本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法。
背景技术：
根癌农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有ti(tumourinducing)质粒和ri质粒，其上有一段t-dna(transferringdna)，农杆菌通过as(乙酰丁香酮)诱导后进入细胞后，可将t-dna插入到真菌基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导以植物和真菌为代表真核生物转基因的理论基础。
农杆菌转化必须使用双元载体系统(二元系统)或共整合系统，除ori序列等载体基本骨架外，均具备完整的vir基因区、t-dna及左右边界，以供核酸内切酶特异性识别并切割。双元载体分别由含有t-dna的多功能克隆质粒和含有vir区的ti衍生质粒构成，均位于农杆菌内，前者负责在大肠杆菌和农杆菌内进行复制和运载t-dna边界内的dna序列(目的基因及标记基因)，ti衍生质粒提供反式毒性区功能，催动t-dna的转移。共整合系统主要由同时含有转移区和毒力区的ti质粒和大肠穿梭质粒构成，ti质粒位于农杆菌内，穿梭质粒位于大肠杆菌，通过与大肠穿梭质粒发生同源重组将外源基因整合到ti质粒的t-dna区形成共整合质粒，使之成为t-dna的一部分。
技术实现要素：
本发明针对现有atm法转化真菌后必须提取基因组繁琐的阳性鉴定问题，提出一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的制备方法，摒弃了传统转化子鉴定中基因组pcr过程，采取了更为直观高效的绿色荧光标记和潮霉素抗性的鉴定方式，具有方便、成本低、用时少、安全性高、可靠性强的特点。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，以载体pcambia3301为基础构建潮霉素抗性双元质粒，与含有egfp标记基因的表达盒无缝克隆连接。
具体的所述的含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，包括以下步骤：
1)构建潮霉素表达盒与经ecori、xbal酶切后线性化pcambia3301质粒连接得到潮霉素抗性双元质粒；
2)以pct74为模板扩增得到，构建含有egfp标记基因的表达盒；
3)将步骤1)的潮霉素抗性双元质粒与步骤2)含egfp标记基因的表达盒无缝克隆连接。
进一步的，以质粒pan7-1为模板，利用如seqidno.1～2所示引物获得潮霉素表达盒gpda-hygr-trpc。
进一步的，所述的含egfp标记基因的表达盒包括gpda-egfp-trpc和glaa-egfp-trpc。
进一步的，所述的表达盒gpda-egfp-trpc中，获得各片段的引物依次如seqidno.3～8所示。
进一步的，所述的表达盒glaa-egfp-trpc中，获得各片段的引物依次如seqidno.9～14所示。
本发明的有益效果为：
本发明方法摒弃了传统转化子鉴定中基因组pcr过程，采取了更为直观高效的绿色荧光标记和潮霉素抗性的鉴定方式。不再需要苯酚-氯仿-异戊醇抽提样品基因组并以基因组为模板进行pcr阳性鉴定，只需要对转化子进行潮霉素抗性筛选再进行荧光观察即可确定阳性转化子，在极大加快了实验进度的同时更为直观快速地鉴定出阳性转化子，降低了实验成本，同时避免了使用苯酚、氯仿、异戊醇、液氮等危险试剂，具有更高的安全性和可靠性。
附图说明
图1是本发明潮霉素表达盒gpda-hygr-trpc的电镜图；
图2是本发明显微镜下对黑曲霉转化子进行荧光观测；gpda-1、glaa-1、野生型-1为转化子的单菌落照片；gpda-2、glaa-2为在明场下观察；glaa-3、gpda-3、野生型-2为黑暗场下由波长510nm—560nm激光激发；
图3是本发明观察到荧光的转化子提取基因组进行pcr鉴定；d1为gpda-egfp，a1为glaa-egfp。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1潮霉素抗性双元质粒的构建
以质粒pan7-1为模板，设计引物扩增得到片段大小为4108bp的dna片段(图1)，即为潮霉素表达盒gpda-hygr-trpc。
其中，引物序列为agctatgaccatgattacgaattcccttgtatctctac和catgcctgcaggtcgactctagatcgagtggagatgtgg。
反应体系为：primestargxlpremix(2x)25μl(终浓度1x)，上下游引物(10-15pmol)各1μl(终浓度0.2-0.3μm)，模板1μl,灭菌水22μl。
pcr扩增条件：98℃2min；98℃10s，58℃15s，68℃3min45s，35个循环，68℃10min；延伸时间根据片段大小而定，1kb/min。
利用gelextractionkit试剂盒纯化回收pcr产物,将纯化片段与经ecori、xbal酶切后线性化pcambia3301质粒连接转化dh5α大肠感受态，均匀涂布于kan (终浓度100μg/ml)抗性平板，挑取单菌落进行菌落pcr阳性鉴定，将鉴定成功阳性转化子送生工公司测序正确，得到具备潮霉素抗性双元质粒命名为pcam-gpd-hygr-trpc。酶切体系如表1。
表1双酶切体系
实施例2表达盒gpda-egfp-trpc的制备
以pan7-1为模板，利用引物fgpda：actcgatctagagtcgacctgcagggaattcccttgtatctc和rgpda：tgaacagctcctcgcccttgctcaccatggatccagcgcgcttggaaat扩增得到gpda启动子。画线部分为限制性酶切位点。反应体系为如表2。
表2gpda启动子反应体系
以pan7-1为模板，利用该引物fd-trpc：gcatggacgagctgtacaagtaaggatccgaagcttgaatc和rd-trpc：aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga扩增得到trpc终止子。画线部分为限制性酶切位点。反应体系为如表3。
表3trpc终止子反应体系
以pct74为模板，利用引物fd-gfp：tttccaagcgcgctggatccatggtgagcaagggcgaggagctgt和rd-gfp：gattcaagcttcggatccttacttgtacagctcgtccatgccgtg扩增得到egfp标记基因。反应体系为如表4。
表4egfp标记基因反应体系
以上各体系反应程序如表5。
表5egfp表达盒各组分pcr程序
实施例3表达盒glaa-egfp-trpc的制备
以黑糖化酶基因组为模板，用引物fglaa：cactcgatctagagtcgacctgcaggccatggctgaggtgtaat和rglaa：cctcgcccttgctcaccatgtcgacagcgcgcttggaaatcacatttg扩增得到gla启动子和糖化酶信号肽，画线部分为限制性酶切位点。反应体系为如表6。
表6glaa启动子反应体系
以pct74为模板，利用引物fa-gfp：caaatgtgatttccaagcgcgctgtcgacatggtgagcaagggcgagg和ra-gfp：attcaagcttcgtcgacttacttgtacagctcgtccat扩增得到egfp标记基因。反应体系为如表7。
表7egfp标记基因反应体系
以pan7-1为模板，利用该引物fa-trpc：atggacgagctgtacaagtaagtcgacgaagcttgaat和ra-trpc：aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga扩增得到trpc终止子。画线部分为限制性酶切位点。反应体系为如表8。
表8trpc终止子反应体系
上述egfp表达盒各组分pcr程序同表5。
实施例4含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建
使用trelieftmsosoocloningkitver.2无缝克隆试剂盒对实验实施例2和实施例3中制备得到的表达盒片段和实施例1中线性化双元质粒片段进行同源重组，反应体系如表9所示。
表9egfp基因表达质粒的重组连接体系
按照如上体系配制连接体系，置于pcr仪中，50℃连接0.5h，反应结束后将连接产物转移至冰上静置3min转化dh5α大肠感受态细胞，得到转化子板。
实施例5重组质粒转化子阳性鉴定
从转化板中随机挑选单菌落于500μl含lb(50mg/lkan)液体培养基中，于恒温摇床中37℃200rpm/min培养3-4h。培养基混浊后，以菌液为模版，利用表达盒引物fgpda(5′-actcgatctagagtcgacctgcagggaattcccttgtatctc-3′)和rd-trpc(5′-aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga-3′)、fglaa(5′-cactcgatctagagtcgacctgcaggccatggctgaggtgtaat-3′)和ra-trpc(5′-aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga-3′)、ft-egfp(5′-gttgcgtgccttccaggggcccgatctagtaacatag-3′)和rt-egfp(5′-cccgggtaccgagctcgaattcctattcctttgccct-3′)分别进行菌液pcr鉴定，菌液pcr体系如表10，反应程序同实施例2和3。并提取阳性菌株的重组质粒进行酶切验证，各酶切体系见表11。将鉴定结果为阳性且酶切鉴定正确菌株送昆明硕擎生物科技有限公司测序。
表10阳性筛选子验证pcr反应体系(50μl)
表11双酶切验证体系
在体式显微镜下对黑曲霉转化子进行荧光观测，结果如图2所示，可明显观察到gpda-egfp-2、glaa-egfp-2黑曲霉菌丝体，孢子囊在荧光场下激发出绿色荧光，而野生型没有荧光现象，说明表达盒gpda-egfp-trpc、glaa-egfp-trpc均已整合到黑曲霉的基因组中，并且稳定存在和表达，因此该发明的三种载体可用于真菌转化子的筛选，直接观察荧光，不用提取基因组鉴定。
对观察到荧光的转化子提取基因组进行pcr鉴定，阳性率达到100％，如图3所示，说明本发明的含有gfp标记基因的双元载体切实可用，大大缩减了实验步骤提高了效率，避免了使用有毒试剂且准确率高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>云南师范大学
<120>一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agctatgaccatgattacgaattcccttgtatctctac38
<210>2
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
catgcctgcaggtcgactctagatcgagtggagatgtgg39
<210>3
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
actcgatctagagtcgacctgcagggaattcccttgtatctc42
<210>4
<211>49
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tgaacagctcctcgcccttgctcaccatggatccagcgcgcttggaaat49
<210>5
<211>45
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tttccaagcgcgctggatccatggtgagcaagggcgaggagctgt45
<210>6
<211>45
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gattcaagcttcggatccttacttgtacagctcgtccatgccgtg45
<210>7
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gcatggacgagctgtacaagtaaggatccgaagcttgaatc41
<210>8
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga38
<210>9
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
cactcgatctagagtcgacctgcaggccatggctgaggtgtaat44
<210>10
<211>48
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
cctcgcccttgctcaccatgtcgacagcgcgcttggaaatcacatttg48
<210>11
<211>48
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
caaatgtgatttccaagcgcgctgtcgacatggtgagcaagggcgagg48
<210>12
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
attcaagcttcgtcgacttacttgtacagctcgtccat38
<210>13
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
atggacgagctgtacaagtaagtcgacgaagcttgaat38
<210>14
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
aaacgacggccagtgccaagcttcaagctctagaaaga38
1.一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建潮霉素表达盒与经ecori、xbal酶切后线性化pcambia3301质粒连接得到潮霉素抗性双元质粒；
2)以pct74为模板扩增得到，构建含有egfp标记基因的表达盒；
3)将步骤1)的潮霉素抗性双元质粒与步骤2)含egfp标记基因的表达盒无缝克隆连接。
2.根据权利要求1所述的一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，其特征在于，以质粒pan7-1为模板，利用如seqidno.1～2所示引物获得潮霉素表达盒gpda-hygr-trpc。
3.根据权利要求1所述的一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，其特征在于，所述的含egfp标记基因的表达盒包括gpda-egfp-trpc和glaa-egfp-trpc。
4.根据权利要求3所述的一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，其特征在于，所述的表达盒gpda-egfp-trpc中，获得各片段的引物依次如seqidno.3～8所示。
5.根据权利要求3所述的一种含有egfp标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，其特征在于，所述的表达盒glaa-egfp-trpc中，获得各片段的引物依次如seqidno.9～14所示。
技术总结