因的pep4质粒以及含有mir302-367基因的pcep4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为300v，电击时间为200μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
s5.将步骤s4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8d，然后在400g条件下离心3min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养18天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-azadc、kenpaullone、sb-431542、pd0325901和chir99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-azadc的终浓度为2μmol/l，kenpaullone的终浓度为2.5μmol/l，sb-431542的终浓度为0.6μmol/l、pd0325901的终浓度为0.8μmol/l，chir99021的终浓度为2μmol/l。
实施例3
一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：
s1.收集尿液并在8℃、400g条件下离心8min，去除上清后采用pbs溶液洗涤细胞，然后再次在8℃、400g条件下离心8min，去除上清后采用pbs溶液重悬细胞，重悬细胞的pbs溶液加入量与细胞的体积比为500:1；
s2.采用标记了cd106抗体、cd140a抗体和cd140b抗体以及sox9抗体的磁珠对步骤s1得到的悬浮细胞进行正筛选，同时采用标记了cd9抗体的磁珠对细胞进行负筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的sox9阳性肾前体细胞；
s3.将步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％co2的条件下培养72h；
所述培养基为含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素的dmem/f-12培养基；
s4.采用dpbs溶液洗涤步骤s3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的edta溶液对肾前体细胞进行消化，消化1min，再采用10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；再在300g条件下离心3min，用dpbs溶液重悬细胞，使细胞密度控制在4×106个/ml；
将含有oct4和sox2基因的pep4质粒以及含有mir302-367基因的pcep4质粒与上述预处理后的肾前体细胞混合，在电压为200v，电击时间为250μs的条件下进行电转染，将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入肾前体细胞中；
s5.将步骤s4转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养10d，然后在300g条件下离心3min，再采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养16天，期间每天更换一次培养基，得到修复型多能肾前体干细胞库。
所述诱导培养基为含有5-azadc、kenpaullone、sb-431542、pd0325901和chir99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-azadc的终浓度为1.8μmol/l，kenpaullone的终浓度为2.5μmol/l，sb-431542的终浓度为0.5μmol/l、pd0325901的终浓度为1μmol/l，chir99021的终浓度为1.8μmol/l。
性能检测
检测多能肾前体干细胞中干细胞标志物的表达
收集实施例3中的sox9阳性肾前体细胞和培养10代以上的肾前体干细胞，使用rna提取试剂盒提取rna并反转录成dna，然后利用进行实时荧光pcr检测oct4、sox2、c-myc、klf4四种干细胞标志物基因。
实验结果见图1，从图1可以看出，以上四种干细胞标志物在sox9阳性肾前体细胞中不表达或少量表达，而在多能肾前体干细胞中表达上调。以上结果表明，本申请的肾前体细胞成功的被重编程为多能肾前体干细胞，具有诱导多能干细胞典型的多能性标志物，具有多能性。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
1.一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
s1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；
s2.对步骤s1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有cd9(-)、cd106( )、cd140a( )和cd140b( )细胞表面标志的sox9阳性肾前体细胞；
s3.对步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；
s4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤s3扩增培养后的肾前体细胞中；
s5.将步骤s4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。
2.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s1中，收集尿液并在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用pbs溶液洗涤细胞，然后再次在2-8℃、400-500g条件下离心8-10min，去除上清后采用pbs溶液重悬细胞，重悬细胞的pbs溶液加入量与细胞的体积比为(500-1000):1。
3.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s2中，采用标记了cd106抗体、cd140a抗体和cd140b抗体以及sox9抗体的磁珠对细胞进行正筛选，同时采用标记了cd9抗体的磁珠对细胞进行负筛选。
4.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s3中，将步骤s2筛选得到的肾前体细胞进行离心，采用培养基洗涤沉淀，再次离心后采用培养基重悬细胞，并在37℃5％co2的条件下培养72-96h。
5.根据权利要求4所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：所述培养基为含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素的dmem/f-12培养基。
6.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s4中，所述表达多能干细胞诱导因子的质粒为含有oct4和sox2基因的pep4质粒以及含有mir302-367基因的pcep4质粒。
7.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s4中，采用电转染的方式将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤s3扩增培养后的肾前体细胞中；所述电转染的电压为200-300v，电击时间为200-300μs。
8.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s4中，在与表达多能干细胞诱导因子的质粒混合前，采用dpbs溶液洗涤步骤s3扩增培养后的肾前体细胞，然后采用含0.25％胰酶的edta溶液对肾前体细胞进行消化，消化1-2min，再采用10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；再在300-400g条件下离心3-4min，用dpbs溶液重悬细胞，使细胞密度控制在2-5×106个/ml。
9.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s5中，所述诱导培养基为含有5-azadc、kenpaullone、sb-431542、pd0325901和chir99021五种小分子化合物的人胚胎干细胞培养基；所述5-azadc的终浓度为1.5-2μmol/l，kenpaullone的终浓度为2.5-3μmol/l，sb-431542的终浓度为0.5-0.6μmol/l、pd0325901的终浓度为0.8-1μmol/l，chir99021的终浓度为1.5-2μmol/l。
10.根据权利要求1所述的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，其特征在于：步骤s5中，将转入质粒后的细胞在诱导培养基中诱导培养8-12d；然后在300-400g条件下离心3-4min，采用人胚胎干细胞培养基重悬细胞，继续培养15-18天，期间每天更换一次培养基。
技术总结