pSOY19-ZM2载体、其制备方法及应用与流程

专利2022-05-09 77

本发明涉及转基因大豆技术领域，具体涉及psoy19-zm2载体、其制备方法及应用。

背景技术：

大豆(glycinemax.merr.)是重要的油料作物和国民的蛋白质源，在农业生产上意义重大。大豆生长过程中，病虫草害严重影响了大豆的产量与品质，与国外大豆生产相比较，我国大豆生产竞争力很弱，85％以上依赖于进口，是一个被“卡脖子”的问题。因此，急需通过培育优质抗性品系来提高我国大豆的产量及品质，提高大豆生产的国际竞争力。

之前获得的抗除草剂转基因大豆均为组成型表达，即所产生的转基因大豆种子中也有epsps蛋白的积累，且积累量较高，这导致公众无法充分认可转基因大豆的食用安全性，因此发明人研发了psoy19-zm2载体、其制备方法及应用，在保证高效抗除草剂的条件下降低种子中抗除草剂蛋白含量。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提供psoy19-zm2载体、其制备方法及应用，本发明使抗除草剂蛋白在大豆的叶片等绿色组织中表达，而在种子中低表达或者零表达。

为解决以上技术问题，本发明提供了psoy19-zm2载体，psoy19-zm2载体由绿色组织特异启动子pgmcrb1和切除了35s启动子的psoy19载体连接而成。

为解决以上技术问题，本发明还提供了载体的制备方法，包括如下步骤：

s1：对gmcrb1基因的起始密码子上游2171bp的启动子序列进行pcr扩增，扩增引物如下：

pgmcrb1-f：

cccgggtaccgagctcgaattctcttataataaccctgttaac，

pgmcrb1-r：

gagactggtgatgaattcgtttcgtttccacacagtgc；得扩增的pgmcrb1片段，备用；

s2：用ecori和ncoi双酶切除植物表达载体psoy19载体中的35s启动子，备用；

s3：将步骤s1中的pgmcrb1片段与步骤s2中切除了35s的psoy19载体相连，得psoy19-zm2载体。

为解决以上技术问题，本发明还提供了载体在增加大豆抗除草剂能力且降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的载体利用大豆绿色组织特异启动子来启动抗除草剂基因g10-epsps基因的表达，从而使抗除草剂蛋白在大豆叶片等绿色组织中表达，而在种子中低表达或者零表达，以此减轻公众对转基因大豆安全性的顾虑，提高公众对转基因大豆的接受度，同时也提高了大豆抗除草剂能力，提高了大豆的产量，本发明的应用将为培育高效抗草甘膦且种子中抗草甘膦蛋白降低的转基因农作物开辟一条更直接更有效的道路。

附图说明

图1为本发明的psoy19-zm2载体图谱；

图2为本发明的实施例的psoy19-zm2转化株系t0代g10-epsps基因的pcr鉴定结果图；

图3为本发明的实施例的psoy19-zm2转化株系t0代g10-epsps蛋白速测试纸条结果图；

图4为本发明的实施例的psoy19-zm2转化株系t1代植株的g10-epsps基因的pcr鉴定结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例首先构建了psoy19-zm2载体，psoy19-zm2载体可增加大豆抗除草剂能力且可降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量，psoy19-zm2载体可应用于增加大豆抗除草剂能力且降低大豆种子中抗除草剂蛋白含量的产品中。

本实施例首先对gmcrb1基因的起始密码子上游2171bp的启动子序列进行pcr扩增，扩增引物如下：

pgmcrb1-f：

cccgggtaccgagctcgaattctcttataataaccctgttaac，

pgmcrb1-r：

gagactggtgatgaattcgtttcgtttccacacagtgc；得扩增的pgmcrb1片段，pgmcrb1的核苷酸序列见seqidno：1，备用；用ecori和ncoi双酶切除植物表达载体psoy19载体中的35s启动子；然后将pgmcrb1片段与切除了35s启动子的psoy19载体相连，所用的连接酶为无缝组装的酶，购自于诺维赞公司，最终得psoy19-zm2载体，psoy19-zm2载体的核苷酸序列见seqidno：2。

psoy19-zm2载体图谱见附图1，psoy19-zm2载体从t-dna区域从右边界(t-border-rb)到左边界(t-border-lb)区域全长4508bp，该区域中除多克隆位点外主要由3个部分组成：1)能在植物中产生绿色组织特异表达的启动子(pgmcrb1)，来自拟南芥的信号肽ch-l，该信号肽可引导其同一表达框编码的蛋白质转运至叶绿体内(序列如前所描述)；2)来自deinococcusradioduransr1的g10-epsps耐草甘膦基因(序列如前所描述)，该基因序列与ch-l位于同一读码框；3)camv35s基因的终止子；lb和rb是t-dna的边界。psoy19-zm2载体中各种元件的名称、大小和功能等信息见下表：

psoy19-zm2载体中各种元件的信息表

为了验证psoy19-zm2载体构建成功，本实施例将psoy19-zm2载体通过冷激法转入农杆菌菌株lba4404中，用携带有psoy19-zm2载体质粒的农杆菌进行大豆威廉姆斯82的遗传转化。

将psoy19-zm2载体通过冷激法转入农杆菌lba4404中：

(1)制备农杆菌菌株lba4404感受态细胞

挑取农杆菌lba4404单菌落接种于3mlyep液体培养基中，220rpm、28℃振荡培养至od600≈0.5，吸取0.5ml菌液接种于50ml的yep培养基中，300rpm、30℃振荡培养至od600≈1.0，冰浴10min；3000g4℃离心10min，弃去上清液，加入50ml预冷的无菌10％甘油重悬沉淀，然后加入无菌10％甘油至500ml，再次3000g4℃离心10min，丢弃上清液；重复以上的洗涤步骤一次；细胞沉淀重悬于25ml预冷的无菌10％甘油，3000g4℃离心5min，弃去上清液，细胞沉淀重悬于0.5ml预冷的无菌10％甘油，使细胞中浓度为5×10¹⁰细胞/毫升，获得农杆菌感受态细胞，分装100μl/管-70℃冻存；

(2)冷激法转化农杆菌感受态细胞：在离心管中加入400ng上述psoy19-zm2载体质粒，置于冰上5分钟，液氮冷激，凝结后置于37℃水浴锅，水浴5分钟，置于冰上2分钟加入0.5mlyep液体培养基，250rpm28℃振荡培养4小时，将培养液涂在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的yep固体培养基28℃培养2天，获得携带psoy19-zm2表达载体的重组农杆菌。

准备转基因外植体：将大豆威廉姆斯82的种子用氯气消毒，具体的方法为：种子单层摆放在90mm培养皿中，向其中倒入100ml消毒液(10％漂白水中加入3.5ml12n的浓盐酸)，密闭消毒过夜；第二天在超净台中打开培养皿，吹30min除去多余氯气；转基因用的大豆外植体为子叶节，具体的准备过程如下：将灭菌后的大豆种子加入无菌去离子水，在黑暗中室温浸泡种子过夜；将吸涨后的种子从培养皿中取出，吸去表面多余水分，用解剖刀沿种脐纵向分开子叶和种皮，除去子叶节连接处的胚芽。

农杆菌激活：将上述制备的携带psoy19-zm2表达载体的重组农杆菌接种至添加有50mg/l卡那霉素 25mg/l链霉素的yep固体培养基中，28℃培养2天，然后接种在2ml含有50mg/l卡那霉素 25mg/l链霉素的yep液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养1天，从中取0.25ml接种至250ml含有50mg/l卡那霉素 25mg/l链霉素的yep液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养至od650＝0.8-1.0，将菌液室温4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，重悬于25ml×5管侵染培养基，使菌体终密度达到0.5×10⁸细胞/ml，即得农杆菌侵染液；使用前于28℃、60rpm条件下摇动农杆菌侵染液30min以上。

农杆菌侵染：在90毫米培养皿中放入约60个上述方法处理的大豆外植体，加入30ml农杆菌侵染液，使外植体完全浸没在液体中，室温放置20～30分钟并经常轻轻晃动。

农杆菌与外植体的共培养：农杆菌侵染完成后，将种子腹面向上放在无菌滤纸上吸干菌液，然后将半粒种子外植体转移到盛有共培养培养基的培养皿(培养基在培养皿中固化后，在表面覆盖一层无菌滤纸)中，腹面向下接触滤纸。用封口膜封住培养皿，在24℃、1400lux16小时光照/8小时黑暗环境培养3～5天。

芽诱导培养：共培养阶段结束后，将种子从共培养培养基中取出，放在无菌纸巾上吸干多余液体，然后放入芽诱导培养基，使子叶节进入培养基中并与表面呈30～45度角，再生区域与培养基表面平齐；外植体在24℃16小时光照/8小时黑暗环境培养14天后，在芽诱导培养基中继代一次，切除从子叶节和顶端长出的芽，将胚轴修剪至3毫米长，将新产生的伤口置于芽诱导培养基中，分生区与培养基表面平齐，继续培养14天，两周后在相同的培养基中再继代一次。

芽伸长培养和生根：将继代两次的已有幼芽形成的外植体，转移到芽伸长培养基中，每两周继代一次，每次在芽垫基部水平切一个新的平面，以利于培养基中养分的吸收；当长出的芽长度达到3厘米以上时，将它们从芽垫上切下，转移到生根培养基中，芽基部插入培养基中0.5厘米深，24℃16小时光照/8小时培养1～2周。

转基因幼苗的种植：在生根培养基中的幼芽长出2条以上根时，轻轻将幼苗从生根培养基中取出，用自来水洗去多余的培养基，移栽到小盆土中，在幼苗顶部加罩保湿，24℃16小时光照/8小时环境炼苗至少1周；当幼苗长出至少两片三出复叶时，移栽到大盆中，并放置于温室中培养，获得pgmcrb1：g10-epsps转基因大豆。

转基因过程用的各种培养基的配方如下：

yep液体培养基组成：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化钠，调整ph值至7.0，溶剂为去离子水。

yep固体培养基是在yep液体培养基中添加12g/l细菌琼脂。

b5大量元素：kno32500mg/l、mgso4·7h2o250mg/l、cacl2·2h2o150mg/l、(nh4)2so4134mg/l、nah2po4·h2o150mg/l。

b5微量元素：ki0.75mg/l、h3bo33.0mg/l、mnso4·4h2o10mg/l、znso4·7h2o2.0mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l。

ms大量元素：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、mgso4·7h2o2370mg/l、cacl2·2h2o440mg/l、kh2po4·h2o170mg/l。

ms微量元素：ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l。

b5铁盐：na乙二胺四乙酸二钠(na2-edta)37.3mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l。

b5维生素混合液：肌醇100mg/l、烟酸1.0mg/l、盐酸吡哆醇1.0mg/l、盐酸硫胺10mg/l。

侵染培养基组成：1/10b5大量元素，1/10b5微量元素，1/10b5维生素混合液，1/10b5铁盐，30g/l蔗糖，3.9g/l2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)，溶剂为去离子水，ph5.4，高压灭菌冷却后加入过滤灭菌的赤霉素(ga3，0.25mg/l)，苄氨基嘌呤(bap，1.67mg/l)，乙酰丁香酮40mg/l。

共培养培养基组成：1/10b5大量元素，1/10b5微量元素，1/10b5维生素混合液，1/10b5铁盐，30g/l蔗糖，3.9g/lmes，4.25g/l琼脂，溶剂为去离子水，ph5.4。高压灭菌后加入抽滤灭菌的ga3(0.25mg/l)，bap1.67mg/l，半胱氨酸400mg/l，二硫苏糖醇154.2mg/l，40mg/l乙酰丁香酮。

芽诱导培养基组成：1xb5大量盐，1xb5微量元素，1xb5维生素混合液，1xb5铁盐，30g/l蔗糖，0.59g/lmes，7g/l琼脂，溶剂为去离子水，ph5.7。以上成分高压灭菌冷却后加入抽滤灭菌的bap1.11mg/l，特美汀50mg/l，头孢噻肟100mg/l，草甘膦5mg/l。

芽伸长培养基的组成：1xms大量盐，1xms微量元素，1xb5维生素混合液，1xb5铁盐，30g/l蔗糖，0.59g/lmes，7g/l琼脂，溶剂为去离子水，ph5.7。高压灭菌冷却后加入抽滤灭菌的天冬酰胺50mg/l，谷氨酰胺50mg/l，生长素(iaa)100μg/l，赤霉素(ga3)500μg/l，玉米素1mg/l，特美汀50mg/l，头孢噻肟100mg/l，草甘膦5mg/l。

生根培养基的组成：1xms大量盐，1xms微量元素，1xb5维生素混合液，1xb5铁盐，30g/l蔗糖，0.59g/lmes，7g/l琼脂，溶剂为去离子水，ph5.7。高压灭菌冷却后加入天冬酰胺50mg/l，谷氨酰胺50mg/l。

接下来本实施例对获得的转基因大豆植株进行基因鉴定。

psoy19-zm2载体转基因植株鉴定，快速提取植物dna：取适量上述获得的抗性转基因大豆植株叶片(50mg)于2ml离心管中，加入200μltps提取液(100mmtris-hcl，10mmedta，1mkcl，ph＝8.0)后震荡研碎，65℃水浴20min，12000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，并室温放置10min，12000rpm离心5min，弃上清，加入1ml75％酒精洗涤沉淀，3500rpm离心5min，弃上清，室温放置10min，使酒精全部蒸发，加入30mlddh2o溶解沉淀。

pcr鉴定：取1μl上述dna溶液作为模板，g10-epsps基因特异引物g10-epsps-f(5'-tctaaggtcatcggaggcagtagct-3'、g10-epsps-r(5'-tagagcacagccatccaagaactac-3')进行pcr扩增，退火温度57℃，程序为94℃3分钟；94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，32个循环；72℃10分钟；同时将转基因的大豆威廉姆斯82基因组dna做为阴性对照，用以上基因特异引物扩增获得的目标pcr产物大小为604bp。

见附图2，附图2为大豆转化体psoy19-zm2载体转化体t0代g10-epsps的pcr检测结果，图中#2为psoy19-zm2载体转化体，#1、#3-4为其他载体株系，：正对照，-：负对照，结果表明psoy19-zm2载体转化大豆成功。

见附图4，附图4为psoy19-zm2转化株系t1代植株的pcr鉴定结果图，其中阳性株：2，：正对照，-：负对照；结果表明psoy19-zm2载体转化大豆成功。

g10-epsps基因序列如下：

gagaagggatccgacgctcttccagctaccttcgacgttatcgtgcatccagctagagaactcagaggtgaacttagagcacagccatccaagaactacaccactagatacctcctcgccgctgctctcgctgagggtgaaaccagagttgttggtgtggctacctctgaggatgccgaagctatgctcagatgcctcagagattggggtgctggtgttgagcttgttggtgatgacgccgtgatcagaggtttcggtgctagaccacaggctggtgttacccttaacccaggtaacgctgctgcggtggccagactccttatgggtgttgctgctctcacctctggtacaactttcgttaccgattaccctgattcccttggtaagagacctcagggtgaccttcttgaagccctcgaaagacttggtgcttgggtgtcctccaacgatggtagactccctatctccgtttccggtccagttagaggtggtacagtggaggtttccgccgaaagatcctcccagtacgcttccgcccttatgttcctcggtcctcttcttcctgacggactcgaacttagactcaccggtgatatcaagtcccacgctcctcttagacagacacttgacaccctctctgatttcggtgttagagctactgcctccgatgaccttagaagaatctccatccctggtggtcagaagtacagaccaggtagagtgctcgttcctggtgattaccctggttccgctgctatccttaccgccgctgctcttctcccaggtgaggttagactttctaaccttagagaacacgacctccagggtgagaaggaagctgtgaacgttcttagagagatgggtgctgatatcgttagagaaggtgatacccttaccgtgagaggtggtagacctctccacgctgttactagagatggtgattccttcaccgacgccgtgcaagctcttaccgctgctgctgccttcgctgagggtgataccacctgggaaaacgttgctactcttagactcaaggaatgcgatagaatctctgacaccagagctgagcttgaaagacttggtcttagagcaagagagaccgccgattctctctccgttactggttctgctcaccttgctggtggtatcaccgctgatggtcacggtgaccacagaatgatcatgcttctcacccttcttggtctcagagcagatgctccacttagaatcaccggtgcacaccacatcagaaagtcctaccctcagttcttcgctcaccttgaagctcttggtgctagattcgaatacgctgaggctaccgcc。

g10-epsps蛋白速测试纸条鉴定：取适量上述获得的抗性转基因大豆植株叶片(50mg)于2ml离心管中，加入200μltps提取液(100mmtris-hcl，10mmedta，1mkcl，ph＝8.0)后震荡研碎，将g10-epsps蛋白速测试纸条下端插入液面以下，同时以大豆威廉姆斯82作为阴性对照，实验室之前的转基因株系zu33作为阳性对照。5分钟后观察结果并拍照记录，结果见附图3，附图3为g10-epsps蛋白速测试纸条结果图，其中#2为psoy19-zm2转化体，#1、#3、#4为其他载体株系，：正对照，-：负对照，结果表明psoy19-zm2载体转基因植株转化成功。

编码抗除草剂蛋白g10-epsps的氨基酸序列如下：

ekgsdalpatfdvivhparelrgelraqpsknyttryllaaalaegetrvvgvatsedaeamlrclrdwgagvelvgddavirgfgarpqagvtlnpgnaaavarllmgvaaltsgttfvtdypdslgkrpqgdllealerlgawvssndgrlpisvsgpvrggtvevsaerssqyasalmflgpllpdglelrltgdikshaplrqtldtlsdfgvratasddlrrisipggqkyrpgrvlvpgdypgsaailtaaallpgevrlsnlrehdlqgekeavnvlremgadivregdtltvrggrplhavtrdgdsftdavqaltaaaafaegdttwenvatlrlkecdrisdtraelerlglraretadslsvtgsahlaggitadghgdhrmimlltllglradaplritgahhirksypqffahlealgarfeyaeata。

psoy19-zm2载体转基因植株g10-epsps蛋白含量测定，利用g10-epsps酶联免疫定量检测试剂盒(上海佑隆生物科技有限公司)测定psoy19-zm2载体转基因植株中耐除草剂蛋白含量：取0.05g叶片，放入1.5ml离心管中捣碎，加入0.5ml样品提取液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μl上清用于分析；加入样品提取液(空白对照)/标准品/样本100μl到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光反应45分钟；将孔内液体甩干，用洗涤工作液200μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；加入酶标工作液100μl/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光反应30分钟，重复洗板同上；加入显色剂100μl/孔，25℃避光反应15分钟；加入终止液100μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪450nm处，测定每孔od值，另外同时测定种子中g10-epsps蛋白含量，种子中g10-epsps蛋白的提取方法与叶片提取方法相同。

psoy19-zm2的g10-epsps蛋白定量分析结果见下表：

不同时期不同组织的g10-epsps蛋白表达量(μg/g鲜重)

数据以平均值±标准差”展示，notdetected：未检测到；na；未进行分析

从定量分析结果来看，在t0代中，启动子启动的g10-epsps均在叶子中表达较高，在种子中表达量极低。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>浙江大学

<120>psoy19-zm2载体、其制备方法及应用

<130>20201212

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2171

<212>dna

<213>pgmcrb1

<400>1

tcttataataaccctgttaacccaaaaaaccccaatttacaggttgtaatttgaaagcaa60

caaatacaagaatgcagtttaaaatgcatcaataatcataatatcctacaaaggtatagt120

ggcatctactgctttgacctggatatcgtgacccaaccacaagagttgaggcctaatatc180

gcccatcacaatgaacaatgaactctaaacacgtattgcatagaatccccatatgagaaa240

ccgatgctatcagataatttgctccgatttcaactcttgaagatgacatattatttgtat300

gttaataatataatgaattaatttatgttgggagaatggtggtaaattagagtgagcaag360

tcctcacttggagctgaaaacttcagtatctctttatttccagcaatagaccccacctta420

aaccaatattattagcaatttcagaagatatgatttcaagaccatcaacaaactaaagta480

cctatttggcatttggtaaaaccaacaatatttgcaatactgagggtcaaacaaactcca540

acaactaggaggtaatcagcttgaagccttatgagtgagaatattgccagcatagtccat600

gcaactgcctataaaagaatacacaaaaaaaattatttaccagagaccgtactttttggt660

gaggggttatacaaaatgtaagcaatggcagaacccaatgattctatgtcctacctcccc720

ctcccccctcttttgattttccgaaaaatatcatgcatattcaaaggatattaagaaaaa780

actggaatgccatcacatgctctaatgtgtaaccaatcgatgttttcttactgtaaggta840

aagcgttcaccagaaaagccatgaatctttcttgttcatccgggcgaatgactggaggaa900

aaacaaacaacatatgtaagatgcaagtaccttcatagcatttggattgcaatcttatgc960

aactcagaagagacattacaagacagagagttaataattgattatttaaaaagtaagata1020

acaacatgcaagttgcaactgagcaaaagaagcaattcacacctgctgatcaagacactc1080

aaatttccaaacactctcacccagatcattgatttaattccaccacctcaaaccaactaa1140

aattctcccactcgcattcttcactaaccaaaaatcaagagcggcaagaaggacagtcat1200

cacaaaaatgatgacaaagttatcaataaagagggcggagagaatgtaaaatgacaaagc1260

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atgaaagaagcaagtatttggattgtcatagttttcacgtacagagtacaatttgatgaa1440

ttaacaatctaaacaaagggaacaataatacgaacaaaccaacgaaatgggccatgcata1500

ttgctagcccatttttatgaggcatgtccgctttaattttttttttgacaaaaatgactt1560

tcccttaatatttttttaaaaagaaaaaaagattcattttgtgagggattttttcgtcaa1620

aagaacagacagtgcgaagagtaaaaaggaaagtatatatagcaaggcccgatttatatt1680

tttcttgatatcattatatatgggccgggcccacctataaatgtttagtctgtttttcac1740

ttaccagacccgaaagctattgtactaatgactaatttattatgatttggtcttgtcttt1800

ggtttgtgttgttcttggctaggaatctcaatcagaaaaattttcttgcataggcacaag1860

tgtttccagttacattcacgtcacatgagtagaggtgagcaatagtataagtggtggaat1920

tttatcttataaaagaatgaatggattaataaacaaaaaaaaataaaaatgaatgaatgt1980

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aaacgaaacac2171

<210>2

<211>10741

<212>dna

<213>psoy19-zm2

<400>2