本发明涉及动物模型构建领域，具体地说，是一种人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用。
背景技术：
：慢性胰腺炎(chronicpancreatitis，cp)是指各种病因引起胰腺组织和功能损害的进行性慢性炎症性疾病，其病程较长甚至伴随终身，临床以腹痛、营养吸收不良、糖尿病和胰腺钙化为主要表现，严重影响患者的生活质量。过去20余年，遗传因素在cp病因学中的作用越来越得到重视。胰腺除了分泌胰蛋白酶外，还可分泌另一种非常重要的酶-脂肪酶。其中，羧基酯脂肪酶(carboxylesterlipase，cel)在十二指肠内经胆盐激活参与胆固醇和脂溶性维生素的水解和吸收，是一种主要在胰腺腺泡细胞内表达的糖蛋白，约占胰液中总蛋白量的4％。一部分酶也在细胞浆中存在，与胞浆内胆固醇和氧化脂蛋白发生相互作用。人cel基因位于染色体9q34.3的位置，共有11个外显子，在其下游是一种随机排列的假基因-celp，两者序列高度相似。2015年，挪威fjeld等在《naturegenetics》上在欧洲人群中首先报道了一个新的cp易感致病基因变异：cel–hyb1(fjeldk,weissfu,lasherd,etal.arecombinedalleleofthelipasegenecelanditspseudogenecelpconferssusceptibilitytochronicpancreatitis.natgenet2015；47:518-22.)，该杂合变异由cel基因和其相邻的假基因celp发生非等位基因同源重组形成(图1)。细胞实验发现cel–hyb1存在脂肪酶活性下降，分泌受损，蛋白胞内累积，并诱发自噬。体外实验高度提示变异蛋白存在细胞毒性并引起内质网应激，但目前尚无动物模型验证其潜在致病机制。传统的cp动物模型，存在操作复杂、周期长、表型不稳定、不能模拟人体情况等缺点，因此cp基因模型逐渐成为近年来的研究热点。目前国际上有报道cp相关的点突变模型，如验证胰酶激活通路的prss1r122h突变小鼠，验证内质网应激通路的cpa1p.n256k突变小鼠，但尚无相关小鼠模型阐明内质网应激-自噬通路在cp发生发展中的作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用，将cel-hyb1人源化基因(seqidno.1)敲入小鼠，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，定点敲入人源化cel-hyb1基因，模拟人慢性胰腺炎(cp)的发病过程。尽管人cel基因和小鼠cel基因序列上高度相似，由于cel-hyb1是大片段结构变异，目前无法直接在小鼠上进行突变模拟，因此我们拟扩增人cel-hyb1变异，在小鼠cel基因合适的位置进行替换，一方面能够沉默小鼠cel基因表达，另一方面使其正常表达人的cel-hyb1基因。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的第一方面，提供一种人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：a、通过体外转录的方式，获得cas9mrna和guiderna(grna)，其中guiderna的序列如seqidno.2和seqidno.3所示；seqidno.2：aagaagctcagtctcttgggtgg，seqidno.3：aacaagaagctcagtctcttggg；b、通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体，所述的同源重组载体包含3.0kb5’同源臂、hcel-hyb1-3xflag-mcel3’utr-polya和3.0kb3’同源臂，质粒进行酶切鉴定(5’同源臂的序列如seqidno.4所示，3’同源臂的序列如seqidno.5所示)；c、将cas9mrna、guiderna和载体(donorvector)显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠，并进行鉴定；进一步的，所述的步骤c中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为f0代小鼠，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，长片段pcr鉴定电泳结果，所使用鉴定引物的序列如seqidno.6和seqidno.7所示：seqidno.6：cctcctgcccccacccccactcat，和seqidno.7：cccaccttctcagccacctttttg。反应体系：reactioncomponentvolume(μl)ddh2o13.2gxlpcrbuffer22.5mmdntp2primeri(10pmol/μl)0.5primerii(10pmol/μl)0.5gxldnapolymerase*0.8genomicdna1total20*primestargxl(takara，codeno：r050a)反应条件：step#temp(℃)timenote1943min-29815sec-36015sec-4683minrepeatsteps2-4for35cycles5685min-612-holdd、pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配获得f1代小鼠；由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的f0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的f1代小鼠；后续小鼠交配繁殖过程中，当母鼠哺育子代鼠到3周龄时，收集鼠尾粗提dna进行鉴定。e、通过短片段pcr的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠；使用引物对(p1 p2)，(p3 p4)分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp(野生型：p1 p2扩增出697bp条带，且p3 p4无条带；杂合子：p1 p2扩增出697bp条带，且p3 p4扩增出小条带402bp；纯合子：p1 p2无条带，且p3 p4扩增出小条带402bp)。p1：gcggtgggaaagtgcggggatagt(forward)(seqidno.8)p2：cttgccagccagggtgacg(reverse)(seqidno.9)p3：gctagagcttggcgtaatcat(forward)(seqidno.10)p4：cagtcttcttgcccataggtgt(reverse)(seqidno.11)。f、利用flag标签抗体(货号：cmctag(at0022))，通过westernblot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hcel-hyb1的表达情况进行分析。本发明的第二方面，提供一种如上所述的人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法构建得到的动物模型在慢性胰腺炎机理研究和治疗药物筛选中的应用。进一步的，所述的应用中，取不同年龄段小鼠胰腺组织，通过he染色评价cel-hyb1小鼠的胰腺病理改变，免疫组化检测cel-hyb1小鼠胰腺炎症细胞浸润情况。进一步的，所述的应用中，利用real-timeqpcr与westernblotting对cel-hyb1小鼠胰腺组织的chop，bip和lc3b进行检测，探索潜在的致病通路。本发明优点在于：本发明在国际上首次构建cel-hyb1人源化基因小鼠，也是第一次为cel-hyb1变异致病提供体内证据，本发明构建的动物模型具有诱导胰腺内质网应激与自噬及自发产生慢性胰腺炎病变的特点，有望发展成为一种可替代传统动物模型的新型实验动物模型，为慢性胰腺炎的药物与基因治疗提供新的理论依据和动物模型。附图说明图1.cel及其假基因celp结构图。图2.小鼠cel和人源cel编码氨基酸对比。图3.hcel-hyb1小鼠构建策略示意图。图4.采用crispr/cas9技术构建cel-hyb1人源化基因敲入小鼠的具体流程。图5.同源重组质粒图谱。图6.同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图；数字：f0代小鼠编号；m为1kbdnamarker。图7：f1代小鼠5’同源臂(marker左侧)和3’同源臂(marker右侧)pcr鉴定电泳图；(数字：f1代小鼠编号；m：1kbdnaladder)。图8.pcr鉴定小鼠基因型。图9.野生型、杂合和纯合cel-hyb1小鼠的cel-hyb1表达情况。图10.野生型、杂合和纯合cel-hyb1小鼠的cel表达情况。图11.小鼠胰腺组织he染色结果。图12.小鼠胰腺组织cd45、f4/80检测。图13.cel-hyb1小鼠胰腺组织内质网应激与自噬通路检测。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例1：cel-hyb1人源化基因敲入小鼠的构建方法与鉴定由于人cel基因和小鼠cel基因(cel-201)序列上高度相似，cel-201(ensembl号：ensmusg00000026818)转录本结构内有11个exons，蛋白翻译起始于exon1，终止于exon11。首先扩增人cel-hyb1序列，选择cel-201的合适位置，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式进行基因导入。为真实体现人cel-hyb1在体内的作用，构建过程中一方面需要沉默小鼠本身cel的表达，插入位置需要在靠前的外显子；另一方面为有效保证人cel-hyb1的正常表达，我们借用小鼠本身的cel的信号肽序列(exon1)；因此，我们最终选择在小鼠exon2的位置插入人源cel-hyb1，mcel-201的3’utr及sv40-pa(图2)。在cel基因exon2位点定点敲入hcel-hyb1-3xflag-mcel3’utr-polya表达框(简要过程如图3、图4)。1)通过体外转录的方式，获得cas9mrna和guiderna(grna)，使用crispr.mit.edu来设计guiderna，选取其中得分较高的结果：seqidno.2：aagaagctcagtctcttgggtgg，和seqidno.3：aacaagaagctcagtctcttggg。2)通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体(图5)，该载体包含3.0kb5’同源臂、hcel-hyb1-3xflag-mcel3’utr-polya和3.0kb3’同源臂，质粒进行酶切鉴定；3)将cas9mrna、grna和donorvector显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠，并进行鉴定：将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为f0代小鼠，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，双臂同源重组阳性的f0代小鼠为9、10、14、23、32号，长片段pcr鉴定电泳结果，所使用鉴定引物为(图6)：seqidno.6：cctcctgcccccacccccactcat，和seqidno.7：cccaccttctcagccacctttttg。4)pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配获得f1代小鼠；由于受精卵早期卵裂速度快，因此得到的f0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的f1代小鼠；后续小鼠交配繁殖过程中，当母鼠哺育子代鼠到3周龄时，收集鼠尾粗提dna进行鉴定(图7)，pcr鉴定阳性小鼠为9、10、11、13、17号，经测序确认均为阳性；f1代阳性小鼠pcr鉴定产物测序，共进行了4个测序反应，其中，5’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应，3’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应。5)通过短片段pcr的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠(图8)；使用引物对(p1 p2)，(p3 p4)分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp(野生型：p1 p2扩增出697bp条带，且p3 p4无条带；杂合子：p1 p2扩增出697bp条带，且p3 p4扩增出小条带402bp；纯合子：p1 p2无条带，且p3 p4扩增出小条带402bp)。p1：gcggtgggaaagtgcggggatagt(forward)(seqidno.8)；p2：cttgccagccagggtgacg(reverse)(seqidno.9)；p3：gctagagcttggcgtaatcat(forward)(seqidno.10)；p4：cagtcttcttgcccataggtgt(reverse)(seqidno.11)。6)利用标签抗体(图9)，通过westernblot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hcel-hyb1的表达情况进行分析，发现纯合子和杂合子均存在hcel-hyb1蛋白的表达，野生型小鼠中无hcel-hyb1蛋白表达；利用cel抗体(图10)，通过westernblot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织原cel基因的表达情况进行分析，发现杂合小鼠表达量低于野生型的50％，纯合小鼠基本无表达，符合预期情况。实施例2：cel-hyb1人源化基因敲入小鼠的表型及致病机制1)解剖不同年龄段小鼠获取胰腺组织，通过he染色评价cel-hyb1小鼠的胰腺病理改变：与野生c57bl/6小鼠相比，3月龄小鼠胰腺尚无明显变化；部分6月龄cel-hyb1小鼠胰腺出现小叶间隙扩大、炎症细胞浸润，部分12月龄小鼠出现局灶性cp改变，包括腺泡破坏，炎症细胞浸润，萎缩和纤维化等(图11)，同时，免疫组化检测发现与野生c57bl/6j小鼠相比，cel-hyb1小鼠胰腺cd45、f4/80阳性细胞增多，提示炎症细胞浸润(图12)。2)real-timeqpcr提示cel-hyb1小鼠胰腺组织的chop，bip(内质网应激指标)表达升高，westernblotting提示lc3b(自噬指标)表达水平增高，提示异常蛋白蓄积激发内质网应激是其潜在的致病通路，并且诱导腺泡细胞自噬增强(图13)。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。序列表<110>中国人民解放军海军军医大学第一附属医院<120>一种人源胰腺炎相关cel-hyb1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用<130>/<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2078<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1tccataaatacccgaggcccagggggagggccacccagaggctgatgctcaccatggggc60gcctgcaactggttgtgttgggcctcacctgctgctgggcagtggcgagtgccgcgaagc120tgggcgccgtgtacacagaaggtgggttcgtggaaggcgtcaataagaagctcggcctcc180tgggtgactctgtggacatcttcaagggcatccccttcgcagctcccaccaaggccctgg240aaaatcctcagccacatcctggctggcaagggaccctgaaggccaagaacttcaagaaga300gatgcctgcaggccaccatcacccaggacagcacctacggggatgaagactgcctgtacc360tcaacatttgggtgccccagggcaggaagcaagtctcccgggacctgcccgttatgatct420ggatctatggaggcgccttcctcatggggtccggccatggggccaacttcctcaacaact480acctgtatgacggcgaggagatcgccacacgcggaaacgtcatcgtggtcaccttcaact540accgtgtcggcccccttgggttcctcagcactggggacgccaatctgccaggtaactatg600gccttcgggatcagcacatggccattgcttgggtgaagaggaatatcgcggccttcgggg660gggaccccaacaacatcacgctcttcggggagtctgctggaggtgccagcgtctctctgc720agaccctctccccctacaacaagggcctcatccggcgagccatcagccagagcggcgtgg780ccctgagtccctgggtcatccagaaaaacccactcttctgggccaaaaaggtggctgaga840aggtgggttgccctgtgggtgatgccgccaggatggcccagtgtctgaaggttactgatc900cccgagccctgacgctggcctataaggtgccgctggcaggcctggagtaccccatgctgc960actatgtgggcttcgtccctgtcattgatggagacttcatccccgctgacccgatcaacc1020tgtacgccaacgccgccgacatcgactatatagcaggcaccaacaacatggacggccaca1080tcttcgccagcatcgacatgcctgccatcaacaagggcaacaagaaagtcacggaggagg1140acttctacaagctggtcagtgagttcacaatcaccaaggggctcagaggcgccaagacga1200cctttgatgtctacaccgagtcctgggcccaggacccatcccaggagaataagaagaaga1260ctgtggtggactttgagaccgatgtcctcttcctggtgcccaccgagattgccctagccc1320agcacagagccaatgccaagagtgccaagacctacgcctacctgttttcccatccctctc1380ggatgcccgtctaccccaaatgggtgggggccgaccatgcagatgacattcagtacgttt1440tcgggaagcccttcgccacccccacgggctaccggccccaagacaggacagtctctaagg1500ccatgaccgcctactggaccaactttgccaaaacaggggaccccaacatgggcgactcgg1560ctgtgcccacacactgggaaccctacactacggaaaacagcggctacctggagatcacca1620agaagatgggcagcagctccatgaagcggagcctgagaaccaacttcctgcgctactgga1680ccctcacctatctggcgctgcccacagtgaccgaccaggaggccagttccatgccctcca1740caggggactctgaggccactcccgtctcccccgacaggcaactccgagtctgcccccgtc1800cctgcaacgggtgactctcaggatgcccctgtgcccctcacaagtgactctgaggctgcc1860cccgtgcccccctcaggtgactctgaggctcccccgtaccctacgggtgactctgaggcc1920cgtgcccaccttgggtgacactgaggctgccccatccccgctacgggtgactctgaggcc1980gcccctgtgtcccccacagatgactccgaggaagctcagatgctgcagtcattagtttct2040agtgtcccatcagccttggtctcaagaggccgagaggg2078<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2aagaagctcagtctcttgggtgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3aacaagaagctcagtctcttggg23<210>4<211>3000<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4ttacctccaggtccagtcctttccccccccctccctctgtcattctgtgcctccattcct60tctgggctttgtctctttctgcctggtattctcagggagccctatccacccctagtgagg120ctcagacatgaaacactaccctttctctgaagaggccaccaagccctggtaagtgagcca180tgccaggtttggctcagggagctcaccttccatctgtgccactatgtcctcccctgccag240ggcagcctgcactgccccataccctagtgcattacttgggtcctctctctctcttctctc300tctctcttctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcctctc360ccccctcccctcccctccccctccccctcctcctcctcctccttcttctctctctctctc420tctccctctctctctctctctctctctctctctcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcacgc480aggagtccttcatagattccccactgagataaggggcattcagtacctcaagatgaagcc540cacccatttttctgaaggtgacactaactgaaccctgataaaacagggttctatgcggaa600cacccagccagagttggccctgggaggcaccccctcgacaatatccatgccacctgcctc660tgctcccaggtgggcagtaacccacacaggtgcactgtgggcaccactccggatgctcag720ggccagcctgacctgggaaaaaatggaccatcccacacctgtgtgtctgtgtatacatgg780tatgcacacacatgaccttggccccagctccataaatactggagaagaggagagaaggcc840gcctagaggcagacactcaccatggggcgcctggaggttctatttcttggcctcacctgc900tgcttggcagcggcttgtgctgcaaaggtaagccggaaccctacaagggactacagccct960ctctcattcactaagatctgggaactgggacagagcctggagggtgggagacagagtaca1020gaaagacaagaaaaggccagcgagcccactagcactccaagctctggtcctgcctgagac1080acccagtttgtcttattcacatgaagcccagtgcaacatgcaaaactgcactggagtctc1140acaccaggagcagttttatgtaagaatgtcccatgcactgtttgaaagatttatactaga1200agcccactagtgctctgtggtttcaggtatgcctaagtctggcaagcctccccacagacc1260ctggcttttccttttctagaggggtctcctgccaacagagaagcagtttgcttggcatta1320cacagcaaccatatcctgttcttaaataggaacctgaaatgtctgttccaaatcagggct1380ctggctcccaagtgccctccatttcctgctccccctgagaaggggtgagacctacccata1440cccgctgtgtgccctgaggagctgcaccagctctt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技术特征：1.一种人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、通过体外转录的方式，获得cas9mrna和guiderna，其中guiderna的序列如seqidno.2和seqidno.3所示；
b、通过in-fusioncloning的方法构建同源重组载体，所述的同源重组载体包含3.0kb5’同源臂、hcel-hyb1-3xflag-mcel3’utr-polya和3.0kb3’同源臂，质粒进行酶切鉴定；
c、将cas9mrna、guiderna和载体显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠，并进行鉴定；
d、pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配获得f1代小鼠；
e、通过短片段pcr的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠；使用引物对p1 p2，p3 p4分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp；所述的p1、p2、p3、p4的序列分别如seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11所示；
f、利用flag标签抗体，通过westernblot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hcel-hyb1的表达情况进行分析。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤b中，5’同源臂的序列如seqidno.4所示，3’同源臂的序列如seqidno.5所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤c中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为f0代小鼠，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，长片段pcr鉴定电泳结果，所使用鉴定引物的序列如seqidno.6和seqidno.7所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的纯合型小鼠：p1 p2扩增无条带，且p3 p4扩增出小条带402bp。
5.一种如权利要求1-4任一所述的人源胰腺炎相关cel-hyb1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法构建得到的动物模型在慢性胰腺炎机理研究和治疗药物筛选中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用中，取不同年龄段小鼠胰腺组织，通过he染色评价cel-hyb1小鼠的胰腺病理改变，免疫组化检测cel-hyb1小鼠胰腺炎症细胞浸润情况。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用中，利用real-timeqpcr和westernblotting对cel-hyb1小鼠胰腺组织的chop，bip和lc3b进行检测，探索潜在的致病通路。
技术总结本发明涉及动物模型构建领域，具体是一种人源胰腺炎相关CEL‑HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用，将CEL‑HYB1人源化基因敲入小鼠，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，定点敲入人源化CEL‑HYB1基因，模拟人慢性胰腺炎的发病过程。本发明在国际上首次构建CEL‑HYB1人源化基因小鼠，也是第一次为CEL‑HYB1变异致病提供体内证据，本发明构建的动物模型具有诱导胰腺内质网应激与自噬及自发产生慢性胰腺炎病变的特点，有望发展成为一种可替代传统动物模型的新型实验动物模型，为慢性胰腺炎的药物与基因治疗提供新的理论依据和动物模型。
技术研发人员：廖专;邹文斌;毛霄彤;李兆申
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学第一附属医院
技术研发日：2021.04.08
技术公布日：2021.08.03
