本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，具体为一种基于crispr-cas9编辑技术的精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法。
背景技术：
crispr-cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统，用于对抗病毒的入侵和外源dna。其中ⅱ型crispr-cas系统运用最为广泛，主要由rna导向的cas9核酸内切酶、一条导向rna(sgrna)和反式激活rna(tracrrna)组成。在这一系统中，crrna(crispr-derivedrna)通过碱基配对与tracrrna结合形成双链rna，引导cas9蛋白到靶序列上，在pam序列上游3bp位置特异性剪切dna双链，造成dna双链断裂(dsb，doublestrandbreak)，从而启动细胞内的dna损伤修复机制，导致修复后发生碱基缺失或插入，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的。目前该技术已经成熟的运用于真核细胞的基因组编辑中。
na /h 离子交换蛋白-1(sodium/hydrogenexchanger1，nhe1)是存在于细胞膜表面的离子转运泵蛋白家族的一员。nhe1具有维持细胞内ph值等内环境稳定以及调控宿主细胞的凋亡和增殖的重要功能，也是首个被鉴定的j亚群禽白血病病毒(avianleukosisvirus,alv-j)的细胞受体，该蛋白存在于所有真核细胞膜上。alv-j的env可特异性的结合鸡nhe1位于细胞外环-1(loop-1)的28-39位氨基酸，并以此介导alv-j的入侵及感染，而对alv-j不易感的禽类nhe1的w38氨基酸存在变异或缺失。本研究通过crispr/cas9技术，药物筛选后通过亚克隆的方法，成功获得鸡源nhe1基因w38位精确敲除的df-1细胞株delw38-nhe1，且发现delw38-nhe1细胞系能够有效封闭alv-j的感染。本发明为探究nhe1基因w38氨基酸生物学功能，解析nhe1基因w38位点与alv-j互作分子机制以及为构建抗alv-j转基因鸡与抗病毒药物开发打下了基础，具有良好的应用研究价值。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、构建一种特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna，所述的sgrna位于鸡nhe1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一；
步骤2)、准备一种用于靶向敲除鸡nhe1基因w38位的crispr-cas9系统，crispr-cas9系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列；crispr-cas9系统中，cas9蛋白的编码序列与sgrna的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lenticrisprv2；
步骤3)、合成以puc57为骨架，含有缺失nhe1基因w38位所需的供体质粒，并命名为：puc57-delw38；
步骤4)、将步骤1)构建的特异性靶向敲除鸡nhe1基因w38位的sgrna克隆至带有cas9基因的lenticrisprv2质粒，并将lenticrisprv2质粒与步骤3)构建的供体质粒puc57-delw38共同转染至细胞中；
利用crispr-cas9系统达到基因位点精准敲除，通过药物筛选和亚克隆的方法最后获得阳性单克隆细胞株，从而获得鸡源nhe1基因w38位敲除细胞系。
步骤1)中，对鸡nhe1基因设计了1条sgrna，所述sgrna靶位点位于nhe-1基因的第一个外显子区域，该外显子序列如seqidno.1所示；
所述的特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna编码链及互补链；其序列如seqidno.2所示。
步骤1)中，靶向鸡nhe1基因的sgrna制备方法，包括将合成的sgrna编码链和互补链退火形成双链dna，之后通过bsmbⅰ限制性内切酶酶切载体，将双链dna置于t7启动子之下构建获得。
步骤3)中，对鸡nhe1蛋白设计了缺失w38位点的模板供体质粒，所述缺失位点位于nhe1基因的第一个外显子区域，该供体质粒序列如seqidno.3所示。
步骤4)中，所述的细胞系为敲除鸡nhe1基因w38位点的细胞系。
本发明方法先进科学，通过本发明，本发明首先提供了一种特异性靶向鸡nhe1基因w38位点的sgrna，所述sgrna位于鸡nhe-1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一，本发明所述sgrna针对鸡nhe1基因的w38位点，其序列如seqidno.2所示。
本发明提供了一种用于靶向敲除鸡nhe1基因w38位点的crisprcas9系统，在所述的系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡nhe1基因w38位点的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列。
敲除的具体操作如下：
(1)利用ncbi在线数据库查找鸡nhe1基因组序列
ncbireferencesequence:nm_001044643.1
在该基因的第一个外显子区域设计敲除靶位点，第一个外显子的序列如seqidno.1所示。
(2)sgrna的构建：设计好的sgrna编码链和互补链分别命名为sgrna_f和sgrna_r，把引物稀释至100um浓度，体系如下：sgrna_f和sgrna_r各1ul，pcrbuffer1μl，ddw7μl，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链dna。另一方面，利用bsmbi限制性内切酶酶切lenticrisprv2载体，酶切体系如下：bsmbi限制性内切酶1μl，lenticrisprv2质粒1μg，0.1mdtt0.5μl，nebbuffer3.15μl，其余用ddw补至50μl，酶切条件为55℃15min，之后通过跑胶后胶回收获得含有粘性末端的lenticrisprv2载体质粒。最后，将获得的sgrna与酶切后的载体质粒通过连接酶连接，最终将sgrna放入lenticrisprv2质粒中，获得sgrna和cas9蛋白基因位于同一载体的质粒，命名为nhe1-sgrna。
(3)缺失nhe1基因w38位点所需的供体质粒的合成：由金唯智公司合成以puc57为骨架，含有缺失nhe1-w38所需的供体质粒，并命名为：puc57-delw38，其中修复模板序列如seqidno.3。
(4)敲除细胞系的获得：6孔板中转染构建好的nhe1-sgrna和puc57-delw38各2μg，设立不转染的细胞作对照。48h后加入含有嘌呤霉素的培养基进行药物筛选，每3天换药1次，待阴性对照细胞全部死亡后，换成不含药物的完全培养基，存活的细胞生长至适当密度后，利用有限稀释法进行亚克隆至96孔板中，待细胞生长至足够数量时进行鉴定，之后冻存阳性细胞。
通过本发明，为构建一个鸡源nhe1基因w38位敲除的细胞系,提供一种基于crispr-cas9编辑技术的敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡nhe1基因w38位氨基酸的sgrna，之后转染带有sgrna和cas9基因的lenticrisprv2质粒，利用crispr-cas9系统达到基因位点的精确敲除，通过药物筛选及亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源nhe1基因w38位敲除的细胞系。
本发明目的是构建一种基于crispr-cas9靶向敲除鸡nhe1基因w38氨基酸的方法，基于本发明建立的df-1细胞系可以有效封闭alv-j感染。本发明为抗alv-j转基因鸡及抗alv-j药物研发奠定基础。
本发明基于crispr-cas9靶向敲除鸡nhe1基因w38氨基酸的细胞系构建在相关领域未见报道，本发明建立的delw38-nhe1细胞系能有效封闭alv-j感染，为进一步探究nhe1基因w38氨基酸生物学功能，解析nhe1的w38与alv-j互作分子机制以及为构建抗alv-j转基因鸡及抗病毒药物开发打下了基础，具有较大的应用研究价值。
附图说明
图1为lenticrisprv2载体质粒的酶切；
泳道m：superdnamarker；泳道1：酶切后lenticrisprv2载体质粒。
图2为亚克隆nhe1-dew38细胞系的测序鉴定。
图3为westernblot评价nhe1-dew38细胞系抗alv-j效果；
泳道1：nhe1-dew38细胞系感染alv-j；泳道2：正常df-1细胞感染alv-j。
具体实施方式
实施例：
1,查找目的基因:利用ncbi在线数据库查找鸡nhe1基因组序列。ncbireferencesequence:nt_033779.5，在该基因的第一个外显子设计敲除靶位点，第一个外显子的序列如seqno.1所示。
2，利用在线设计网站设计针对靶序列的sgrna：利用张锋实验室网站https://zlab.bio/guide-design-resources进行sgrna的设计，选取6条候选sgrna，在sgrna_f的5’端前部添加caccg，在sgrna_r的5’端添加aaac，3’端添加c，具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
seqidno.2表1.靶向敲除鸡nhe1w38基因的sgrna
3,双链sgrna的获得：用ddw将sgrna_f和sgrna_r溶解，使其终浓度为100μm浓度，利用以下退火体系：sgrna_f和sgrna_r各1μl，10×pcrbuffer1μl，ddw7μl，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链dna。
4，载体质粒的酶切：利用bsmbi限制性内切酶酶切lenticrisprv2载体，酶切体系如下：bsmbi限制性内切酶1μl，lenticrisprv2质粒1μg，0.1mdtt0.5μl，nebbuffer3.15μl，其余用ddw补至50μl，酶切条件为55℃15min，之后通过跑凝胶电泳(图1)，胶回收获得含有粘性末端的lenticrisprv2载体质粒。
5，表达sgrna载体质粒的构建：将退火获得的双链sgrna进行100倍稀释，同时将胶回收的载体质粒稀释至50ng/μl，之后按照以下体系进行连接：载体质粒1μl，双链sgrna1μl，t4连接酶1μl，10×t4buffer1μl，ddw6μl，在4℃连接过夜，随后转化至stbl3感受态细胞中，挑取菌落提质粒后送测序鉴定。
6，缺失nhe1-w38所需的供体质粒的合成：由金唯智公司合成以puc57为骨架，含有缺失nhe1-w38所需的供体质粒，并命名为：puc57-delw38，其中修复模板序列如seqidno.3。
7，敲除细胞系的筛选：准备一个6孔板的df-1细胞，每个孔分别转染4μg的sgrna和puc57-delw38各2μg，不转染的细胞作为对照,转染6h后换成5％生长液，48h后弃去原培养基，加入含有6μm嘌呤霉素的5％fbsdmem培养基进行筛选，每隔3天换液，待阴性对照组的细胞全部死亡后，加入无药物的5％fbsdmem，当细胞密度达到80％左右时，进行亚克隆并扩大培养。
8，敲除细胞系的鉴定：待亚克隆的细胞生长至足够密度时，传代至48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，之后收集细胞进行测序鉴定，以正常df-1细胞为对照，结果如图2。
9，将df-1和delw38-nhe1细胞系感染moi＝5的alv-jgy03,细胞感染三天后进行westernblot验证，评价敲除细胞系抗病毒效果，结果如图3所示，感染alv-j的野生型df-1细胞中可以检测到强烈的env蛋白条带，而感染alv-j的敲除细胞系中未检测到env蛋白，表明所构建的敲除delw38-nhe1细胞系能有效阻断alv-j的感染入侵。
seqidno.1
鸡nhe1基因第一个外显子序列：
atgggggccgcggccctccgagcccttccctgggctctgctgctgctgctgggcccgctgctgcccggccagcgcttgcaggccgacgccacgcgtgtctccgagcccacctgggagcagccgtggggagagcccgggggtatcaccgccgccccgctggccacggcccaggaggtgcacccgctgaacaaacagcaccacaaccactcggccgaggggcacccgaagccccgcaaagctttccccgtgctgggcatcgactactcgcacgtccgcatccccttcgagatctcgctctggatcctgctggcctgcctgatgaagatgg
seqidno.2
seqidno.3
供体质粒puc57-delw38，修复模板序列：
gcccgctgctgcccggccagcgcttgcaggccgacgccacgcgggtctccgagcccaccgagcagccgtggggagagcccgggggtatcaccgccgccccgctggccacggcccaggaggtgcacccgctgaacaaacagcaccacaaccactc。
序列表
<110>扬州大学
<120>一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>328
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgggggccgcggccctccgagcccttccctgggctctgctgctgctgctgggcccgctg60
ctgcccggccagcgcttgcaggccgacgccacgcgtgtctccgagcccacctgggagcag120
ccgtggggagagcccgggggtatcaccgccgccccgctggccacggcccaggaggtgcac180
ccgctgaacaaacagcaccacaaccactcggccgaggggcacccgaagccccgcaaagct240
ttccccgtgctgggcatcgactactcgcacgtccgcatccccttcgagatctcgctctgg300
atcctgctggcctgcctgatgaagatgg328
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caccgccccacggctgctcccaggt25
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aaacacctgggagcagccgtggggc25
<210>4
<211>154
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gcccgctgctgcccggccagcgcttgcaggccgacgccacgcgggtctccgagcccaccg60
agcagccgtggggagagcccgggggtatcaccgccgccccgctggccacggcccaggagg120
tgcacccgctgaacaaacagcaccacaaccactc154
1.一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）、构建一种特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna，所述的sgrna位于鸡nhe1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一；
步骤2）、准备一种用于靶向敲除鸡nhe1基因w38位的crispr-cas9系统，crispr-cas9系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列；crispr-cas9系统中，cas9蛋白的编码序列与sgrna的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lenticrisprv2；
步骤3）、合成以puc57为骨架，含有缺失nhe1基因w38位所需的供体质粒，并命名为：puc57-delw38；
步骤4）、将步骤1）构建的特异性靶向敲除鸡nhe1基因w38位的sgrna克隆至带有cas9基因的lenticrisprv2质粒，并将lenticrisprv2质粒与步骤3）构建的供体质粒puc57-delw38共同转染至细胞中；
利用crispr-cas9系统达到基因位点精准敲除，通过药物筛选和亚克隆的方法最后获得阳性单克隆细胞株，从而获得鸡源nhe1基因w38位敲除细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，
步骤1）中，对鸡nhe1基因设计了1条sgrna，所述sgrna靶位点位于nhe-1基因的第一个外显子区域，该外显子序列如seqidno.1所示；
所述的特异性靶向鸡nhe1基因w38位的sgrna编码链及互补链；其序列如seqidno.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，
步骤1）中，靶向鸡nhe1基因的sgrna制备方法，包括将合成的sgrna编码链和互补链退火形成双链dna，之后通过bsmbⅰ限制性内切酶酶切载体，将双链dna置于t7启动子之下构建获得。
4.根据权利要求1所述的一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，
步骤3）中，对鸡nhe1蛋白设计了缺失w38位点的模板供体质粒，所述缺失位点位于nhe1基因的第一个外显子区域，该供体质粒序列如seqidno.3所示。
5.根据权利要求1所述的一种精确敲除鸡nhe1基因w38位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，
步骤4）中，所述的细胞系为敲除鸡nhe1基因w38位点的细胞系。
技术总结