本发明属于植物基因工程和植物抗除草剂育种领域，本发明利用引导编辑系统获得了多类型的accase基因突变体抗除草剂水稻株系。
背景技术：
粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，近年来随着社会经济的快速发展和农业技术的不断提高，粮食短缺的问题得到缓解，但为了满足由于人口迅速增长而不断扩大的粮食需求，急需提高水稻产量和改善稻米品质。随着水稻直播栽培技术在农业生产中的大面积应用，水稻直播生产中农田杂草问题成为影响农作物产量的重要因素。为了防除稻田杂草，不仅投入大量的人力物力和财力，还喷洒了大量除草剂。而传统的育种方式周期长，可利用的种质资源匮乏，因此，培育抗除草剂的水稻十分必要。
由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生的速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。目前，对抗性杂草种群形成的原因有两种观点：一种认为杂草长期与除草剂接触，而使除草剂作用部位的编码基因发生突变或者基因表达发生改变，结果导致杂草对除草剂的解毒能力提高或者出现对除草剂具有耐药性或抗药性的种群。总的来说，杂草抗性的形成，基本上是一个抗性基因被选择的过程，抗药性基因的遗传是杂草产生抗药性的基础。之前的报道认为，抗药性的产生不仅是由于植物改变了对除草剂的吸收与转运或植物加速了除草剂的代谢，且主要是因为除草剂的作用部位发生了改变。相当一部分杂草通过靶标酶accase的变化来解除或减少其与除草剂的亲和性而获得抗性。随着转基因技术以及基因组编辑技术的发展，为水稻抗除草剂育种提供了一条有效的途径。
技术实现要素：
技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种引导编辑系统介导作物产生内源除草剂抗性的方法，并且，还提供了可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂抗性的水稻accase突变型蛋白。
为此，本发明提供了一种引导编辑系统介导作物产生内源除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)构建含有accase特异位点随机突变的引导编辑表达盒和sgrna及引导模板rna表达盒；
2)将所述表达盒中的表达载体通过遗传转化目标作物，使其包含accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白在下述位点中的至少一处发生突变：第1879位、1927位、2097位、2139位、2176位和2194位；
3)使目标作物表达所述水稻accase突变型蛋白。
在一种实施方式中，本发明提供了一种水稻accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白的多个氨基酸序列经过定点替换，获得突变体。
优选地，本发明的水稻accase的氨基酸序列第1879、1927、2097、2139、2176、2194位氨基酸发生了多种类型的突变。
优选地，第1879位氨基酸由异亮氨酸分别突变为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸等，第1927位由脯氨酸突变为络氨酸或苯丙氨酸，第2097位由色氨酸突变为甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸，第2139位由异亮氨酸突变为天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸，第2176位由天冬氨酸突变为甘氨酸，第2194位由甘氨酸突变为丝氨酸和丙氨酸。
本发明还提供一种水稻accase突变型蛋白，包括下述中的一种：(a)其氨基酸序列seqidno:1，及在(a)中的氨基酸序列经过定点替换具有乙酰辅酶a羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明还提供一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。
本发明所述的核酸或基因，包括：
(i)编码所述的蛋白的核酸或基因；或
(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组载体，其含有所述的核酸或基因。
本发明还提供本发明的方法以及相应accase突变型蛋白、核酸或基因，重组载体在植物抗除草剂方面的应用。
本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：
1)使植物包含所述核酸或基因；或
2)使植物表达所述水稻accase突变型蛋白。
本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。本方法不仅适用于获得accase基因，也包含其他植物基因突变体及材料的获得。
进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰accase酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是抗(耐)乙酰辅酶a羧化酶类除草剂。
本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，以使得目标植株包括本发明的突变序列。
本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使目标植株表达本发明的氨基酸序列。
本发明还提供了耐受除草剂的水稻植物，其表达含有抗除草剂突变位点的accase基因，该基因序列不同于野生型水稻植物的accase基因序列，是accase基因含有抗除草剂突变位点的序列。发明人通过定向突变的方法获得了上述携带有突变位点的水稻accase突变序列，并将其转入到野生型水稻品种，发现携带有accase突变位点的转基因水稻可以抗accase类除草剂，而野生型水稻对accase类除草剂表现敏感。本发明还提供了所述核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还提供了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等植物中的应用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出引导编辑载体示意图
图2示出含有accase突变位点的引导编辑植株，
图3示出水稻accase突变位点的测序结果图；
图4为本发明中另一突变体与野生型的抗除草剂效果对比。
具体实施方式
以下参照实施例对本发明进行说明。但本领域技术人员可以理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1、植物accase突变位点获得和植物表达载体的构建
以水稻为例，选择植物acc基因中的核苷酸序列ttcctcgtgctggacaagtgtgg等多位点(下划线部分为所述5’ngg-3’结构的pam序列)，作为打靶位点。按所选择靶位点合成(通用生物有限公司)正向寡核苷酸链和可与之互补的反向寡核苷酸链，具体序列见表1：
表1
crispr介导的引导编辑系统
本发明采用spcas9蛋白介导的引导编辑系统phun411-pe2，该系统可在基因组上引入预先设计nnn的随机突变。用bsai内切酶(neb公司)在37℃酶切phun411-pe2载体4小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。用goldgate法(neb公司)将重组载体骨架片段和插入片段及sgrnascoffold首尾相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于植物acc基因crispr/cas9靶向的重组载体质粒，命名为phun411-pe2-accpegrna，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心植物组保存)，经菌落pcr筛选获得阳性克隆，获得含有phun411-pe2-accpegrna的农杆菌。用于靶向accase的引导编辑载体见图1。
实施例2、阳性转基因植株获得
成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照yongboduan(yongboduan，chenguangzhai，etal.anefficientandhigh-throughputprotocolforagrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninjaponicarice(oryzasatival.)[j].plantcellreport，2012.doi10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法，在培养基上加入2μm的吡氟氯禾灵除草剂，获得抗性愈伤，进一步再生获得抗性植株(图1)。
实施例3：植物抗乙酰辅酶a羧化酶类除草剂突变体2097突变位点分析
将获得的抗除草剂的突变植株选取叶片并提取基因组dna，送invitrogen公司进行扩增和单克隆些许。测序结果与野生型日本晴accase基因比较，发现在accase基因的不同靶向位置都发生了碱基突变。需要说明的是这些突变植株的获得是在除草剂作为筛选压的条件下筛选获得。
参见图2，发明人将野生型和两种突变植株移栽至土壤中，每隔3天喷施0.15g/l吡氟氯禾灵2次后，突变植株表现出对除草剂的抗性，三束植株分别是野生型植株、第2139位点突变为天冬酰胺、缬氨酸的植株和第2139位点突变为丝氨酸的植株。
如图2的中间部分所示，由于专利中将图片转变成了灰度图像可能并不明显，但是原图中可以明显看出，最左侧的野生型基因植株已经枯黄，失去生机，中间的第2139位点突变为亮氨酸的植株i2139s虽然仍然具有生命迹象，为绿色株苗，但是生长还是受到了抑制，株高明显低于i2139v和i2139n，
进而可以证明，本申请发明人所找到的突变体均具有除草剂抗性，i2139v和i2139n抗性尤佳。
类似的，采用上述同样方法，本申请的发明人还找到了几个能够用于产生除草剂抗性的位点，分别是第1879位、第1927位、第2097位、第2176位和第2194位。
以2097位为例(其序列如序列表1所示)，如图4所示，该突变体的基因在accase基因上发生了2个位点的突变，第6289位点核苷酸发生突变，分别由t变成g，或第6289、第6291位点核苷酸发生突变，分别由t变成g、g变成c/t，(即，6289-6291由tgg现在突变成ggg或ggc或ggt)导致其相应编码的氨基酸序列的第2097位点由色氨酸变为甘氨酸，其在类似实验下的实验效果可以从图4中明显看出，将野生型和两种突变植株移栽至土壤中，每隔3天喷施0.15g/l吡氟氯禾灵2次后，突变植株表现出对除草剂的抗性，三束植株分别是野生型植株、第2097位点突变为亮氨酸的植株和第2097位点突变为甘氨酸的植株。
从图中可以看出，最左侧的野生型基因植株已经枯黄，失去生机，中间的第2097位点突变为亮氨酸的植株w2097l虽然仍然具有生命迹象，为绿色株苗，但是生长还是受到了抑制，株高明显低于w2097g。
进而可以证明，本申请发明人所找到的突变体均具有除草剂抗性，w2097g抗性尤佳。
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。
序列表
<110>安徽省农业科学院水稻研究所
<120>一种引导编辑系统介导作物产生内源除草剂抗性的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2414
<212>prt
<213>突变体(accase)
<400>1
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24052410
1.一种引导编辑系统介导作物产生内源除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)构建含有accase特异位点随机突变的引导编辑表达盒和sgrna及引导模板rna表达盒；
2)将所述表达盒中的表达载体通过遗传转化目标作物，使其包含accase突变型蛋白，所述accase突变型蛋白在下述位点中的至少一处发生突变：第1879位、1927位、2097位、2139位、2176位和2194位；
3)使目标作物表达所述水稻accase突变型蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用spcas9蛋白介导的引导编辑系统，利用内切酶对所述引导编辑系统中的载体进行酶切，作为构建重组载体的骨架片段，将重组载体骨架片段和插入片段及sgrnascoffold首尾相连，转入大肠杆菌中，通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子，经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于植物acc基因crispr/cas9靶向的重组载体质粒，利用冻融法将相应载体转入根癌农杆菌，经菌落pcr筛选获得阳性克隆；
将目标作物种子去掉颖壳后利用酒精和次氯酸钠进行预处理，然后将预处理后的种子利用无菌水浸泡预定时间，用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上，暗培养后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养用于农杆菌转化，采用转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，转化时在培养基上加入预定量除草剂，获得抗性愈伤，进一步再生获得抗性植株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述accase突变型蛋白的氨基酸序列第1879位氨基酸由异亮氨酸分别突变为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸等，第1927位由脯氨酸突变为络氨酸或苯丙氨酸，第2097位由色氨酸突变为甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸，第2139位由异亮氨酸突变为天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸，第2176位由天冬氨酸突变为甘氨酸或者第2194位由甘氨酸突变为丝氨酸和丙氨酸。
4.一种accase突变型蛋白，其特征在于，所述突变型蛋白的第1879、1927、2097、2139、2176和2194位中的至少一位发生突变。
5.根据权利要求5所述的accase突变型蛋白，其特征在于，所述突变型蛋白的氨基酸序列第1879位氨基酸由异亮氨酸分别突变为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸等，第1927位由脯氨酸突变为络氨酸或苯丙氨酸，第2097位由色氨酸突变为甘氨酸、丝氨酸或亮氨酸，第2139位由异亮氨酸突变为天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸，第2176位由天冬氨酸突变为甘氨酸，第2194位由甘氨酸突变为丝氨酸和丙氨酸。
6.一种用于产生内源除草剂抗性的重组载体构建方法，其特征在于，所述方法包括采用spcas9蛋白介导的引导编辑系统，利用内切酶对所述引导编辑系统中的载体进行酶切，作为构建重组载体的骨架片段，将重组载体骨架片段和插入片段及sgrnascoffold首尾相连，转入大肠杆菌中，通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子，经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于植物acc基因crispr/cas9靶向的重组载体质粒。
7.一种accase突变型基因，其特征在于，
(i)其编码根据权利要求4或5所述的蛋白；或
(ii)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
8.一种权利要求4所述的accase突变型蛋白或权利要求7所述的accase突变型基因的应用，其用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性。
技术总结